传统发酵牦牛酸乳中酵母菌的分子生物学鉴定

谢 婕1,2，赵 欣3，骞 宇3，李 键4,5，陈炼红4,5，陈 娟5，索化夷1,2,*

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.西南大学 重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400715；

3.重庆第二师范学院生物与化学工程系，重庆 400067；4.西南民族大学青藏高原研究院，四川 成都 610041；

5.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041）

摘 要：通过提取羊八井地区传统发酵牦牛酸乳中分离到的36 株酵母菌的基因组DNA，经聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增其26S rDNA并测定序列，将序列输入GenBank中通过基本局部序列检索工具（Basic Local Alignment Search Tool，BLAST）检索确定种属（同源性≥99%）。结果表明：传统发酵牦牛酸乳中酵母菌主要为马克斯克鲁维酵母17 株（47.2%）、酿酒酵母6 株（16.7%）、平常假丝酵母5 株（13.9%）、喜仙人掌毕赤酵母4 株（11.1%）、发酵毕赤酵母3 株（8.3%），1 株鉴定失败。并构建系统发育进化树结合分子鉴定结果分析酵母菌的遗传多样性。

关键词：牦牛酸乳；酵母菌；基因组DNA；聚合酶链式反应；26S rDNA

Molecular Identification of Yeasts Isolated from Traditional Fermented Yak Milk

XIE Jie1,2, ZHAO Xin3, QIAN Yu3, LI Jian4,5, CHEN Lianhong4,5, CHEN Juan5, SUO Huayi1,2,*

(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center, Southwest University, Chongqing 400715, China; 3. School of Biological and Chemical Engineering, Chongqing University of Education, Chongqing 400067, China; 4. Institute of Qinghai-Tibetan Plateau, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China; 5. College of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China)

Abstract: The 36 yeast strains isolated from traditional fermented yak milk in Yangbajing area were identified by PCR amplification and sequencing of 26S rDNA from their genomic DNAs and search for homologous sequences in the GenBank database with Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (identity ≥ 99%). The results showed that there were 5 main yeast species identified in traditional fermented yak milk, including 17 Kluyveromyces marxianus strains (47.2%),
6 Saccharomyces cerevisiae strains (16.7%), 5 Candida inconspicua strains (13.9%), 4 Pichia cactophila strains (11.1%),
3 Pichia fermentans strains (8.3%), and one unsuccessfully identified strain. Furthermore, the phylogenetic tree of the
36 yeast strains based on the 26S rDNA D1/D2 domain sequences was established to analyze the genetic diversity.

Key words: yak yogurt; yeast; genomic DNA; polymerase chain reaction (PCR); 26S rDNA

中图分类号：TS201.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2015）11-0114-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201511022

牦牛在我国主要分布于青藏高原地区，是高原地区牧民主要生产生活资料，素有万能畜种之称[1]。牦牛乳本身营养价值极高，是天然的绿色产品，经乳酸菌、酵母菌等作用发酵成牦牛酸乳，使其具有多种保健功能。藏民多年来一直保留着手工制作牦牛酸乳的习俗，他们以高原新鲜牦牛乳为原料[2]，以传统发酵方法制作出口味独特的牦牛酸乳，深受藏民的喜爱。牦牛酸乳发酵过程中的酵母菌具有很高的营养价值，特别是含有较多蛋白质、VB、核酸和矿物质，同时也能产生一些具有保健功能的活性物质。然而在市售酸奶中酵母菌往往被认为是酸奶中的污染菌，引起酸奶变质。相反在一些Ⅳ型发酵乳中，如牦牛酸乳、开菲尔发酵乳，酵母菌却能够为产品带来期望的香气和风味[3-4]。吴阳[5]研究赛里木酸奶中酵母菌筛选鉴定及发酵特性，表明马克斯克鲁维酵母菌和瑞士乳杆菌可以共同在牛乳中发酵生长，并且各自产生了期望的风味物质，但需要进行更进一步的实验去证明两者的相容性。于岚等[6]在对开菲尔粒中发酵优势菌混合发酵生产开菲尔饮品的研究中发现利用酵母菌和乳酸菌混合发酵能有效提高牛奶中脂肪的降解率。谭锋等[7]从开菲尔粒中分离出两株生长发酵旺盛的酵母菌，发现乳酸菌与酵母菌的比例对发酵产品的感官风味影响最为显著，其次是加糖量。罗珍兰[8]发现酵母菌在其生长代谢、繁殖过程中，同时产生促进其他细菌生长的生长素类物质，因而在开菲尔粒中，酵母菌在促进微生物之间的共生作用以及二氧化碳的形成、提高特殊风味和香气方面起重要作用。

酵母菌种属的界定主要是依靠形态学和生理生化特性，包括根据这些表型特征而发展起来的各种商业上的酵母菌快速检测试剂盒。但某些酵母菌的种属在形态学及生理生化特性方面差异并不显著。随着分子生物学的发展，核糖体DNA序列分析[9]等分子生物学鉴定方法使用愈加普遍。本实验以分离纯化自羊八井地区传统发酵牦牛酸乳中的36 株酵母菌为材料，通过提取酵母总DNA、特定序列聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增、序列测定再至GenBank检索进行鉴定，并构建系统发育进化树分析其遗传多样性。通过分离鉴定牦牛酸乳中的酵母菌来研究其种类多样性，既有潜在的市场价值，也为研究高原地区独特自然发酵乳中的微生物区系组成、建立牦牛酸乳酵母菌菌种资源库打下基础。目前国内对牦牛酸乳中酵母菌资源的收集筛选、分类鉴定、菌种稳定性和安全性评估研究也还相对较少。因此，对藏区自然发酵牦牛酸乳中酵母菌进行收集筛选和鉴定，对我们进一步认识利用并开发出具有自主产权的牦牛酸乳发酵剂具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌种

牦牛酸乳采自西藏羊八井地区，冰盒保藏，实验室对其中的酵母菌进行分离纯化，得到36 株未知酵母，20%甘油－20 ℃条件下保存。

1.1.2 仪器与试剂

BioSpec-Mini紫外分光光度计 日本岛津公司；S1000 Thermal Cycler梯度PCR仪、Mini-Sub Cell GT Cel小型水平电泳槽 美国Bio-Rad公司；Gene Genius凝胶成像系统 英国SynGene公司；Milli-Q超纯水仪 法国Millipore公司。

YPD培养基 青岛高科园海博生物技术有限公司； Pfu DNA Polymerase（Pfu Buffer含Mg2+）dNTPs Mix酵母基因组DNA提取试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；GelRed核酸染料 美国Biotium公司；λDNA/HindⅢ Marker、100 bp DNA Ladder Marker 天根生化（北京）科技有限公司；引物NL1、NL4 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌的活化镜检

将保存好的菌株无菌条件下划线接种于YPD固体培养基恒温培养箱中26 ℃培养4 d，选取培养皿中生长完好的单菌落转移至YPD液体培养基于摇床上26 ℃、220 r/min
培养48 h，停止培养。吸取YPD液体培养的菌液离心后将沉淀进行革兰氏染色[10]、镜检。

1.2.2 酵母基因组DNA提取

取1.5 mL YPD液体培养的菌液13 000 r/min离心1 min，弃去上清收集菌体。按照酵母基因组DNA提取试剂盒说明书方法提取DNA。将提取到的基因组DNA转移至灭菌的1.5 mL EP管中，做好编号，放于－20 ℃冰柜保藏好备用。

1.2.3 电泳和基因组DNA浓度与纯度测定

1.2.3.1 电泳

将提取出的DNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶质量浓度0.8%，电压80 V，电泳80 min，GelRed核酸染料染色后，在凝胶成像系统中观察凝胶[11-12]。

1.2.3.2 浓度与纯度检测

将提取的DNA样品稀释200 倍，定容于EP管中备用。使用紫外分光光度计进行指标检测。

1.2.4 PCR扩增

酵母PCR扩增对象为酵母菌株的26S rRNA基因，PCR扩增体系见表1。

表 1 PCR反应体系[13]

Table 1 PCR reaction system composition[13]

调整好反应程序，将上述混合液稍加混匀、离心，置PCR仪上，执行扩增。扩增循环程序为：95 ℃，5 min；94 ℃，1 min，52 ℃，1 min；72 ℃，1 min，共36 个循环；72 ℃，8 min。反应结束后，所得产物用1.4%琼脂糖凝胶80 V电压电泳1 h，并作空白对照，在凝胶成像系统中检测。

1.2.5 PCR产物测序、鉴定

经1.4%的琼脂糖凝胶电泳检验后，将保存好的PCR产物送往上海生工武汉测序部进行36 株酵母菌26S rDNA的测序，将测序结果输入www.ncbi.nlm.nih.gov，利用BLAST检索GenBank数据库进行序列的同源性分析，确定其种属。

1.2.6 系统发育进化树的构建

调取GenBank数据库中收录的10 株酵母菌的相同区段基因序列，使用ClustalX1.83软件进行多序列匹配比对，通过Mega5.2软件采用Neighbor-Joining法构建酵母菌的同源序列系统进化树，采用自举分析进行置信度检测，自举数据集为1 000 次。

2 结果与分析

2.1 酵母菌活化菌株形态结构

图 1 酵母菌菌落形态

Fig.1 Yeast colony

如图1所示，菌株划线接种于YPD固体培养基培养后，有单菌落出现，菌落形态呈圆形，表面光滑湿润，颜色呈乳白色，表面凸起，边缘整齐，不透明。

图 2 酵母菌革兰氏染色结果（10×100）

Fig.2 Gram staining results of yeasts (10 × 100)

如图2所示，显微镜下细胞染色为蓝紫色，形态为圆、椭圆、卵圆等，无性繁殖方式为芽殖，一端出芽，细胞形态符合酵母菌特征。

2.2 基因组DNA提取情况分析

经凝胶成像系统的紫外灯拍照得到的基因组DNA电泳条带发现提取的DNA较为完整，且大小主要集中在21.2 kb左右（Marker为λDNA/HindⅢ），证实为酵母的基因组DNA。选取部分图片如图3所示。

7～12. 编号为7～12的菌株。

图 3 6 株酵母菌基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果

Fig.3 Agarose gel electrophoresis of genomic DNAs of 6 yeast strains

2.3 DNA浓度与纯度分析

稀释200 倍的标准DNA质量浓度为50 μg/mL，根据微型紫外分析仪结果发现有4 组DNA质量浓度高出标准1 倍以上，其余32 组DNA质量浓度均在50 μg/mL左右。

纯的DNA样品的OD260 nm/OD280 nm为1.8，若所测比值高于1.8，则可能有RNA残留；若低于1.8，则有可能蛋白质残留。36 株酵母基因组DNA的OD260 nm/OD280 nm均在1.5附近，说明该试剂盒提取方法会有蛋白质残留，但未影响后续PCR扩增。

2.4 PCR扩增产物

酵母总DNA经PCR扩增后得到的26S rDNA同样经电泳后凝胶成像拍照，如图4所示，可知扩增产生的DNA片段为单一条带，片段大小约为600 bp[14]，并且空白组无条带出现，说明未出现污染、无非特异性扩增现象。

M. 100 bp DNA Ladder；空. 空白组；1～12. 编号为1～12的菌株；25～36. 编号为25～36的菌株。

图 4 酵母菌PCR扩增产物26S rDNA琼脂糖凝胶电泳图

Fig.4 Agarose gel electrophoresis of 26S rDNA-PCR products from yeasts

2.5 测序与GenBank鉴定种属

PCR产物送由上海生工武汉测序部进行测序[15]。获得序列通过BLAST在GenBank核酸序列数据库中的检索结果见表2。

表 2 26S rDNA序列鉴定36 株酵母菌结果

Table 2 Identification of 36 yeast strains by 26S rDNA sequences

由表2可知，有3 株酵母菌与GenBank数据库中已知酵母菌的26S rDNA D1/D2区域序列具有高达100%的同源性；32 株有99%的同源性；第24株的同源性只有97%，不符合鉴定要求，鉴定无效[16]。总结其余35 株酵母菌的分子生物学鉴定结果如表3所示。

表 3 35 株酵母菌的26S rDNA序列鉴定结果

Table 3 Genus and species distribution of 35 yeast strains identified by 26S rDNA

注：共鉴定出4 个属，5 个种；1株鉴定无效。

2.6 系统发育分析结果

1.seq～23.seq、25.seq～36.seq代表编号1～23、25～36的菌株。

图 5 根据26S rDNA D1/D2区域序列生成的36 株酵母菌系统发育进化树

Fig.5 Phylogenetic tree of 36 yeast strains based on 26S rDNA D1/D2 domain sequences

由图5可知，鉴定已知的35 株酵母菌分为2 个进化枝，表明35 株酵母菌分为2 个遗传类型。马克斯克鲁维酵母（第1、4、6、8、10、13、16、18、19、20、23、25、30、31、32、33、34株）和酿酒酵母（第3、9、11、14、17、21株）处在同一分枝中，平常假丝酵母（第7、12、15、22、26株）、喜仙人掌毕赤酵母（第2、5、27、35株）和发酵毕赤酵母（第28、29、36 株）处在另一分枝，表明克鲁维酵母属与酵母属的亲缘关系很近，而毕赤酵母属与假丝酵母属的亲缘关系较近，同时因为各菌株的亲缘关系与它们在进化树中的距离呈正比，由此也可验证26S rDNA序列鉴定法的可靠性；另外第32、19、22、27株在各自进化枝内与其他菌株距离较远，表明在种内也有较高的遗传多样性。

综合看来，传统发酵牦牛酸乳中的酵母菌株有着丰富的遗传多样性，其优势菌种为马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母。高原地区温度较低，牧民家中传统发酵没有配备齐全的温控设备，而酵母菌的最适生长温度在28 ℃左右，因此牦牛酸乳的发酵条件适合酵母菌的生长。Bai Mei等[17]从青海地区和西藏地区传统发酵牦牛酸奶中发现了发酵毕赤酵母。Zhang Heping等[18]对青海地区的牦牛酸奶进行研究，发现该地区牦牛酸奶中含有较多的乳酸菌和酵母菌，其中发酵毕赤酵母的分离率达到43.2%，是青海地区牦牛酸奶中的优势菌。王远微等[19]从川西北地区采集到的10 份传统发酵牦牛酸奶样品中均分离到了马克斯克鲁维酵母菌，由此可见马克斯克鲁维酵母是牦牛酸奶中一种常见的菌株。马克斯克鲁维酵母可以发酵分解乳糖[20]，从而降低乳糖含量，产生可多种羰基化合物和挥发性脂肪酸，这些芳香物质也是牦牛酸乳具有独特风味的原因之一。从以上研究结果可以发现，牦牛酸乳中酵母菌发挥着很大的作用，但对于不同地区的牦牛酸乳，其优势菌群是不一样的，相关文献对西藏羊八井地区牦牛酸奶中酵母菌的优势菌群报道较少。牦牛酸乳与开菲尔发酵乳同属Ⅳ型发酵乳，目前对开菲尔发酵乳中的酵母菌研究较多，阳大海等[21]对开菲尔粒中优势菌进行筛选鉴定，分离出9 株酵母菌，分别为克鲁维酵母属2 株、假丝酵母属3 株和酒香酵母属4 株，对其进行生理生化实验结果表明，筛选得到的假丝酵母与克鲁维酵母均属于乳糖发酵型，酒香酵母属于乳糖非发酵型。张国亮等[22]研究开菲尔粒菌相构成，判定从开菲尔粒中分离出的7 株酵母菌中的2 株为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），另外5 株为巨大克鲁维氏酵母（Kluyveromyces marxianus）。王和平等[23]发现开菲尔粒中通常存在有酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母马克斯亚种、德氏有孢圆酵母、乳酒假丝酵母、酒香酵母等，优势菌属为酿酒酵母。李静等[24]采用传统培养和分子生物学方法分离鉴定发酵酸马奶中的酵母菌，结果表明分子生物学方法准确率高、重现性好，是一种有效的区别鉴定酵母菌的方法。

3 结 论

对采自西藏羊八井地区传统发酵牦牛酸乳中的36 株酵母菌进行鉴定，结果发现3 株酵母菌与GenBank数据库中已知酵母的26S rDNA D1/D2区域序列具有高达100%的同源性；32 株有99%的同源性；仅有1 株的同源性只有97%，鉴定无效。因此，采用26S rDNA序列分析对牦牛酸乳中酵母菌进行分子生物学鉴定，比传统的方法鉴定率高，结果更准确可靠，说明该方法对于对酵母菌株种级水平的鉴定具有很明显的优势。

鉴定出的35 株酵母菌共划分为4 个属，分别是克鲁维酵母属、酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属；5 个种，分别是马克斯克鲁维酵母（47.2%）、酿酒酵母（16.7%）、平常假丝酵母（13.9%）、喜仙人掌毕赤酵母（11.1%）、发酵毕赤酵母（8.3%）。因此，发酵牦牛酸乳中主要的酵母菌为马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母。

由系统发育进化树可以看出，35 株酵母菌共分为2 个遗传类型。克鲁维酵母属与酵母属的亲缘关系很近，而毕赤酵母属与假丝酵母属的亲缘关系较近，第32、19、22、27株菌株在其种内有较高的遗传多样性。同时由进化树的距离也可验证26S rDNA序列鉴定法的可靠性。

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