酸马乳发酵过程中乳酸菌与酵母菌生长的相互影响

王小标1，武 运1,*，王 璐2，苗 森1，邹 弯1，李振华1，李维维2

（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.新疆农业大学科学技术学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

摘 要：研究新疆酸马乳中乳酸乳球菌WLB5、干酪乳杆菌MLS5与马克思克鲁维酵母菌WWMJ1间的相互作用。结果表明：在酸马乳发酵过程中，马克思克鲁维酵母菌WWMJ1可以促进干酪乳杆菌MLS5的生长，干酪乳杆菌MLS5对马克思克鲁维酵母菌WWMJ1的生长有抑制作用，乳酸乳球菌WLB5能促进马克思克鲁维酵母菌WWMJ1的生长。乳酸乳球菌WLB5和干酪乳杆菌MLS5混合发酵有助于提高酸马乳中乳酸菌总活菌数。本研究可为酵母菌在发酵乳制品中的应用及开发新型乳制品提供一定参考。

关键词：酸马乳；乳酸菌；酵母菌；相互作用

Interaction between Lactic Acid Bacteria and Yeast during Koumiss Fermentation

WANG Xiaobiao1, WU Yun1,*, WANG Lu2, MIAO Sen1, ZOU Wan1, LI Zhenhua1, LI Weiwei2

(1. College of Food Science and Pharmaceutical Science, Xinjiang Agricultural University, Urümqi 830052, China;

2. College of Science and Technology, Xinjiang Agricultural University, Urümqi 830052, China)

Abstract: Two lactic acid bacteria (LAB) strains and one yeast strain, previously isolated from traditional fermented koumiss in Xinjiang, were inoculated into pasteurized mare’s milk in both single and co-cultures to study their growth and interactions. The LAB strains consisted of Lactobacillus casei MLS5 and Lactococcus lactis WLB5. The yeast strain used was Kluyveromyces marxianus. The results showed that the growth of Lactobacillus casei MLS5 during fermentation was significantly promoted by Kluyveromyces marxianus. K. marxianus was significantly inhibited by Lactobacillus casei MLS5, but was significantly enhanced by Lactococcus lactis WLB5. The viable LAB count of the co-culture of Lactobacillus casei MLS5 with Lactococcus lactis WLB5 in koumiss was increased when compared with that of the single cultures. The results of this study can provide useful references to apply yeasts in fermented dairy products and develop new dairy products.

Key words: koumiss; lactic acid bacteria; yeast; interaction

中图分类号：TS201.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2015）11-0125-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201511024

酸马乳，又称马奶酒、策格、艾日格，是以新鲜马乳为原料，经乳酸菌和酵母菌混合发酵而成的一种酸性、低醇马乳饮料，深受我国内蒙古、新疆等地游牧民族喜爱。马乳中营养成分与母乳较为接近，营养价值较高[1]。马乳发酵成酸马乳过程中，乳糖含量降低，B族维生素和VC含量有所增加，蛋白质和脂肪等其他营养成分基本不变，同时，在发酵过程中产生乳酸等有机酸、乙醇、芳香化合物和抗菌素等，还含有大量活性乳酸菌，因此，酸马乳具有较高的营养价值和医疗保健作用[2]。临床研究发现，酸马乳具有降血压、降血脂、调节胃肠系统和神经系统功能性紊乱、增强机体免疫力等作用，对治疗高血压、冠心病、糖尿病、肺结核、肺气肿等疾病有一定疗效[3-5]。

酸马乳中的微生物族群主要是乳酸菌和酵母菌，这些微生物间生长和代谢的相互作用不仅赋予了酸马乳独特风味和营养价值，并且与酸马乳的医疗保健作用有密切关系。目前，关于酸马乳中乳酸菌和酵母菌的相互作用有一定研究，但它们之间的作用机理尚不清楚。多数研究认为，乳酸菌与酵母菌间的相互作用主要由于混合发酵菌株间的营养竞争，或者生成的代谢产物促进或抑制彼此的生长所致。发酵微生物间的相互作用具有一定的菌株特异性，而且发酵基质、发酵条件和碳源不同，这种相互作用也可能不同[6-10]。

本研究选取新疆传统酸马乳中分离得到的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）和马克思克鲁维酵母菌（Kluyveromyces marxianus）于新鲜马乳中进行混合培养，以单菌发酵为对照，在酸马乳最优发酵条件下研究3 株菌生长间的相互作用，旨在为酵母菌在发酵乳制品中的应用和开发新型发酵马乳制品提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料、菌株与培养基

新鲜马乳购于新疆乌鲁木齐南山地区。

干酪乳杆菌MLS5、乳酸乳球菌WLB5、马克思克鲁维酵母菌WWMJ1 新疆农业大学食品科学与药学学院微生物实验室。

MRS肉汤培养基、MRS琼脂培养基、改良MC培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）培养基、孟加拉红培养基 青岛日水生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

FA2014N分析天平 北京东南仪诚实验室设备有限公司；HR40-IIA2生物安全柜 青岛海尔特种电器有限公司；YXQ-LS-18SI手提式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司；DHP-9052电热恒温培养箱、HWS-26电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；FE20KpH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种的活化

取保藏的乳酸菌和酵母菌接种于培养基中，活化2 代后备用。MRS肉汤用于乳酸菌活化，37 ℃活化24 h传代；YPD培养基用于酵母菌活化，28 ℃活化24 h传代。

1.3.2 样品制备

将活化好的乳酸菌和酵母菌按体积分数3%接种量分别接种于灭菌后的新鲜马乳中，乳酸菌的初始接种量约7.0 （lg（CFU/mL）），酵母菌的初始接种量约
6.0（lg（CFU/mL））。将接种后的马乳样品置于32 ℃条件下恒温发酵48 h，每4 h测定一次酸马乳中乳酸菌和酵母菌的活菌数，以及酸马乳的pH值，每组实验重复两次。

1.3.3 活菌计数

单菌发酵时，乳酸菌计数采用MRS琼脂培养基倾注培养，于37 ℃恒温培养2 d；酵母菌计数采用YPD琼脂培养基涂布培养，于28 ℃恒温培养2 d；混菌发酵时，乳酸菌计数采用改良MC琼脂培养基倾注培养，于37 ℃恒温培养2 d，酵母菌计数采用孟加拉红琼脂培养基涂布培养，于28 ℃恒温培养2 d[11]。

1.3.4 pH值的测定

采用FE20K pH计测定pH值。

1.4 数据分析

实验数据使用DPSv14.50软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 马克思克鲁维酵母菌对乳酸菌生长的影响

图 1 马克思克鲁维酵母菌对乳酸乳球菌生长的影响

Fig.1 Effect of Kluyveromyces marxianus on the growth of Lactococcus lactis

如图1所示，乳酸乳球菌单菌发酵时，0～12 h内乳酸乳球菌生长速率较快，12 h后进入稳定期。稳定期内，乳酸乳球菌活菌数最高可达8.43 （lg（CFU/mL）），活菌数变化较小。与单菌发酵相比，乳酸乳球菌与马克思克鲁维酵母菌混合发酵时，乳酸乳球菌活菌数最高可达8.36 （lg（CFU/mL）），低于单菌培养时的活菌数，但差异不显著（P＞0.05），说明马克思克鲁维酵母菌对乳酸乳球菌的生长无显著影响。Álvarez-Martín等[12]研究发现，马克思克鲁维酵母乳酸变种可以显著提高混合培养中乳酸乳球菌乳酸亚种的活菌数，但对乳酸乳球菌乳脂亚种活菌数无明显影响。

图 2 马克思克鲁维酵母菌对干酪乳杆菌生长的影响

Fig.2 Effect of Kluyveromyces marxianus on the growth of Lactobacillus casei

如图2所示，干酪乳杆菌单菌发酵时，0～12 h内干酪乳杆菌生长速率较快，12 h后进入稳定期。稳定期内，干酪乳杆菌活菌数最高可达8.51 （lg（CFU/mL））。与单菌发酵相比，干酪乳杆菌与马克思克鲁维酵母菌混合发酵时，干酪乳杆菌在稳定期内活菌数最高达到8.65 （lg（CFU/mL）），高于单菌发酵时的活菌数，差异显著（P＜0.05），说明马克思克鲁维酵母菌可以显著促进干酪乳杆菌的生长。可能是因为马克思克鲁维酵母菌可以为干酪乳杆菌的生长提供氨基酸、维生素、丙酮酸盐等生长因子，或者通过代谢有机酸和乳酸盐促进干酪乳杆菌的生长[9]。

2.2 乳酸菌对马克思克鲁维酵母菌生长的影响

图 3 乳酸乳球菌对马克思克鲁维酵母菌生长的影响

Fig.3 Effect of Lactococcus lactis on the growth of Kluyveromyces marxianus

如图3所示，马克思克鲁维酵母菌单菌发酵时，0～20 h内马克思克鲁维酵母菌生长速率较快，20 h后进入稳定期，马克思克鲁维酵母菌活菌数最高达
7.67 （lg（CFU/mL））。与单菌发酵相比，马克思克鲁维酵母菌与乳酸乳球菌混合发酵时，4 h后马克思克鲁维酵母菌活菌数均高于单菌发酵，稳定期内活菌数最高可达7.81 （lg（CFU/mL）），差异显著（P＜0.05），说明乳酸乳球菌可以显著促进马克思克鲁维酵母菌的生长，这与Álvarez-Martín等[12]发现乳酸乳球菌乳酸亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种均可显著促进马克思克鲁维酵母菌乳酸变种生长的研究结果一致。

图 4 干酪乳杆菌对马克思克鲁维酵母菌生长的影响

Fig.4 Effect of Lactobacillus casei on the growth of Kluyveromyces marxianus

如图4所示，与马克思克鲁维酵母菌单菌发酵相比，双菌发酵中马克思克鲁维酵母菌16 h后进入稳定期，对数期比单菌发酵缩短了4 h。而且，双菌发酵中马克思克鲁维酵母菌活菌数最高可达7.63 （lg（CFU/mL）），低于单菌发酵的7.72 （lg（CFU/mL）），差异显著
（P＜0.05），说明干酪乳杆菌可以显著抑制马克思克鲁维酵母菌的生长。可能是因为干酪乳杆菌在发酵过程中生长较快，在营养竞争上占据相对优势，或者生成苯乳酸、环肽等物质抑制马克思克鲁维酵母菌的生长[7]。

2.3 乳酸乳球菌与干酪乳杆菌生长的相互影响

图 5 干酪乳杆菌与乳酸乳球菌生长的相互影响

Fig.5 Interaction between Lactobacillus casei and Lactococcus lactis

如图5所示，在酸马乳发酵过程中，干酪乳杆菌的生长速率高于乳酸乳球菌，而且干酪乳杆菌稳定期内活菌数最高达8.58 （lg（CFU/mL）），高于乳酸乳球菌的8.43 （lg（CFU/mL）），但差异不显著（P＞0.05），说明干酪乳杆菌是酸马乳发酵过程中的优势菌。干酪乳杆菌与乳酸乳球菌混合发酵，酸马乳中总的乳酸菌活菌数分别高于两菌单菌发酵时的活菌数，说明两菌之间可能存在互为有利的互生关系，相互促进彼此的生长，提高酸马乳中乳酸菌总的活菌数，这与Nancib等[13]的研究结果不同，可能是由于乳酸菌发酵基质不同、基质中乳酸菌可利用的碳源不同等原因导致的。

2.4 三菌混合发酵对酸马乳中活菌数的影响

图 6 三菌混合发酵对酸马乳中乳酸菌生长的影响

Fig.6 Effect of co-culture of three strains on the growth of lactic acid bacteria in koumiss

如图6所示，乳酸乳球菌、干酪乳杆菌与马克思克鲁维酵母菌三菌混合发酵时，酸马乳中乳酸菌活菌数最高可达8.66 （lg（CFU/mL）），略低于两株乳酸菌混合发酵时的活菌数8.70 （lg（CFU/mL）），差异不显著
（P＞0.05）。然而，三菌混合发酵时乳酸菌活菌数分别高于乳酸乳球菌（8.43 （lg（CFU/mL））和干酪乳杆菌（8.51 （lg（CFU/mL））单菌发酵时的活菌数。

图 7 三菌混合发酵对酸马乳中马克思克鲁维酵母菌生长的影响

Fig.7 Effect of co-culture of three strains on the growth of Kluyveromyces marxianus in koumiss

如图7所示，三菌混合发酵时，酸马乳中马克思克鲁维酵母菌最高可达7.42 （lg（CFU/mL）），分别低于马克思克鲁维酵母菌单菌发酵和双菌发酵时的活菌数7.68、7.81、7.63 （lg（CFU/mL）），差异均显著
（P＜0.05）。说明三菌发酵时，马克思克鲁维酵母菌受到了显著的抑制。可能是因为在酸马乳发酵过程中，两株乳酸菌生长速率较快，加剧了与马克思克鲁维酵母菌间的营养竞争，或者三菌混合发酵促进乳酸菌产生更多的抑制马克思克鲁维酵母菌生长的物质。

2.5 乳酸菌与酵母菌混合发酵对酸马乳pH值的影响

图 8 乳酸乳球菌与马克思克鲁维酵母菌混合发酵酸马乳pH值的变化

Fig.8 Effect of co-culture of Lactococcus lactis with Kluyveromyces marxianus on pH

图 9 干酪乳杆菌与马克思克鲁维酵母菌混合发酵酸马乳pH值的变化

Fig.9 Effect of co-culture of Lactobacillus casei with Kluyveromyces marxianus on pH

如图8、9所示，乳酸乳球菌单菌发酵时，在对数期末期酸马乳pH值降低至5.32，进入稳定期后，由于各种酶继续起作用，酸马乳pH值继续下降，发酵48 h时降至4.56。干酪乳杆菌单菌发酵时，在对数期末期酸马乳pH值降低至5.29，发酵48 h时降至4.16。马克思克鲁维酵母菌单菌发酵时，在对数生长末期酸马乳pH值降低至5.89，发酵48 h时分别降至5.68（图8）和5.53（图9）。原因可能是马克思克鲁维酵母菌是乳糖发酵型酵母，能发酵马乳中的乳糖，或者由于马克思克鲁维酵母可以水解乳蛋白和脂肪，生成酸性代谢产物，降低马乳pH值[14]。然而，马克思克鲁维酵母菌与两株乳酸菌混合发酵时可以缓和马乳pH值的下降，发酵48 h时酸马乳pH值分别降至5.04（图8）和4.36（图9）。Roostita等[6]的研究表明，马克思克鲁维酵母可以部分利用柠檬酸、甲酸和琥珀酸，从而减缓酸马乳pH值的下降。

图 10 乳酸乳球菌与干酪乳杆菌间混合发酵酸马乳pH值的变化

Fig.10 Effect of co-culture of Lactococcus lactis with Lactobacillus casei on pH

图 11 三菌混合发酵时酸马乳pH值的变化

Fig.11 Effect of co-culture of three strains on pH

如图10、11所示，乳酸乳球菌与干酪乳杆菌混合发酵时，产酸速率分别高于乳酸乳球菌和干酪乳杆菌单菌发酵时的产酸速率，混合发酵48 h后，酸马乳pH值降低至4.01。Nancib等[13]研究发现干酪乳杆菌与乳酸乳球菌混合发酵可将乳酸产量由单菌发酵的53 g/L和46 g/L提高至60.3 g/L。三菌混合发酵时，酸马乳pH值下降有所减缓，发酵48 h时酸马乳pH值为4.30，与双菌发酵时马克思克鲁维酵母菌对酸马乳pH值影响一致。

3 讨 论

本实验研究了酸马乳发酵过程中干酪乳杆菌、乳酸乳球菌和马克思克鲁维酵母菌生长间的相互作用。在酸马乳发酵过程中，与单菌发酵相比，马克思克鲁维酵母菌对乳酸乳球菌的生长有轻微抑制作用，但影响不显著。可能是由于马克思克鲁维酵母菌可以分泌脂肪酶，分解乳脂肪生成游离脂肪酸抑制了乳酸乳球菌的生长[15]。然而，马克思克鲁维酵母菌可以显著促进干酪乳杆菌的生长。研究认为，酵母菌可以为乳酸菌提供丙酮酸盐、氨基酸和维生素等必需营养因子，促进乳酸菌的生长[9]。Lukondeh等[16]发现，马克思克鲁维酵母菌发酵液中含有蛋白质、氨基酸、低聚糖、低聚核苷酸、维生素等多种有机化合物。Stadie等[17]研究发现，乳杆菌与酵母菌间的营养共生在于乳杆菌可以利用酵母菌释放的氨基酸和维生素。

在单菌发酵过程中，马克思克鲁维酵母菌的活菌数从初始接种量约6.0 （lg（CFU/mL））增长至7.67～7.72 （lg（CFU/mL）），可能是由于马克思克鲁维酵母菌能分泌β-半乳糖苷酶，利用乳糖作为碳源[18]。乳酸乳球菌可以促进马克思克鲁维酵母菌的生长，可能是由于乳酸乳球菌发酵乳糖生成半乳糖和葡萄糖，同时生成乳酸等酸性物质，为马克思克鲁维酵母菌生长提供碳源和适宜的酸性环境。研究表明，一些乳杆菌和乳球菌菌株只能代谢乳糖的葡萄糖部分，而不能代谢半乳糖部分，半乳糖释放到培养基中[19]。Su Dun等[20]研究发现，乳酸菌与酵母菌混合发酵时，葡萄糖和半乳糖完全被消耗，乳糖含量显著降低，说明酵母菌能利用乳酸菌产生的半乳糖促进自身生长。然而，在酸马乳发酵过程中，干酪乳杆菌会抑制马克思克鲁维酵母菌的生长。这可能是由于干酪乳杆菌代谢产生苯乳酸、4-羟基苯乳酸和环肽抑制了马克思克鲁维酵母菌的生长。有学者将干酪乳杆菌应用于酸奶保鲜，发现干酪乳杆菌对酵母菌的生长有一定的抑制效果[21-22]。李红娟[23]发现干酪乳杆菌AST18的抑菌活性与高浓度乳酸和小分子化合物如环二肽、2,6-二苯基哌啶、吡嗪类物质相关，与苯乳酸产量没有相关关系。武运等[24]发现干酪乳杆菌MLS5产生的抑菌物质可能是蛋白质类细菌素。

4 结 论

在酸马乳发酵过程中，马克思克鲁维酵母菌WWMJ1对干酪乳杆菌MLS5的生长有显著的促进作用，但对乳酸乳球菌WLB5的生长无显著影响。乳酸乳球菌WLB5能显著促进马克思克鲁维酵母菌WWMJ1的生长，而干酪乳杆菌MLS5对其生长有一定的抑制作用。乳酸乳球菌WLB5和干酪乳杆菌MLS5间存在相互促进生长的作用。

单菌发酵时，乳酸乳球菌WLB5、干酪乳杆菌MLS5和马克思克鲁维酵母菌WWMJ1均能降低酸马乳的pH值；然而，混菌发酵时马克思克鲁维酵母菌WWMJ1可以延缓酸马乳pH值的下降，降低乳酸等酸性代谢物质对乳酸菌生长的抑制作用。综上所述，乳酸乳球菌WLB5、干酪乳杆菌MLS5和马克思克鲁维酵母菌WWMJ1间存在相互作用，要明确3株菌之间的相互作用机理，还需对酸马乳发酵过程中乳糖代谢和有机酸等代谢产物进行进一步研究。

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