噬菌体展示技术在食源性致病菌检测中的应用

胡雨欣,何 早,陈力力,刘 霞*

(湖南农业大学食品科学技术学院,食品科学与生物技术湖南省重点实验室,湖南 长沙 410128)

 

摘 要:噬菌体展示技术是20世纪80年代逐步建立并发展起来的一种分子生物学新技术,目前用于构建展示文库的噬菌体主要有丝状噬菌体、λ噬菌体、T4噬菌体和T7噬菌体。该技术在筛选噬菌体、单链抗体及多肽以建立食品安全检测体系方面,具有广阔的应用前景。本文在介绍噬菌体展示技术系统的基础上,对该技术在食源性致病菌检测中的应用进行综述。

关键词:噬菌体展示技术;食品致病菌;检测

 

Phage Display Technology and Its Application in Detection of Foodborne Pathogens: a Review

 

HU Yuxin, HE Zao, CHEN Lili, LIU Xia*

(Hunan Province Key Laboratory of Food Science and Biotechnology, College of Food Science and Technology,

Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

 

Abstract: Phage display technology is a new molecular biological technology, which was gradually established and developed since the 1980s. Currently there are mainly four types of phages used in the construction of phage display libraries, including filamentous phage, λ phage, T4 and T7 phage. This technology has extensive applications in screening specific phages, single-chain antibodies and peptides and establishing food safety detection system. In this article, the system of phage display technology is described, and its application in the detection of foodborne pathogens is summarized.

Key words: phage display technique; foodborne pathogens; detection

中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2015)11-0236-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201511044

噬菌体(bacteriophage)是一系列具有感染原核细胞以完成自身复制的病毒。噬菌体存在着各种各样的形态及遗传结构,因此其在分子遗传学中起着历史性的关键作用。大多数的噬菌体的寄主范围是非常有限的,通常只感染单一种类的细菌[1]。将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到编码噬菌体衣壳蛋白的基因组中并表达,使目的多肽片段与噬菌体衣壳蛋白形成融合蛋白,同时外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面,称之为噬菌体展示(phage display),由Smith[2]于1985年发现。该项技术已被广泛应用于生命科学的各个领域,随着沙门氏菌、大肠杆菌等食源性致病菌的污染造成的食品安全事件的发生,该项技术也应用于食源性致病菌的检测当中,目前还处于起始阶段。

1 概 述

1.1 噬菌体展示技术的原理

噬菌体展示技术是一种基因表达筛选技术,在此过程中噬菌体的衣壳蛋白只是发挥对展示肽段的锚定作用,而对其结构没有影响;同时,外源多肽的表达不干扰噬菌体感染和扩增的能力,从而达到特异性分子在同一噬菌体颗粒内基因型与表型的统一[3]。这一革命性的技术,是自20世纪初噬菌体发现以来最大的革命之一[4]。

1994年McCarrey等[5]最先构建了噬菌体多肽和抗体展示文库。噬菌体展示文库(phage display library)是将展示不同特异性抗体片段的一大群重组噬菌体集合在一起,库中的每个肽是可以复制的,当噬菌体与靶分子经过一段时间的孵育后,洗脱未结合的游离噬菌体,用竞争受体或酸将与靶分子结合吸附的噬菌体洗脱下来,然后对其进一步的扩增,再投入下一轮的淘选。经过3~5 轮的“吸附-洗脱-扩增”后,获得高度富集的与靶分子特异性结合的噬菌体。

1.2 噬菌体展示系统的类型

目前,用于构建噬菌体展示系统的载体主要有丝状噬菌体[2]、λ噬菌体[6]、T4噬菌体[7]和T7噬菌体[8],各系统各具有优缺点。

1.2.1 丝状噬菌体展示系统

丝状噬菌体是一个能够感染革兰氏阴性菌的细菌病毒大家族,具有约为6.5 nm的固定直径[9],其含有一个环状的单链DNA基因组,被包裹于含有几个拷贝的主要衣壳蛋白和一些位于顶端的次要衣壳蛋白所组成的有少许柔韧性的管状衣壳中。与其他的细菌病毒不同,丝状噬菌体在所感染的宿主细菌中的生成和释放都不会破坏细胞或使细胞裂解。大多数丝状噬菌体的信息来源于感染大肠杆菌的噬菌体:f1/M13/fd[2],以及较少范围的IKE。单链丝状噬菌体展示系统又分为pⅢ展示系统和pⅧ及其他展示系统。

1.2.1.1 pⅢ展示系统

丝状噬菌体是单链DNA病毒,pⅢ是它的次要外壳蛋白,位于噬菌体的最尾端,是噬菌体感染大肠杆菌所必须的。pⅢ展示系统的最突出特点是对外源多肽或蛋白的大小无严格限制,较长的多肽甚至整个蛋白质都可整合到基因外壳蛋白中[10]。pⅢ蛋白在结构上可分为N1、N2和CT 3 个功能区域,这3 个结构域由两段长长的柔性连接区域所分隔,连接区域具有一段富含甘氨酸的连接肽G1和G2[11]。其中,N1为穿膜区,作用于大肠杆菌细胞膜上的TolA蛋白,与噬菌体的入侵有关;N2为受体结合区,负责结合大肠杆菌的性菌毛;而CT构成噬菌体外壳蛋白结构的一部分,并将整个pⅢ蛋白的C端结构域锚定于噬菌体的一端[12-13]。

1.2.1.2 pⅧ及其他展示系统

pⅧ是丝状噬菌体的主要外壳蛋白,位于噬菌体外侧,C端与DNA结合,N端伸出噬菌体外,每个病毒颗粒约有2 700 个pⅧ拷贝,含有pⅧ的融合蛋白能够提供多价展示,从而根据亲和力进行目的基因的筛选[14]。pⅧ作为目的蛋白的载体,与pⅢ最显著的差异在于衣壳蛋白不同的展示效价:在每个噬菌体表面与pⅢ融合展示的多肽最多可达到5 个,而pⅧ则支持数百甚至数千多肽的表达[3]。

1.2.2 λ噬菌体展示系统

λ噬菌体为20 面体噬菌体,结构高度对称。其衣壳直径约为60 nm,壳厚4 nm;可容纳48.5 kb基因组[15-16]。λ噬菌体的外壳主要由两种蛋白质构成:gpE和gpD[17]。gpD是λ噬菌体头部组装必需的蛋白质,也称装饰蛋白。gpE蛋白则负责切割DNA以及形成最初的噬菌体头部[11]。在成熟的噬菌体头部,其gpD蛋白包含有405~420 个拷贝,当插入完整的野生型基因时,头部组装蛋白gpD附着于衣壳外侧,将噬菌体头部固定[18-19]。当噬菌体基因组小于野生型基因组的82%时,它可以在缺少gpD的情况下完成组装[20],故gpD可作为外源序列融合的载体,这种展示一般为N端展示。

1.2.3 T4噬菌体展示系统

T4噬菌体是所有噬菌体成员中结构校大的,而且遗传结构复杂[21],基因组DNA为双链线形,呈环状排列。T4噬菌体衣壳由3 种必需衣壳蛋白组成,主要衣壳蛋白gp23和2 个次要衣壳蛋白gp24、gp20,衣壳的外表面包裹着两种非必需蛋白:SOC(small outer capsidprotein)和HOC(highlyantigenic outer capsidprotein),二者相距7 nm,以对称的形式分布于噬菌体20 面体表面。将外源多肽或蛋白分别与T4噬菌体SOC位点的C末端和HOC位点的N末端融合而展示于T4噬菌体的表面[7,22]。

1.2.4 T7噬菌体展示系统

T7噬菌体基因组为线性双链DNA,头部为20 面体,其衣壳蛋白通常有两种形式,即10A(344 个氨基酸)和10B(397 个氨基酸),正常T7噬菌体的头部中10A与10B蛋白的比例是91[23],位于噬菌体表面的是10B衣壳蛋白[24]。T7噬菌体展示系统是通过C端融合表达蛋白,插入片段被克隆到T7噬菌体载体基因10的C端,C端的空间位阻不大[25],即使插入片段内含有终止密码子,也可以被其表达和展示。

2 噬菌体展示技术在食源性致病菌检测中的应用

食源性致病菌是指可以引起食物中毒或以食品为传播媒介的致病性细菌。致病菌直接或间接污染食品及水源,人或畜禽感染后导致传染性疾病的发生及食物中毒。食源性致病菌主要有致病性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、霍乱弧菌、炭疽杆菌、结核杆菌、布氏杆菌等。检测对象包括细菌菌群的形态及细菌本身、细菌的DNA及其代谢物等[26]。目前针对食源性致病菌的检测方法主要有传统分离培养法[27]、分子生物学检测技术[28]、免疫学方法[29]以及生物传感器[30]的方法。其中免疫学方法和生物传感器由于其特异性强,操作简便而得到迅速发展,但这些方法中一般均需要使用抗体,而抗体的获得主要是通过细胞杂交瘤技术,需耗费大量的时间和财力,抗体售价昂贵、且容易失活。噬菌体展示技术的出现为致病菌抗体的制备提供了新的途径。利用噬菌体展示技术不仅可以制备对致病菌具有特异性结合的噬菌体和单克隆或多克隆抗体,而且可以以单克隆抗体或者单链抗体片段(single chain antibody fragment,scFv)为靶分子筛选致病菌的抗原模拟表位[31]。

2.1 筛选噬菌体作为检测致病菌的探针

由于抗体具有价格昂贵、合成过程复杂、容易失活等不足,大量的研究已表明可以用噬菌体作为致病菌的诊断探针。早在20世纪80年代初期,Hirsh等[32]就用Felix-O1噬菌体作为探针检测牛奶中的沙门氏菌。他们将Felix-O1噬菌体与沙门氏菌共同培养后获得与沙门氏菌特异性结合的噬菌体,并用于样品中沙门氏菌的检测,在样品采集后的8~24 h内可获得检测结果;Bennett等[33]在1997年用该噬菌体作为生物吸附探针从食物中分离出肠炎沙门氏菌,并用于食品中的肠炎沙门氏菌的定量检测。2005年Sorokulova等[34]以鼠伤寒沙门氏菌为靶分子,从Landscape噬菌体展示库f8/8中,对5 轮筛选后的单个噬菌体进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增和DNA测序,获得有效噬菌体序列:VTPPTQHQ,经酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunnosorbent assay,ELISA)验证该噬菌体对鼠伤寒沙门氏菌有高亲和力和特异性,证实了Landscape噬菌体可以作为分离、诊断和检测鼠伤寒沙门氏菌的有效探针。

2.2 筛选抗体作为检测致病菌的探针

相比传统的抗体制备技术,采用噬菌体展示技术获得抗体可以避免繁琐的操作,大大节约时间和成本,2007年Nanduri等[35]从构建好的Griffin.1文库[36]中分离噬菌体Lm P4:A8展示的scFv抗体,用于表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)传感器检测单核细胞增生李斯特菌的主要毒力因子——肌动蛋白聚集蛋白(ActA),检测下限为2×106 CFU/mL。同时通过传感器获得了scFv抗体与ActA的解离常数(Kd)。2010年Singh等[37]利用金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)抗原进行生物淘选,得到抗
SEB-scFv抗体;用SPR技术检测抗原抗体亲和力,并将抗SEB-scFv抗体用于金黄色葡萄球菌食物中毒肠毒素B的血清学检测,结果表明二者具有高特异性且与其他金黄色葡萄球菌毒素无免疫学交叉反应。2011年Meyer等[38]以鼠伤寒沙门氏菌的外膜蛋白D(outer membrane protein D,OmpD)为抗原,利用噬菌体展示技术从人类抗体基因库HAL7中分离重组抗体片段,经ELISA验证能够应用于检测猪血清中鼠伤寒沙门氏菌的OmpD。Meyer等[39]次年用Hyperphage展示库,筛选出鼠伤寒沙门氏菌的新型免疫蛋白并成功生产出抗体片段,对猪血清中的沙门氏菌检测具有应用前景。

2.3 筛选多肽作为检测致病菌的探针

呈现在噬菌体表面的特异性多肽片段可以提取出来,用于目标物的检测。Karoonuthaisiri[40]和Morton[41]等从随机十二肽库中筛选出与8 种沙门混合菌具有特异性的多肽,并由磁分离技术验证该多肽作为抗体替代物的可行性;同时,基于筛选得到的噬菌体多肽采用SPR检测沙门氏菌,结果表明该方法具有很高的特异性和准确性。噬菌体展示技术筛选的多肽或者抗体可以在几周的时间内完成,且无需标记,因此该方法将为食品致病菌的快速检测提供新的思路。Morton等[42]从噬菌体展示肽库中淘选出单核细胞增生李斯特菌的多肽,将单核细胞增生李斯特菌从其他李斯特菌的混合物中分离出来。解决单核细胞增生李斯特菌缺少独特的抗原表位的检测难点,获得高特异性的多肽,为食品中单核细胞增生李斯特菌的检测提供新的方法。屈玮等[43]使用NEB公司的噬菌体展示七肽库试剂盒,对淘选过程中吐温的添加量、噬菌体肽库与阪崎杆菌的结合时间、洗脱时间等条件进行优化,筛选可特异性结合阪崎杆菌的多肽。对噬菌体克隆的DNA进行测序,结果表明,阪崎肠杆菌的特异结合多肽序列为QNDGTPR,并用ELISA鉴定出一个与阪崎肠杆菌特异结合的阳性单克隆E2,结果表明E2具有良好的特异性。证明该多肽具有成为阪崎肠杆菌检测探针的潜力,可用于阪崎肠杆菌的快速检测。

3 结 语

噬菌体展示技术应用于食品安全检测,尤其是在筛选特异性的噬菌体、抗体、多肽等时,筛选容量大,克服杂交瘤方法周期长、复杂的缺点,并且可以大大降低检测的成本,节省人力物力。但由于噬菌体展示技术可能存在外源性多肽的重叠、肽库容量的限制性等不足之处,因此,噬菌体展示技术还有待进一步完善。

目前,噬菌体展示技术真正用于食源性致病菌的检测并不是很多,但是它已经被广泛地应用于新型疫苗的研制[44]、医学诊断[45]、多肽药物研制[46]、抗肿瘤[47]等领域,并且已有不少文献报道以阳性单克隆或多克隆抗体为靶分子,从噬菌体肽库中筛选出抗原模拟表位,用作诊断试剂直接诊断疾病[48]或是生产疫苗[49],这些也可以用于食源性致病菌的检测。因此,在食品安全检测领域快速、灵敏、高效的发展趋势下,相信该技术将来能够更广泛地应用于食源性致病菌的检测。

参考文献:

[1] Nicastro J, Sheldon K, Slavcev R A. Bacteriophage lambda display systems: developments and applications[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2014, 98(7): 2853-2866.

[2] SMITH G P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface[J]. Science, 1985, 228: 1315-1317.

[3] 罗扬拓, 朱承睿, 武元, 等. 噬菌体展示技术发展[J]. 现代生物医学进展, 2011, 11(12): 2389-2390.

[4] Duckworth D H. “Who discovered bacteriophage?”[J]. Bacteriological Reviews, 1976, 40(4): 79-81.

[5] McCarrey J R, Williams S A. Construction of cDNA libraries from limiting amounts of material[J]. Current Opinion in Biotechnology, 1994, 5(1): 34-39.

[6] Maruyama I N, Maruyama H I, Brenner S. Lambda foo: a lambda phage vector for the expression of foreign proteins[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1994, 91(17): 8273-8277.

[7] Ren Z, Black L W. Phage T4 SOC and HOC display of biologically active, full-length proteins on the viral capsid[J]. Gene, 1998, 215(2): 439-444.

[8] Rosenberg A, Griffin K, Studier F W, et al. T7 select phage display system: a powerful new protein display system based on bacteriophage T7[J]. Innovations, 1996, 6: 1-6.

[9] Specthrie L, Bullitt E, Horiuchi K, et al. Construction of a microphage variant of filamentous bacteriophage[J]. Journal of Molecular Biology, 1992, 228(3): 720-724.

[10] Clackson T, Wells J A. in vitro selection from protein and peptide libraries[J]. Trends in Biotechnology, 1994, 12(5): 173-184.

[11] Rakonjac J, Feng J, Model P. Filamentous phage are released from the bacterial membrane by a two-step mechanism involving a short C-terminal fragment of pIII[J]. Journal of Molecular Biology, 1999, 289(5): 1253-1265.

[12] Riechmann L, Holliger P. The C-terminal domain of TolA is the coreceptor for filamentous phage infection of E. coli[J]. Cell, 1997, 90(2): 351-360.

[13] Lubkowski J, Hennecke F, PlÜckthunA, et al. The structural basis of phage display elucidated by the crystal structure of the N-terminal domains of g3p[J]. Nature Structural & Molecular Biology, 1998, 5(2): 140-147.

[14] Ma Anzhou, Hu Qing, Bai Zhihui, et al. Functional display of fungal cellulases from Trichoderma reesei on phage M13[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2008, 24(10): 2003-2009.

[15] Hohn T, Katsura I. Structure and assembly of bacteriophage lambda[J]. Current Topics in Microbiology and Immunology, 1977, 78: 69-110.

[16] Witkiewicz H, Schweiger M. The head protein D of bacterial virus lambda is related to eukaryotic chromosomal proteins[J]. The EMBO Journal, 1982, 1(12): 1559-1664.

[17] Yang F, Forrer P, Dauter Z, et al. Novel fold and capsid-binding properties of the λ-phage display platform protein gpD[J]. Nature Structural & Molecular Biology, 2000, 7(3): 230-237.

[18] Lankes H A, Zanghi C N, Santos K, et al. in vivo gene delivery and expression by bacteriophage lambda vectors[J]. Journal of Applied Microbiology, 2007, 102(5): 1337-1349.

[19] Gi Mikawa Y, Maruyama I N, Brenner S. Surface display of proteins on bacteriophage λ heads[J]. Journal of Molecular Biology, 1996, 262(1): 21-30.

[20] Sternberg N, Weisberg R. Packaging of coliphage lambda DNA: Ⅱ. The role of the gene D protein[J]. Journal of Molecular Biology, 1977, 117(3): 733-759.

[21] 刘洁珠. T4噬菌体展示系统研究进展[J]. 科技致富向导, 2008(22): 97.

[22] Sun S, Kondabagil K, Draper B, et al. The structure of the phage T4 DNA packaging motor suggests a mechanism dependent on electrostatic forces[J]. Cell, 2008, 135(7): 1251-1262.

[23] Condron B G, Atkins J F, Gesteland R F. Frameshifting in gene 10 of bacteriophage T7[J]. Journal of Bacteriology, 1991, 173(21): 6998-7003.

[24] Dai M, Temirov J, Pesavento E, et al. Using T7 phage display to select GFP-based binders[J]. Protein Engineering Design and Selection, 2008, 21(7): 413-424.

[25] 孟繁梅, 张朝辉, 艾云灿. 噬菌体展示技术系统发展进展[J]. 遗传, 2011, 33(10): 1113-1120.

[26] 鞠慧萍, 宋白薇, 石建华, 等. PCR技术在常见食源性致病菌检测中的研究进展[J]. 上海畜牧兽医通讯, 2010(3): 12-13.

[27] 中华人民共和国卫生部. GB 4789.4—2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验[S]. 北京: 中国标准出版社, 2010.

[28] OGrady J, Ruttledge M, Sedano-Balbás S, et al. Rapid detection of Listeria monocytogenes in food using culture enrichment combined with real-time PCR[J]. Food Microbiology, 2009, 26(1): 4-7.

[29] 周明东. 食源性致病菌快速检测方法的建立及其试剂盒的研制与应用[D]. 泰安: 山东农业大学, 2012.

[30] Spain E, Kojima R, KANER R B, et al. High sensitivity DNA detection using gold nanoparticle functionalized polyaniline nanofibres[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2011, 26(5): 2613-2618.

[31] 张扬, 焦新安. 利用噬菌体展示肽库筛选和鉴定沙门氏菌O9抗原的模拟表位[J]. 中国人兽共患病杂志, 2003, 19(1): 60-63.

[32] Hirsh D C, Martin L D. Rapid detection of Salmonella spp. by using Felix-O1 bacteriophage and high-performance liquid chromatography[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1983, 45(1): 260-264.

[33] Bennett A R, Davids F G C, Vlahodimou S, et al. The use of bacteriophage-based systems for the separation and concentration of Salmonella[J]. Journal of Applied Microbiology, 1997, 83(2): 259-265.

[34] Sorokulova I B, Olsen E V, Chen I, et al. Landscape phage probes for Salmonella Typhimurium[J]. Journal of Microbiological Methods, 2005, 63(1): 55-72.

[35] Nanduri V, Bhunia A K, Tu S I, et al. SPR biosensor for the detection of L. monocytogenes using phage-displayed antibody[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2007, 23(2): 248-252.

[36] Griffiths A D, Williams S C, Hartley O, et al. Isolation of high affinity human antibodies directly from large synthetic repertoires[J]. The EMBO Journal, 1994, 13(14): 3245-3260.

[37] Singh P K, Agrawal R, Kamboj D V, et al. Construction of a single-chain variable-fragment antibody against the superantigen staphylococcal enterotoxin B[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2010, 76(24): 8184-8191.

[38] Meyer T, Stratmann-Selke J, Meens J, et al. Isolation of scFv fragments specific to OmpD of Salmonella Typhimurium[J]. Veterinary Microbiology, 2011, 147(1): 162-169.

[39] Meyer T, Schirrmann T, Frenzel A, et al. Identification of immunogenic proteins and generation of antibodies against Salmonella Typhimurium using phage display[J]. BMC Biotechnology, 2012, 12: 29. doi:10.1186/1472-6750-12-29.

[40] Karoonuthaisiri N, Charlermroj R, Morton M J, et al. Development of a M13 bacteriophage-based SPR detection using Salmonella as a case study[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2014, 190: 214-220.

[41] Morton J, Karoonuthaisiri N, Stewart L D, et al. Production and evaluation of the utility of novel phage display-derived peptide ligands to Salmonella spp. for magnetic separation[J]. Journal of Applied Microbiology, 2013, 115(1): 271-281.

[42] Morton J, Karoonuthaisiri N, Charlermroj R, et al. Phage display-derived binders able to distinguish Listeria monocytogenes from other Listeria species[J]. PLoS One, 2013, 8(9): e74312. doi: 10.1371/journal.pone.0074312.

[43] 屈玮, 袁静静, 朱威东, 等. 噬菌体展示技术筛选可特异结合阪崎肠杆菌的多肽[J]. 食品科学, 2013, 34(21): 217-220. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201321044.

[44] Sarkis PT, Han T, Pudney J, et al. Anti-gp120 minibody gene transfer to female genital epithelial cells protects against HIV-1 virus challenge in vitro[J]. PLoS One, 2011, 6(10): e26473. doi: 10.1371/journal.pone.0026473.

[45] KHURANA S, SASONA P, FOX A, et al. H5N1-Serodetect EIA and rapid test: a noval differential diagnostic assay for serodiagnosis of H5N1 infections and surveillance[J]. Journal of Virology, 2011, 85(23): 12455-12463.

[46] 李婧炜. 噬菌体展示技术筛选脑靶向功能肽及其修饰纳米粒的脑内递药研究[D]. 上海: 复旦大学, 2012.

[47] 邬亭亭, 刘平, 罗永艾. 噬菌体在癌症治疗研究中的应用[J]. 世界科技研究与发展, 2012, 34(3): 482-484.

[48] Tang S S, Tan W S, Devi S, et al. Mimotopes of the Vi antigen of Salmonella enterica serovar typhi identified from phage display peptide library[J]. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, 2003, 10(6): 1078-1084.

[49] 许达, 李春玲, 李淼, 等. 噬菌体展示技术筛选副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5的抗原表位[J]. 中国兽医学报, 2013, 33(12): 1818-1821.

 

收稿日期:2014-07-03

基金项目:公益性行业(农业)科研专项(201303084)

作者简介:胡雨欣(1990—),女,硕士,研究方向为食品安全与控制。E-mail:627649521@qq.com

*通信作者:刘霞(1976—),女,副教授,博士,研究方向为食品分析,食品营养与安全。E-mail:liuxiaspr@gmail.com