乳杆菌属天然质粒研究进展

孙大庆1,2，李洪飞1，宋大巍1，杨 健1,3，张东杰1,3，许晓曦2,*

（1.黑龙江八一农垦大学 国家杂粮工程技术研究中心，黑龙江 大庆 163319；2.东北农业大学食品学院，

黑龙江 哈尔滨 150030；3.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319）

摘 要：天然质粒在乳杆菌属多个菌种中已被发现，它们携带了许多重要生理功能和胁迫因子抗性基因，对乳杆菌遗传、代谢、进化等生物学研究具有重要意义。本文概述乳杆菌属天然质粒的生物学特征、分布和主要功能，重点对乳杆菌属天然质粒的复制类型与调控机制的研究进展进行综述，最后对乳杆菌质粒的未来研究方向进行探讨，希望可以为相关研究人员提供有益的参考与借鉴。

关键词：乳杆菌属；质粒；复制；调控；反义RNA

Progress in Research on Natural Plasmids in Lactobacillus

SUN Daqing1,2, LI Hongfei1, SONG Dawei1, YANG Jian1,3, ZHANG Dongjie1,3, XU Xiaoxi2,*

(1. National Coarse Cereals Engineering Research Center, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China;

2. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 3. College of Food Science,
Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China)

Abstract: Natural plasmids inhabiting some species of Lactobacillus carry many important genes with biological functions and resistance to stress factors, and are significant for genetic, metabolic and evolutional studies of Lactobacillus. In this review, biological properties, distribution and functions of natural plasmids from Lactobacillus are summarized. The recent progress in research on replication types and regulatory mechanisms of plasmids from Lactobacillus is discussed, and future research directions are also proposed. We hope that this paper can provide useful information and references for relevant researchers.

Key words: Lactobacillus; plasmid; replication; regulation; antisense RNA

中图分类号：Q939.97 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2015）11-0251-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201511047

乳杆菌是乳酸菌中一个非常重要的属，它们广泛地分布于植物根部和体表、青贮饲料、动物口腔、阴道和胃肠道、发酵食品（乳制品、肉制品、面团、酒、饮料、蔬菜）等多种自然环境，与人类饮食和健康息息相关[1-4]，是现代食品、医药、农业等行业中具有重要经济价值的益生菌。现已证明，乳杆菌属多数菌种富含天然质粒，它们在大小、结构、构象、拷贝数和复制调控等方面具有丰富的多样性[5-7]。这些质粒在满足自身复制、遗传和进化需求的同时，也赋予了乳杆菌广泛的生理特性和更强的环境适应能力，从而使乳杆菌和内生质粒在复杂多变的生存环境和选择压力下更好地共生、遗传和进化[6]。

乳杆菌质粒发现和研究起步较早[8]，但长期以来，人们对乳杆菌质粒的研究始终关注不足。与芽孢杆菌属和葡萄球菌属以及乳酸菌中肠球菌属、乳球菌属和链球菌属质粒研究比较，人们对乳杆菌属质粒复制、遗传、进化、功能等多方面了解仍相当有限，这在乳杆菌质粒以往的综述性文献中可见一斑[5-7]。然而，这种情况在近些年已经发生了转变。我们统计发现，目前美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的RefSeq数据库中乳杆菌质粒基因组数据正快速增加，至今已收录23 个种、165 个乳杆菌质粒完整基因组序列，已超过肠球菌属（109 个）、乳球菌属（87 个）和链球菌属（49 个），成为乳酸菌中测序质粒数量最多的属；2000年以后有关乳杆菌质粒的研究报道数量超过以前所有报道，占总数57.9%（317/547）。这些数据表明，乳杆菌质粒研究在近些年取得了快速的发展，使我们对乳杆菌质粒生物学特征有了更多、更深刻的了解。为此，我们在本文中对乳杆菌天然质粒基本特征、分布、复制和功能进行比较全面的综述，希望可为乳杆菌质粒相关的研究者提供一些有益的信息。

1 乳杆菌质粒基本特征

一般而言，乳杆菌质粒大小一般在1～100 kb之间，少数巨型质粒可达100 kb以上[6]。2007年，Li Yongtao等[9]研究发现，被检的33 株唾液乳杆菌普遍含有巨型质粒，其他47 种、91 株乳杆菌中发现6 种、7 株存在巨型质粒，这些巨型质粒大小在120～490 kb之间。这表明乳杆菌属中唾液乳杆菌可能普遍含有巨型质粒，其他乳杆菌种虽然也有巨型质粒，但并不常见。乳杆菌质粒DNA分子通常是双链、闭合、环状，但偶尔也有双链、线性质粒发现于乳杆菌的报道，如植物乳杆菌pC30il[10]、罗伊乳杆菌pGT232[11]、德氏乳杆菌pLBB1[12]、干酪乳杆菌pW56[13]和唾液乳杆菌pLS51A、pLS51B、pLS51C、pLS51D[14]。乳杆菌质粒G＋C含量相对稳定，通常在30%～45%之间，接近于乳杆菌染色体基因组G＋C含量[15]。

2 乳杆菌质粒的分布

自1976年Chassy等[8]在干酪乳杆菌中第一次发现质粒以来，至今从不同环境分离的乳杆菌中含有天然质粒的报道已有很多。从这些报道中可以清晰地知道，乳杆菌属是一个多样性丰富的天然质粒库，许多乳杆菌菌种含有一个或更多天然质粒，目前发现，含有质粒较多的菌种有短乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌和瑞士乳杆菌，含有质粒最多的菌种是植物乳杆菌，Ruiz-Barba等[16]报道在植物乳杆菌PLC25中发现多达16 个天然质粒共存。然而，并不是所有乳杆菌都含有天然质粒，德氏乳杆菌似乎只在很少的菌株中存在天然质粒[17]。此外，乳杆菌中一些稀有菌种质粒分布情况的研究还很少见，显然对这些菌种质粒的研究更有利于全面的认知乳杆菌属天然质粒[18]。需要额外说明的是，在质粒研究早期，检测质粒的方法多采用浮力密度梯度离心法[8]，该方法设备要求高，检测效率低。现在普遍使用的琼脂糖凝胶电泳法，虽然可以一次性检测多个质粒，但被检质粒大小限制于60 kb以内，更大的质粒多掩蔽于基因组DNA中[6]。近年，脉冲凝胶电泳法已经可以检测102～104 kb范围大小的DNA[8]。因此以往研究检测到的质粒数量可能远被低估。

3 乳杆菌质粒的复制与调控

质粒是细胞中能够自主复制的DNA分子，如果不考虑质粒大小，每个质粒都可以看作一个复制子。复制子几乎是所有质粒上唯一且必备的遗传单元，它决定着质粒的复制、分配、拷贝数、宿主范围和不相容性等基本遗传特性，因此复制子是研究质粒遗传特征的核心区域。

3.1 质粒的复制类型

乳杆菌天然质粒复制存在2 种基本复制类型：滚环（rolling-circle，RC）复制和theta（简称θ）复制。以往研究发现，乳杆菌大部分天然质粒属于RC型复制质粒，θ型复制质粒数量较少，且质粒尺寸较大[6-7]。目前，乳杆菌RC型复制质粒已开展了较为广泛的研究，并且由于这些质粒的宽宿主性质而得到了较为广泛的应用[7]，但乳杆菌中θ型天然质粒的相关研究仍很匮乏。以往研究表明，RC型质粒复制过程中一个鲜明的特征是产生单链DNA中间体[19-20]，这一性质造成RC型质粒及其衍生载体在复制过程中容易发生重组和损伤，进而引起结构和遗传稳定性降低。相反，θ型质粒在复制过程中不会产生单链DNA中间体，因此具有良好的结构稳定性和遗传稳定性，并且在大基因片段插入时，仍能保持良好的稳定性[21]，更适合用于基因工程载体的构建。此外，以往研究认为，乳杆菌θ型复制质粒多为大型质粒，且宿主范围很窄[22]，而近年研究发现，乳杆菌θ型复制质粒也可以较小[23-24]，并且可以同时在不同种、不同属，甚至不同科的菌种中复制[25]。这表明，与RC型质粒相比，乳杆菌属θ型质粒不但具备更好的结构和遗传稳定性，而且同样可以构建小型宽宿主载体。

3.2 质粒复制调控机制

以往研究发现，虽然质粒的复制调控机制在不同复制类型、不同拷贝数、不同宿主菌和不同环境中表现出一定的多样性、复杂性和差异性，但随着越来越多质粒复制子DNA序列的解析，与质粒自身DNA相关的调控结构和编码的调节蛋白已被发现，并显示了一定程度的普遍性和同源性。目前质粒中发现存在两种主要的复制调控机制和模型，即重复子（iteron）介导的Iteron/Rep调控模型和反义RNA（antisense RNA，asRNA）介导的
Cop-asRNA-Rep调控模型[26]。重复子介导的调控机制发生在质粒复制的起始阶段，并且普遍存在于含有rep和ori的质粒。asRNA介导的调控机制被认为在质粒复制起始后扮演着更加精细的调节作用，决定着质粒拷贝数的高低，并维持质粒拷贝数的稳定。目前该机制已发现4 种调控模型：转录衰减、翻译抑制、抑制引物成熟和抑制假结形成。4 种调控模型的调控元件组成不同，例如有的质粒缺少Cop蛋白，有的质粒缺少Rep蛋白；4 种调控模型的asRNA的大小、结构也各不相同。因此asRNA介导的调控机制模型很可能具有丰富的多样性[27-31]。

目前，在NCBI的RefSeq数据库可以检索到165 个乳杆菌质粒完整基因组。统计发现大多数乳杆菌质粒含有rep基因，这表明重复子介导的复制起始调控机制可能在乳杆菌质粒中同样普遍存在，而在少数不含rep基因的质粒中可能存在新的复制起始调控机制。在一些报道中也存在着这样的推测。例如嗜酸乳杆菌质粒pRKC30SC1[32]和植物乳杆菌质粒pG6303[33]、p256[34]、pLP9000[35]。这些质粒上的开放阅读框架（open reading frame，ORF）编码的蛋白与已知Rep蛋白没有相似性，因此这些质粒可能不含有Rep蛋白，也可能含有一种未知的Rep蛋白。还有一些质粒含有1 个以上具有活性的Rep蛋白，如植物乳杆菌质粒pMRI5.2[36]。这个质粒含有2 个Rep蛋白，1 个Rep蛋白与希氏乳杆菌质粒pLAB1000的Rep蛋白具有98%一致性，另一个Rep蛋白与乳球菌质粒pWVO1的Rep蛋白相似，而pLAB1000和pWVO1分属于pC194和pMV158两个不同的质粒家族，因此作者认为质粒pMRI5.2可能起源于两个不同质粒。显然，当1 个质粒不含有Rep蛋白或含有1 个以上Rep蛋白时，重复子介导的调控机制在这些质粒复制起始过程中很可能发挥着不一样的调控机制，而新调控机制是如何进行的仍需要进一步的研究。

至今，在已测序乳杆菌质粒中已发现多个质粒含有推定的asRNA和/或调节蛋白基因，其中既有RC型质粒[37-39]，也有θ型质粒[40-41]。然而在这些质粒中，只有戊糖乳杆菌质粒p353-2编码的asRNA经实验证实对质粒rep mRNA具有转录衰减作用，进而负调控质粒的复制[39]，而所有其他质粒编码的asRNA和/或调节蛋白是否具有生理功能，以及它们具体的调控方式目前仍是未知的。因此，至今关于乳杆菌质粒asRNA介导的复制调控机制的研究很少，含有asRNA和/或调节蛋白基因的乳杆菌质粒普遍缺乏进一步的功能验证和调控模型的研究。

4 乳杆菌质粒的功能

质粒功能取决于质粒除了编码复制和维持系统必需基因外是否编码了与表型有关的功能基因。虽然以往发现的乳杆菌质粒多数是功能未知的隐蔽性质粒，但随着DNA测序技术的飞速发展，已经有越来越多的乳杆菌质粒基因组被测序和注释，人们发现乳杆菌质粒既可以不编码任何功能基因（例如小的隐蔽性质粒pLB925A01[42]），也可以编码种类繁多的功能基因（例如巨型质粒pMP118[9]）。目前，在乳杆菌质粒上发现的众多功能基因中，人们研究较多的主要有4 类：蛋白酶基因[42-43]；糖、氨基酸和柠檬酸代谢基因[44-45]；细菌素、胞外多糖和色素合成基因[43-44,46]；抗生素、重金属、噬菌体等胁迫因子抗性基因[47-49]。正是这些功能使乳杆菌在复杂环境和选择压力下，显示了更强的生存优势和更好的抗环境胁迫能力，因此深入研究质粒携带的这些功能基因对今后乳杆菌科学、理性的应用具有十分重要意义。

实际上，自从脉冲凝胶电泳发现了巨型质粒和小染色体以来，质粒和染色体之间的区别变得模糊不清，它们编码的功能基因对宿主表型的区别也越来越有限。目前在乳杆菌中已有4 个超过100 kb大小的质粒基因组完成了测序，它们分别是马乳酒样乳杆菌pWW1（194 kb）[50]和唾液乳杆菌pMP118（242 kb）[9]、pHN3（242 kb）[51]和pLS51A（143 kb）[14]。研究最清楚的巨型质粒pMP118中既有质粒独有的复制起始蛋白和质粒分配基因，又有染色体中常见的糖代谢、氨基酸代谢、限制性内切酶、甲基化酶、拓扑异构酶基因，并且repE和groEL基因系统发生分析显示巨型质粒与染色体具有相似的进化途径[9]。这表明，乳杆菌巨型质粒与染色体相似，可以携带多样性丰富的功能基因，这改变了以往乳杆菌质粒多为隐蔽性小质粒的结论[5-7]，为乳杆菌质粒及质粒功能研究提供了更广阔的空间和可能性。

5 结 语

近年来，随着高通量DNA测序技术的迅猛发展，基因组测序变得越来越便捷，这促使微生物学研究迅速进入了后基因组时代，乳杆菌及其质粒研究也迎来了新一轮的研究热潮。目前乳杆菌属共发现202 个种、29 个亚种（数据来自http://www.bacterio.net/lactobacillus.html），其中有71 个种、110 个菌株完成了染色体基因组测序（数据来自NCBI的Genome数据库），同时有23 个种、165 个质粒基因组也完成了测序（数据来自NCBI的RefSeq数据库）。虽然乳杆菌已成为乳酸菌中测序质粒最多的属，但测序质粒的乳杆菌种的数量仅占乳杆菌种总数量的11.38%（23/202），且测序质粒主要集中于常见的植物乳杆菌、短乳杆菌等6 个种，这表明乳杆菌属质粒资源仍有很大的挖掘空间，因此今后需要更加注重乳杆菌稀有菌种质粒分布情况的研究，进而可以更加全面、系统地认知乳杆菌属质粒生物学特征。

前文已经提到，目前人们对乳杆菌质粒的复制调控机制进行的研究非常有限，对具体的调控过程知之甚少。实际上包括复制调控机制，人们对于乳杆菌质粒的分配、宿主范围、不相容性、进化等基本遗传特征都不甚了解，大部分机制问题都停留在DNA序列同源性的推测上，十分缺乏基于实验的机理研究。相反，基于乳杆菌质粒功能进行的应用性研究开展较多，并在载体构建[7]、载体疫苗[52]等方面取得了可喜的进展。因此，今后乳杆菌质粒研究需要更加注重质粒遗传机制的基础性研究，因为只有质粒的复制、遗传与进化机制清晰了，质粒功能及其应用才能发挥更大的效益，更好地为人类饮食和健康造福。

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