植物性食品原料中异黄酮形成机理及
富集的影响因素

焦彩凤，杨润强，顾振新*

（南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095）

摘 要：异黄酮属酚类物质，是苯丙烷类的次生代谢产物，大多存在于豆科植物中，对人体具有广泛生理调节功能。本文综述植物性食品原料中异黄酮形成的机理，以及基于环境诱导和基因改造层面调控异黄酮合成途径中的关键酶编码基因表达，最终诱导异黄酮积累的技术。

关键词：异黄酮；形成机理；富集；影响因素

Formation Mechanism and Factors Influencing Accumulation of Isoflavones in Edible Plants

JIAO Caifeng, YANG Runqiang, GU Zhenxin*

(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Abstract: Isoflavones, as phenolic components, are the secondary metabolites found mostly in legumes with many health-promoting functions on humans. The latest research on the formation mechanism of isoflavones and accumulation techniques based on environmental induction and genetic modification in edible plants is summarized in this paper.

Key words: isoflavones; formation mechanism; accumulation; influencing factors

中图分类号：TS202.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2015）11-0256-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201511048

异黄酮是植物次生代谢产物，对人体具有多种生理和药理活性。研究表明异黄酮可与雌激素受体结合，在动物和人体内通过与在下丘脑、脑下垂体，肺、胸腺等组织中表达的雌激素受体（estrogen receptor，ERβ）结合，产生类雌激素作用[1]。流行病学调查显示，富含异黄酮的饮食能够预防癌症，尤其是性激素依赖性的乳腺癌、前列腺癌和肺癌等[2]。异黄酮还有调节免疫系统、防治过敏症与结肠炎等免疫紊乱疾病的功能[3]。口服异黄酮制剂能改善绝经后女性血管内皮功能[4]。异黄酮能够防治骨质疏松症，可减少骨质丢失，促进骨生成[5]。然而大豆、银杏、欧芹等植物性食品原料中异黄酮提取率较低。采用生物技术处理后，可促进异黄酮合成途径中的关键酶基因的转录和表达，最终诱导异黄酮积累。本文综述植物食品原料中异黄酮富集机理及技术研究现状，以期为富含异黄酮的食品原料开发利用提供参考。

1 异黄酮形成机理及其富集的影响因素

1.1 异黄酮形成机理

高等植物中异黄酮的合成从底物苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）开始，经由苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（cinnamate 4-hydroxylase，C4H）、4-香豆酸:辅酶A
连接酶（4-coumarate CoA-ligase，4CL）催化的一系列酶促反应，生成前体p-香豆酰-CoA。p-香豆酰-CoA在查耳酮合酶（chalcone synthase，CHS）和查耳酮还原酶（chalcone reductase，CHR）的催化下生成柚皮素查耳酮或异甘草素。柚皮素查耳酮或异甘草素在查耳酮异构酶（chalcone isomerase，CHI）的催化下生成柚皮素或甘草素。柚皮素或甘草素在异黄酮合酶（isoflavone synthase，IFS）的催化下生成大豆异黄酮游离苷元如染料木黄酮、黄豆苷元和黄豆黄素，随后在不同的葡萄糖基转移酶催化下，生成相应的结合型异黄酮[6]，具体过程见图1。

图 1 大豆异黄酮的生物合成途径

Fig.1 Biosynthesis pathway of soybean isoflavones

异黄酮合成途径中的关键酶包括PAL、CHS、CHI和CHR。PAL作为苯丙烷类合成途径的起始酶，可将初生代谢产物转化为大量的次生代谢产物，因而其催化活性直接影响整个途径效率[7]。CHS是类黄酮合成途径中第一个特异性关键酶。X射线衍射表明：CHS晶体结构为两个42 kD多肽的同源二聚体，每个单体有两个结构域，活性位点位于结构域的裂缝[8]。CHS基因表达受光照、生物钟、温度、6-苄氨基腺嘌呤（6-benzylaminopurine，6-BA）和赤霉素A3（gibberellin A3，GA3）及P蛋白等调控[9]。CHI基因家族包含8 个成员，分为CHI1、CHI2、CHI3和CHI4这4 个亚家族[3]。基于催化能力，CHI基因可进一步分为Ⅰ型和Ⅱ型CHI，I型CHI与类黄酮合成有关，Ⅱ型CHI则与异黄酮合成有关[7]。IFS是将黄烷酮代谢途径引入异黄酮代谢途径的关键酶，其作用的底物柚皮素是黄烷酮代谢途径中许多酶的竞争性底物，如在类黄酮3-羟化酶（flavonoids 3-hydroxylase，F3H）的催化下形成黄烷酮醇，在黄酮合成酶（flavone synthase，FNS）催化下形成黄酮。因而IFS与黄烷酮代谢途径中许多酶相互作用必然会影响异黄酮的合成[10]。

1.2 影响异黄酮富集的因素

1.2.1 生长环境

植物中异黄酮的积累受环境因素调控。生长环境中光照[11]、水分[12]、茉莉酸甲酯[13]等外界信号被植物细胞膜上的受体所识别并结合，引起膜通透性、细胞氧化还原态和细胞超微结构变化等一系列反应，从而引起细胞核内基因表达量发生变化，异黄酮合成途径中关键酶结构及其活性发生变化，最终调控异黄酮合成。此过程需要通过植物细胞内Ca2+、环鸟甘酸（guanosine 3’,5’-cyclic phosphate，cGMP）、激酶、一氧化氮（nitric oxide，NO）等第二信使系统的关键组分将诱导信号级联放大。

1.2.2 基因改造

随着分子生物学技术的广泛应用，次生代谢工程能有效调控异黄酮的合成。目前已有的方法主要基于以下机理：1）过量表达限速酶，导致终产物含量的增加，这是植物代谢工程最常用的策略之一；2）通过引入转录调控因子，调节多个基因的共同表达，协调控制整个代谢途径；3）提高植物次生代谢途径中某一分支代谢途径中酶活性，使其在与另一分支代谢途径的竞争中占据优势，以提高目标代谢产物产量，例如抑制与IFS竞争同一底物（柚皮素）的F3H和FNS可促进异黄酮的积累[14]。

2 异黄酮富集技术

在对异黄酮合成途径中关键酶及富集机理有较为清晰认识的基础上，科学工作者已将一些富集异黄酮的技术应用于研究中。

2.1 光诱导

光是植物生长发育中一个重要的环境信号。目前的研究多集中于光对植物类黄酮合成中的一个重要的限速酶——苯基苯乙烯酮合酶基因CHS的诱导作用，该反应信号转导的一些可能组分已被揭示。显微注射和药理学方法研究表明，西红柿种子和大豆细胞培养物中光敏色素信号转导通路调节CHS表达[15]。活化的光敏色素A
（phytochromeA，phyA）将光信号转化为三聚体G蛋白和第二信使（包括cGMP和酪氨酸激酶）。与光敏信号通路不同，cGMP和酪氨酸激酶不影响紫外光B波段（ultra-violet-B，UV-B）调节CHS的表达。钙、钙调蛋白和丝氨酸激酶等拮抗物显著影响UV-B调节CHS的转录，但不抑制光敏色素对CHS基因表达的调节[15]。

2.1.1 光质

红光照射虽能显著促进发芽大豆的生长，但抑制发芽大豆PAL活性和异黄酮合成。Kirakosyan等[16]的研究表明，红光照射仅对实验选择的5 种基因型大豆中的一种产生作用，且远红外光（750 nm峰值透射率）比红外光（650 nm峰值透射率）更能促进大豆的芽和根中葛根素、染料木素、黄豆苷元和黄豆苷等异黄酮的合成。紫外光、蓝光和白光对诱导大豆合成mRNA、提高PAL活性和合成异黄酮具有促进作用，其中紫外光的作用最强，但抑制大豆生长。

拟南芥细胞培养物在UV-B照射数小时后，刺激CHS基因的转录与表达，而蓝光照射不明显，红光和远红光几乎无反应[17]。

不同光质之间还存在互作效应。红外光、蓝光和远红外光处理欧芹细胞培养物均不产生黄酮，而紫外光处理10 min后即有效果。若在紫外光处理前后用红外光、蓝光、远红外光处理，均能增强紫外光的效果[18]。

2.1.2 光量

在一定的光照范围内，最适光照强度及时间可使异黄酮合成量最多。徐茂军等[19]研究发现，在
0～60 μmol/（m2•s）光照强度范围内， 发芽大豆PAL活性和异黄酮含量随着紫外光照射强度的增加而显著提高；当紫外光照射强度超过60 μmol/（m2•s）时，PAL活性和异黄酮含量上升幅度较小。随着光质处理时间的延长，大豆芽苗菜的子叶中大豆异黄酮含量总体呈先上升后降低或持续降低的趋势，而下胚轴中则相反[11]。

2.1.3 光周期

异黄酮合成途径中关键酶受光周期控制，从而影响光诱导异黄酮合成的效果。Harmer等[20]在对拟南芥中8 000 个基因的表达量进行微阵列测定后发现，23 个与苯丙素类成分生物合成相关基因的表达体现出昼夜节律性变化，大部分在黎明前表达量达到峰值，形成“酚类屏障”，以保护植物在白天免受光伤害。Kim等[21]以10 h光照、14 h黑暗处理后，再行连续光照的模式处理大豆叶片，发现IFS、CHI、F3H均表现出受昼夜规则调控的现象，这3 种酶的mRNA含量随之变化的现象很明显：IFS的mRNA含量在光照下达到最大值，F3H的mRNA含量则在黑暗下达到最大值，可见两者的表达量不是同时达到最大值的，这样可以降低它们对底物柚皮素的竞争作用。由于CHI的mRNA含量变化周期很短，因而CHI的mRNA最大值并不明显，但是其最小值不是出现在F3H或IFS最大值时。

2.2 NO诱导

NO是植物中一种新型的信号分子，来源于臭氧（O3）胁迫或硝普酸钠（sodium nitroprusside，SNP），可调控黄酮等次生代谢产物合成过程。

2.2.1 硝酸还原酶（nitrate reductase，NR）途径

在O3胁迫下，银杏悬浮细胞中NO含量提高，NO淬灭剂对O3诱发银杏细胞黄酮合成的抑制作用表明NO是O3诱发银杏细胞中黄酮合成积累所必需的信号分子。O3处理可提高银杏细胞NR活性，NR抑制剂钨酸盐（tungstate，TUN）和谷氨酰胺（glutamine，Gln）在抑制银杏细胞中NR活性的同时还显著抑制O3对银杏细胞NO产生的诱导作用，表明O3可能依赖NR途径诱导银杏细胞产生NO[22]。

由SNP提供的NO激发怀槐细胞PAL活性，而PAL抑制剂氨氧乙酸有抑制NO激发异黄酮合成的作用，因而有理由认为在NO作用下，异黄酮为从头合成。DNA甲基化水平检测结果显示，NO作用使得怀槐培养细胞DNA甲基化水平升高，且随异黄酮的合成而呈动态变化。DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷可阻断NO激发下异黄酮的合成。因此，NO激发怀槐培养细胞生成的异黄酮可能与DNA甲基化有关[23]。

2.2.2 与cGMP共调控

白光照射下，所有受cGMP诱导的大豆异黄酮合成途径中的基因也受SNP诱导。NO的激发效应能被其抑制剂6-苯氨基-5,8-喹嗪阻断。Northern blotting分析表明，NO作为共同调控子，在转录水平上诱导编码黄酮合成酶的基因表达。SNP处理能瞬间使cGMP水平提高4 倍。大豆子叶中黄豆苷元和染料木黄酮对NO有响应，而对cGMP无响应，因而cGMP和NO在异黄酮合成过程中可能不是同时发挥作用的[24]。

2.3 茉莉酮酸化合物处理

白羽扇豆种子在吸胀过程中，茉莉酮化合物能够促进其子叶中异黄酮含量增加[25]。茉莉酮酸（jasmonate，JA）及茉莉酮酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）是植物脂质衍生物，具有广谱的生理效应，可调控许多基因的表达[26]。茉莉酮化合物能够诱导植物防御细胞内信号转导途径，从而诱导植物次生代谢途径中PAL、CHS等相关酶类合成[27]，改变植物细胞结构，以此响应异黄酮的合成。

2.3.1 改变细胞结构

在MeJA作用下，怀槐细胞异黄酮合成量显著提高，且细胞内染色很深的电子致密小体（electron-dense body，EDB）数量随异黄酮含量的升高而增加，第9天达到峰值，且与异黄酮积累呈正相关，推测MeJA可能诱导植物细胞结构变化，以此响应异黄酮的合成[28]。

2.3.2 促进关键酶基因表达

大豆黄化苗受伤后迅速积累的JA或外源添加的MeJA均能增加CHS和IFS基因表达量[13,21]。Creelman等[29]指出，在植物抗病方面，主要是依靠MeJA对次生代谢产物的调节作用，尤其体现在对CHS和PAL基因的调节上，MeJA处理可使两者mRNA少量增加。

2.4 稀土元素（rare earth element，REEs）处理

鉴于REEs对植物生长具有广泛的促进作用，很多学者将REEs用于促进紫杉醇、黄酮类化合物等次生代谢产物的合成。由于REEs很难在短时期内进入细胞内部，因而REEs可作为胞外信号起作用。

2.4.1 改变细胞渗透性和结构

利用电子显微镜观察到铈离子在细胞壁和质膜上大量沉积，其中大部分被液泡包裹成晶体或无定形物，从而调节细胞质膜的渗透性，进而增强细胞对营养物质的吸收、利用和转化，促进植物次生代谢物的合成[30]。REES还有改变细胞超微结构的作用，促进细胞分化[31]。

2.4.2 改变氧化还原态

适量的稀土元素镧（La）、铈（Ce）在显著提高还原型谷胱甘肽（reduced glutathion，GSH）、抗坏血酸（ascorbic acid，ASC）含量和GSH/氧化型谷胱甘肽（glutathionedisulfid，GSSG）、ASC/脱氢抗坏血酸（dehydroascorbic acid，DHA）比率的同时，又明显降低细胞中GSSG、DHA含量，从而改变细胞内氧化还原态，进而影响次生代谢途径中PAL和IFS活性，最终调节异黄酮的合成[32]。

2.4.3 改变酶结构

UV-B辐射胁迫下，植物中PAL、C4H、4CL和CHS活性提高，类黄酮含量升高，但在恢复期急剧下降，这是由于UV-B辐射导致酪氨酸（tyrosine，Tyr）和色氨酸（tryptophan，Trp）荧光同时被淬灭，CHS肽链上酰氨基吸收峰及Tyr和Trp等芳香氨基酸的残基对紫外吸收峰值下降，从而改变分子空间结构，降低CHS活性。CHS蛋白表面存在大量负电荷集中区。La3+易与CHS蛋白相互作用，导致CHS蛋白结构发生改变。因而低剂量La3+与CHS肽链中的酰氨基团上O或N原子及CHS肽链上Tyr和Trp等芳香氨基酸残基发生作用后，使CHS微结构变化，稳定CHS结构，从而对活性中心产生微扰作用，进而影响CHS活性，促进类黄酮合成，降低UV-B辐射诱导的自由基产生[30]。

2.5 基因工程技术

通过基因工程的手段可改变次生代谢流向或扩展乃至构建新的代谢途径，以大量积累代谢产物。

2.5.1 加速限速反应

Jung等[33]将含有编码IFS基因片段的质粒转导入来自大豆液体培养胚细胞中，使转基因种子中异类黄酮含量增加。Jung等[34]将IFS基因转入拟南芥中，使异黄酮合酶在其中表达，从而合成异黄酮，其中大豆苷元含量达到2ng/mg。然而已有的研究表明，过量表达PAL、C4H、4CL、CHS、IFS和CHI等异黄酮合成途径中单个关键酶，并不一定能使异黄酮含量显著增加[35]。Sangeeta等[36]利用微阵列技术分析发现：CHS8基因是激活整个类苯基丙醇通路的关键基因，因而也是异黄酮累积的关键基因；CHS8基因的过量表达使得异黄酮支路代谢水平因主通路被激活而略有提高，异黄酮含量随之呈略有增加。据此，易金鑫等[37]推测在主通路以外，异黄酮支路中可能还存在关键基因，两者共同的过量表达使异黄酮含量显著提高。研究证实CHS8是类苯基丙醇主路径中的主基因，异黄酮支路中的IFS2基因在高异黄酮和低异黄酮品种中的表达差异亦达到显著水平。利用发根农杆菌转化系统在大豆上分别过量表达CHS8、IFS2和CHS8＋IFS2，前两者异黄酮含量较对照分别提高65.9%和34.4%，而后者提高82.3%，增幅达极显著水平（P＜0.000 1）。由此证实大豆异黄酮积累由主通路中CHS8基因和支路中IFS2基因共同决定[37]。

2.5.2 转录调控因子策略

将玉米C1和R转录因子转入大豆中，苯丙烷通路PAL、C4H、CHI、CHR、F3H和二氢黄酮醇-4-还原酶（dihydroflavonol-4-reductase，DFR）基因被激活，染料木黄酮含量减少，黄豆苷含量增加，从而使总异黄酮含量增加。同时，抑制F3H表达基因的导入来抑制F3H与IFS竞争底物柚皮素，从而阻断花青素等黄酮类物质合成。激活转录因子与抑制竞争性途径的共同作用可促进大豆异黄酮积累[38]。

将拟南芥的转录因子GmMYB176转染到大豆胚中分离的原生质体中，反转录聚合酶链式反应（reverse transcript polymerase chain reaction，RT-PCR）监控内源CHS8的转录。结果表明，GmMYB176在大豆胚原生质体中瞬时表达，使CHS8转录水平在48 h内增加169 倍[39]。大豆毛状根中GmMYB176基因沉默将导致异黄酮水平下降，表明GmMYB176对于异黄酮生物合成的必要性。但是过量表达GmMYB176并不能增加CHS8转录和异黄酮水平，这表明GmMYB176调控CHS8基因可能需要另外的辅助因子。亚细胞定位研究证实GmMYB176定位于核中，但其本身不具有核定位信号[39]。大豆基因组包含18 个
14-3-3蛋白，其中16 个已被成功转录[40]。14-3-3蛋白中某一位点的缺失会改变GmMYB176的亚细胞定位[41]。双分子荧光互补和酵母双杂交实验也表明，GmMYB176与14-3-3蛋白互作[42]，因而GmMYB176的核定位可能需要14-3-3蛋白与其pST的位点结合，从而促进CHS8基因的表达，提高异黄酮含量[43]。

2.5.3 改变代谢途径流向

应用反义技术和RNA干扰（RNA interference， RNAi）技术可减少或阻塞非目标代谢物的合成，从而改变植物分叉代谢途径流向，为目标产物合成提供更加充足的合成前体。

RNAi技术已被广泛用于调控植物中苯丙烷类次生代谢产物的合成。Jiang Yina等[44]根据RNAi技术原理构建的双价RNA干扰植物表达载体使大豆中F3H和GmFNSII基因沉默，并分别构建了两基因的单价RNA干扰植物表达载体。通过发根农杆菌ATCC 15834对大豆子叶转化，验证所构建RNA干扰植物表达载体的效率。高效液相色谱分析结果显示，与两个单价RNAi载体相比，RNAi载体转化生成的毛状根中双价RNAi载体更有利于总异黄酮的合成，根中转化总异黄酮的量是对照组的2 倍。

3 结 语

目前已初步探明植物性食品原料中异黄酮形成机理及影响其富集的因素。在诸多调控技术中，紫外光诱导作用及其机理的研究较为深入。但紫外光在促进异黄酮积累的同时也会伤害植物。有必要将光诱导技术与添加外源NO、稀土元素、激素或外源生长调节剂及施肥等技术结合使用，以平衡异黄酮积累和植物生长，进一步促进异黄酮积累。例如，将紫外光诱导与SNP处理联用，充分发挥内源和外源NO在促进异黄酮积累和植物生长方面的调控作用。对于应用代谢工程技术生产次生代谢产物方面，可考虑寻找更为有效的转录因子，并明确其调控异黄酮合成的关键酶的辅助因子，深入探讨蛋白质间互作在其中的作用，达到富集异黄酮的目的。植物性食品原料用生物技术富集异黄酮后，可作为制造功能性食品的原料，这必将具有广阔的市场前景。

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