西藏牧区自然发酵牦牛酸奶的乳酸菌菌种筛选及工艺优化

廖钰婷1，吴 均1，龙 谋1，杜木英1,2,3,*，阚建全1,2,3

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400715；

3.农业部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（重庆），重庆 400715）

摘 要：采用从西藏、川西青藏高原牧区自然发酵牦牛酸奶中筛选出的发酵性能优良的4 株乳酸菌（LP1、LP2、LP3、LP4）进行组合发酵试验，经过纸片法筛选出优势发酵组合，以及其发酵牦牛酸奶的凝乳时间、滴定酸度、感官评价可以得出（LP1和LP2）组合为本试验的最佳发酵菌种组合。因此选用此菌种组合发酵牦牛酸奶，经过
L16（44）正交试验得出牦牛酸奶发酵的最佳工艺条件为：发酵温度42 ℃、接种量6%、加糖量4 g/100 mL、菌种LP1与LP2浓度比为2∶1，此条件下发酵的牦牛酸奶凝固均匀，组织结构光滑细腻，无乳清析出，具有浓郁的酸奶风味。

关键词：牦牛酸奶；乳酸菌；组合发酵；工艺优化

Screening of Dominant Lactic Acid Bacteria from Naturally Fermented Yak Milk in Tibetan Pastoral Areas and Optimization of Fermentation Conditions for Yak Yogurt Production

LIAO Yuting1, WU Jun1, LONG Mou1, DU Muying1,2,3,*, KAN Jianquan1,2,3

(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China;

2. Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center, Chongqing 400715, China;

3. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro-products on Storage and Preservation (Chongqing),

Ministry of Agriculture, Chongqing 400715, China)

Abstract: Four Lactobacillus strains (LP1, LP2, LP3, and LP4) with excellent fermentation performance isolated from homemade yak yogurt samples collected in Tibetan plateau pastoral areas were used in combination to ferment yak yogurt. Using the disc diffusion method, the combination of LP1 and LP2 was screened as the best culture starter for the production of yak yogurt in terms of coagulation time, titratable acidity and sensory evaluation. The optimum fermentation parameters for yak yogurt were obtained through an orthogonal array design L16 (44) as follows: fermentation temperature, 42 ℃; inoculum amount, 6%; sugar concentration, 4 g/100 mL; and LP1 to LP2 ratio, 2:1. Under these conditions, the fermented yak milk revealed even solidification, delicate and smooth texture, no whey separation and rich yogurt flavor.

Key words: yak yogurt; Lactobacillus; mixed-culture fermentation; process optimization

中图分类号：TS252.4 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2015）11-0140-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201511027

我国青藏高原地区具有大量优质的牦牛乳，但除了少量鲜乳被直接饮用外，其余大部分用于制作成日常食用的奶茶、酥油茶、奶油、奶饼、传统发酵牦牛酸奶和一些地区独特的食物等[1-2]，特别是发酵乳制品，牧民们在制作方面有着较为丰富的经验和知识，形成了独具地域特色的传统工艺，其制作和食用已有几千年的历史[3]。牦牛奶中含有人体所需的8 种必需氨基酸及丰富的维生素[4-5]、微量元素[6]、乳铁蛋白、溶菌酶及过氧化物酶[7]等，而且牦牛乳汁中神奇活性因子——共轭亚油酸（conjugated linoleic acid，CLA）含量也较普通牛奶高[3]，经乳酸菌发酵成牦牛酸乳，相比普通酸牛乳，牦牛酸乳含有更高的功能性脂肪酸和蛋白质[8]。传统工艺制作的乳制品不仅含有丰富的乳酸菌，且很好地保存了其生物学多样性，制成的发酵乳制品组织细腻、风味独特、口感纯正，富含乳酸、乙酸、不饱和脂肪酸、低分子脂肪酸、VC和B族维生素、氨基酸、共轭亚油酸[9]等物质，具有良好的医疗保健功能、美容功效和浓郁的地域特色和风味，说明该地区传统发牦牛酸乳中具有传代性好、活力高、后酸化能力好、产黏性强、抗逆性强、凝乳状态好、风味独特的优良乳酸菌菌群[10-13]。随着地区交流日益频繁，牦牛乳走出牧区，逐渐被牧区以外的人们所喜爱，但由于资源和地域优势，国内主要生产和加工牦牛乳的企业都分布在我国牦牛资源最多的几大省区，如西藏、青海、甘肃、四川、云南[14]，并且目前牦牛乳资源未得到合理的开发利用[15]，而牦牛酸奶的工业化生产也比较薄弱，尚未有一个明确的菌种组合发酵工艺，为了满足广大消费者的需求以及生产加工出品质更高的牦牛酸奶[16]，需要对传统的牦牛酸奶发酵工艺进行优化。

本实验选用从西藏、川西青藏高原牧区自然发酵牦牛酸乳中筛选出的发酵性能优良的4 株乳酸菌（LP1、LP2、LP3、LP4）为实验菌株，进行组合筛选试验和牦牛酸奶发酵工艺优化试验，以期提高牦牛酸奶的品质并且为其工业化提供最佳的发酵工艺。

1 材料与方法

1.1 菌种与试剂

菌种：LP1、LP2、LP3、LP4，从青藏高原牧区自然发酵牦牛酸乳中分离得到。

牦牛奶粉 西藏高原之宝牦牛乳业股份有限公司；蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、琼脂（生化试剂） 北京奥博星生物技术有限公司；葡萄糖、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、MnSO4、柠檬酸二铵、无水乙酸钠、酚酞、氢氧化钠、乙醇（分析纯） 成都科龙化工试剂厂；盐酸（分析纯） 重庆科试化学有限公司。

1.2 仪器与设备

DL-1型可控温电炉 北京中兴伟业仪器有限公司；HPX-9052MBE电热恒温培养箱、YXQ-SG46-280S压力蒸汽灭菌锅 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；
SW-CJ-1FD型洁净工作台 中日合资苏州安泰空气技术有限公司；GL-88B涡旋混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；HB031金属恒温加热器 上海博彩生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 指标测定

1.3.1.1 凝乳时间[17]

将活化好的菌株按一定的比例接种到牦牛乳中，在适当的温度下发酵至凝乳，记录凝乳时间。

1.3.1.2 滴定酸度

根据GB/T 5413.34—2010《乳和乳制品酸度的测定》方法进行测定。

1.3.1.3 感官评定方法[18-20]

将凝固后的发酵乳置于4 ℃冷藏24 h后，从经过严格感官评定培训的师生中挑选出10 名对牦牛酸奶的色泽、气味和滋味、组织状态进行感官评价，评定标准如表1所示。

表 1 发酵乳感官评价标准

Table 1 Criteria for sensory evaluation of fermented milk

注：感官评价分值取整数。

1.3.2 组合发酵实验[21-22]

生产酸奶所使用的发酵菌株大多数为混合菌株，混合菌株混合发酵酸奶时具有的协同效应。选取具有优良发酵性能的4 株乳酸菌进行组合菌种筛选，挑选出具有协同作用的最佳组合。

1.3.2.1 菌株间的拮抗实验

采用纸片法，将活化好的待测乳酸菌制成菌悬液，把灭菌纸片（d=8 mm）浸于备用乳酸菌上清液中10 min。往直径为90 mm灭菌平皿中注入20 mL MRS固体琼脂培养基，平铺均匀，待冷却凝固后取200 μL待测乳酸菌菌悬液涂布于培养基表面，用无菌镊子等距离贴放4 张灭菌纸片。37 ℃培养24 h，若在纸片周围出现明显的抑菌圈，则表明有抑菌活性，即两株乳酸菌之间具有拮抗作用，反之则无，挑选出无拮抗作用的乳酸菌菌株。

1.3.2.2 菌株优势组合发酵筛选实验

选择无拮抗作用的乳酸菌菌株，按菌种浓度1∶1的比例，5%的接种量接种到灭菌牦牛乳中，40 ℃发酵至凝乳后放入冰箱4 ℃冷藏24 h后进行感官评价，选出评分最高的组合。

1.3.3 牦牛酸奶发酵工艺条件优化[17,23-24]

1.3.3.1 牦牛酸奶生产工艺流程[25]

牦牛奶粉→过滤及均质→杀菌→冷却→接种→适温发酵→冷却→后熟（4 ℃）→冷藏

1.3.3.2 牦牛酸奶发酵温度的单因素试验

按1.3.3.1节的发酵工艺，添加4 g/100 mL的白砂糖，用筛选出的组合菌株，以5%的接种量接种发酵，分别在36、38、40、42、44、46 ℃的温度条件下发酵至凝固，记录时间，冷藏后熟后取样测定滴定酸度，感官评价其风味效果，选择适宜的发酵温度水平。

1.3.3.3 牦牛酸奶发酵接种量的单因素试验

按1.3.3.1节的发酵工艺，添加4 g/100 mL的白砂糖，用筛选出的组合菌株，分别以2%、3%、4%、5%、6%、7%的菌种量接种，40 ℃发酵至凝固，记录时间，冷藏后熟后取样测定滴定酸度，感官评价其风味效果，选择适宜的接种量水平。

1.3.3.4 牦牛酸奶发酵加糖量的单因素试验

按1.3.3.1节的发酵工艺，分别添加2、3、4、5、6、7 g/100 mL的白砂糖，用筛选出的组合菌株，以5%的接种量接种，40 ℃发酵至凝固，记录时间，在冷藏后熟后取样测定滴定酸度，感官评价其风味效果，选择适宜的加糖量水平。

1.3.3.5 牦牛酸奶发酵菌种配比的单因素试验

按1.3.2.1节的发酵工艺，添加4 g/100 mL的白砂糖，将菌种分别以1∶1、1∶2、3∶2、2∶3、2∶1、3∶1的配比，以5%的接种量接种发酵，40 ℃发酵至凝固，记录时间，在冷藏后熟后取样测定滴定酸度，感官评价其风味效果，选择适宜的菌种配比水平。

1.3.3.6 牦牛酸奶发酵条件的正交试验

为了优化牦牛酸奶的发酵工艺，根据加糖量、接种量、发酵温度、菌种浓度比单因素试验确定的最佳水平，选取四因素四水平的正交试验，通过感官评分分析，确定最佳工艺参数。

2 结果与分析

2.1 组合发酵实验结果

2.1.1 菌株间的拮抗实验结果

表 2 乳酸菌之间的拮抗实验结果

Table 2 Antagonistic interactions among four Lactobacillus isolates

注：/. 同种菌株未做实验；－. 无抑制；＋. 微弱抑制；＋＋. 抑制。

利用纸片法对4 株乳酸菌之间协同的关系进行研究，实验出现了3 种结果：无抑制、微弱抑制、抑制[24]，结果见表2。菌株LP1与LP2和LP3间均无抑制效果，与LP4有抑制效果；菌株LP2与LP4无抑制效果但与LP3有微弱抑制作用；菌株LP3与LP4有微弱抑制作用。由此可以得出在6 对组合中，仅有3 对菌株间存在共生作用，因此，在最终确定优势组合发酵筛选时，只需研究3 种组合，分别为：Ⅰ（LP1和LP2）、Ⅱ（LP1和LP3）、
Ⅲ（LP2和LP4）。

2.1.2 菌株优势组合发酵筛选结果

将以上3 种组合进行发酵并在同等条件下与单菌株发酵进行比较，并进行感官评价，选择组合发酵性能的最优组合，结果见表3。

表 3 菌种组合发酵实验结果

Table 3 Fermentation performance of mixed LAB strains for
yogurt production

由表3可知，组合发酵凝乳时间缩短；组合发酵的酸度比单一菌株发酵的酸度有所增加；感官评分上，酸乳的风味、滋味和气味以及组织状态等均非常好。因此，综合以上指标及分析，可以得出Ⅰ组为本实验的最佳发酵菌种组合，主要表现在凝乳时间较短，后熟后的酸度高，满足优良酸乳制品的条件，且贮存过程中酸度变化小，增强了酸乳品质的稳定性。

2.2 牦牛酸奶发酵工艺条件的单因素试验

2.2.1 发酵温度的影响

接种5%的组合Ⅰ（LP1与LP2浓度比1∶1）于添加了4 g/100 mL白砂糖的牦牛乳中，分别在36、38、40、42、44、46 ℃的温度条件下发酵，冷藏后熟后取样测定滴定酸度，进行感官评价，结果见表4。

表 4 不同发酵温度对牦牛酸奶的影响

Table 4 Effects of different fermentation temperatures on yak yogurt

由表4可知，不同温度条件下发酵的牦牛酸奶的凝乳时间、滴定酸度及其感官评分有一定差异，随着温度的上升，凝乳时间先缩短后增长，酸度逐渐增大，感官评分先增大后减小。当发酵温度为36 ℃时，牦牛酸奶的凝乳时间最长，乳清析出较多，感官评分较低；当发酵温度为46 ℃时，牦牛酸奶的凝乳时间最长，酸度最大，乳清析出多，感官评分较低；当发酵温度为42 ℃时牦牛酸奶的感官评分最高，凝乳时间最短，口感滋味组织状态最佳，发酵温度为38、40、42、44 ℃时，牦牛酸奶外观光滑，口感较好，酸乳气味浓郁，因此选取38、40、42、44 ℃进行正交试验。

2.2.2 接种量的影响

分别接种2%、3%、4%、5%、6%、7%的组合Ⅰ（LP1与LP2浓度比1∶1）于添加了4 g/100 mL白砂糖的牦牛乳中，在40 ℃条件下发酵，冷藏后熟后取样测定滴定酸度，进行感官评价，结果见表5。

表 5 不同发酵接种量对牦牛酸奶的影响

Table 5 Effects of different inoculum amounts on yak yogurt

由表5可知，不同接种量发酵的牦牛酸奶的凝乳时间、酸度及其感官评分有一定差异，随着接种量的增加，凝乳时间逐渐缩短，酸度逐渐增大，感官评分先增大后减小。当接种量为2%时，牦牛酸奶的凝乳时间最长，酸度最低，感官评分最低；当接种量为7%时，牦牛酸奶的滋味气味不好，乳清析出较多，感官评分较低；当接种量为5%时，牦牛酸奶的感官评分最高，凝乳时间最短，口感滋味组织状态最佳，接种量为3%、4%、5%、6%时，牦牛酸奶外观光滑，口感较好，酸乳气味浓郁，因此选取3%、4%、5%、6%的接种量进行正交试验。

2.2.3 加糖量的影响

接种5%的组合Ⅰ（LP1与LP2浓度比1∶1）于分别添加了2、3、4、5、6、7 g/100 mL的白砂糖的牦牛乳中，在40 ℃条件下发酵，冷藏后熟后取样测定滴定酸度，进行感官评价，结果见表6。

表 6 不同加糖量对牦牛酸奶的影响

Table 6 Effects of different sucrose concentrations on yak yogurt

由表6可知，不同加糖量发酵的牦牛酸奶的凝乳时间、酸度及其感官评分有一定差异，随着加糖量的增加，凝乳时间逐渐增大，酸度逐渐减小，感官评分先增大后减小。当加糖量为2 g/100 mL时，牦牛酸奶的酸度较高，感官评分较差；当加糖量为7 g/100 mL时，牦牛酸奶的凝乳时间最长，酸度最低，感官评分较差；当加糖量为4 g/100 mL时，牦牛酸奶的感官评分最高，凝乳时间最短，口感滋味组织状态最佳，加糖量为3、4、5、6 g/100 mL时，牦牛酸奶的外观光滑，口感较好，酸乳气味浓郁，因此选取3、4、5、6 g/100 mL的加糖量进行正交试验。

2.2.4 菌种浓度比的影响

组合Ⅰ（LP1和LP2）按1∶1、1∶2、3∶2、2∶3、2∶1、3∶1的比例接种5%于添加了4 g/100 mL白砂糖的牦牛乳中，在40 ℃条件下发酵至凝固，记录时间，冷藏后熟后取样测定滴定酸度，进行感官评价，结果见表7。

表 7 不同菌种浓度比对牦牛酸奶的影响

Table 7 Effects of different LP1 to LP2 ratios on yak yogurt

由表7可知，不同菌种比发酵的牦牛酸奶的凝乳时间、酸度及其感官评分有一定差异。当菌种浓度比为1∶2和2∶3时牦牛酸奶的凝乳时间较长，酸度较低，感官评分较低；当菌种浓度比为3∶1时，牦牛酸奶的感官评分最高，凝乳时间最短，口感滋味组织状态最佳，菌种浓度比为1∶1、3∶1、2∶1、3∶2时，牦牛酸奶外观光滑，口感较好，酸乳气味浓郁，因此选取1∶1、3∶1、2∶1、3∶2的菌种比进行正交试验。

2.2.5 牦牛酸奶发酵条件的正交试验

表 8 牦牛酸奶发酵工艺的L16（44）正交试验

Table 8 Orthogonal array design L16 (44)with experimental values of titritable acidity and sensory score

表 9 牦牛酸奶发酵工艺正交试验方差分析

Table 9 Analysis of variance of titritable acidity and sensory score

在单因素试验的基础上，选取加糖量、接种量、发酵温度、菌种浓度比4 个因素，每个变量设定4 个水平，进行四因素四水平的正交试验，以产品的滴定酸度和感官评分为评价指标，确定最佳工艺参数。正交试验结果及分析分别见表8、9。由表9可知，影响产品滴定酸度和感官评分的主要因素影响次序均为：D（菌种浓度比）＞B（接种量）＞A（发酵温度）＞C（加糖量），通过分析可知最优组合为A3B4C2D2，即选择发酵温度为42 ℃、接种量为6%、加糖量为4 g/100 mL、菌种浓度比为2∶1。此条件下发酵的牦牛酸奶凝固均匀，组织结构光滑细腻，无乳清析出，具有浓郁的酸奶风味。

2.2.6 验证实验

按A3B4C2D2条件进行3 次平行实验，牦牛酸奶的滴定酸度平均值为108.32 °T，感官评分平均值为98，高于表8
中每一项试验结果，故A3B4C2D2为牦牛酸奶的最佳发酵工艺条件。

3 结 论

本实验采用从西藏、川西青藏高原牧区自然发酵牦牛酸乳中筛选出的发酵性能优良的4 株乳酸杆菌（LP1、LP2、LP3、LP4）进行组合发酵实验，利用纸片法对这4 株菌之间协同的关系进行研究，确定出优势发酵组合分别为：Ⅰ（LP1和LP2）、Ⅱ（LP1和LP3）、Ⅲ（LP2和LP4）。通过分析优势组合发酵牦牛酸奶的凝乳时间、酸度、色泽、滋味和气味、组织状态可以得出Ⅰ组为本实验的最佳发酵菌种组合。采用组合Ⅰ发酵牦牛酸奶，经过正交试验得出牦牛酸奶发酵的最佳工艺条件为：发酵温度为42 ℃、接种量为6%、加糖量为4 g/100 mL、菌种LP1与LP2浓度比为2∶1。

因本实验只对组合发酵的协同关系进行了研究，因此还需进一步研究两株乳酸菌各自在牦牛酸奶发酵过程中发挥的作用。

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