响应面试验优化万寿菊花中叶黄素酯皂化反应工艺

马空军1，潘言亮2，张卫红1，徐素梅1，高 超1

（1.新疆大学化学化工学院，新疆 乌鲁木齐 830046；2.新疆大学应用化学研究所，新疆 乌鲁木齐 830046）

摘 要：以叶黄素酯为原料，对万寿菊花中叶黄素酯皂化反应的工艺进行优化，考察反应溶剂种类及用量、皂化温度、皂化时间等因素对皂化反应的影响，采用薄层层析法计算皂化率，确定叶黄素酯皂化的适宜操作条件，对皂化反应工艺进行单因素试验和响应面分析研究。结果表明，叶黄素酯的皂化反应最佳工艺条件为叶黄素酯为2.0 g时，无水乙醇用量31.3 mL、皂化温度60 ℃、KOH用量2.1 g、皂化时间4 h，此条件下叶黄素酯的平均皂化率为78.4%。

关键词：叶黄素酯；皂化反应；薄层层析法

Optimizing the Saponification of Lutein Esters from Marigold Flowers

MA Kongjun1, PAN Yanliang2, ZHANG Weihong1, XU Sumei1, GAO Chao1

(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Xinjiang University, Ürümqi 830046, China;

2. Institute of Applied Chemistry, Xinjiang University, Ürümqi 830046, China)

Abstract: This work was conducted to investigate the saponification of lutein esters from marigold flowers. The effects of type and amount of organic solvent, saponification temperature and time on the saponification rate of lutein esters as determined by thin layer chromatography were explored. The optimal conditions for the saponification of lutein esters were determined by single factor experiment and response surface analysis as follows: 2.0 g of lutein esters, 31.3 mL of absolute ethanol, 2.1 g of potassium hydroxide, a saponification temperature of 60 ℃, and a saponification duration of 4 hours. Under these optimal conditions, the average saponification rate of lutein esters reached 78.4%.

Key words: lutein esters; saponification; thin layer chromatography

中图分类号：TS202.1 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2015）12-0007-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201512002

叶黄素是一种广泛存在于蔬菜、水果和花草植物中的主要类胡萝卜素[1]，植物万寿菊花中的叶黄素主要以酯类形式[2-3]存在，以酯形式存在的叶黄素不易被人体和动物吸收，而游离叶黄素可被人体和禽类直接吸收利用[4-5]，为了扩大其药用性，对所提取的叶黄素酯进行皂化处理[6-8]成为获取高纯度游离叶黄素必不可少的环节[9-11]。

已有报道的文献采用高效液相色谱法[12-16]分析皂化率，该分析方法准确率高，但是对试剂的要求很苛刻，只能选取色谱纯，且操作费用高。薄层色谱分析是一种固-液吸附色谱分离技术[17]，该方法具有操作简便、分离快、同时分离多个样品、样品易处理、成本低等特点。正是由于这些特点，使得薄层色谱在天然产物的提取分离上有广泛应用[18]。本研究以万寿菊中所提取的叶黄素酯为研究对象，进行皂化处理，探索叶黄素酯皂化反应的最佳工艺路线和最佳工艺参数，为提取高纯度游离态的叶黄素提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

叶黄素酯粗提物为经正己烷提取万寿菊产物。

薄层层析硅胶（GF254）、硅胶板（25.4 mm×76.2 mm×0.2 mm） 青岛海洋化工有限公司；玻璃点样毛细管（100 mm×0.5 mm） 华西医科大学仪器厂；无水乙醇 天津永晟精细化工有限公司；正己烷、乙酸乙酯、氢氧化钠、无水硫酸钠 天津市百世化工有限公司；石油醚 天津市富宇精细化工有限公司；羧甲基纤维素钠（LH9，800-1200） 上海山浦化工有限公司。所有试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

电子天平、TDL-50B离心机 上海精密科学仪器有限公司；DF-101Z型集热式恒温加热磁力搅拌器、SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；RE-52型旋转蒸发仪 上海洪纪仪器有限公司；DZF-6030A真空干燥箱 上海一恒科技有限公司；U-3900型紫外分光光度计 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

叶黄素酯皂化反应工艺流程见图1。

图 1 叶黄素酯皂化反应工艺流程图

Fig.1 Flow diagram for the saponification of lutein esters

1.3.2 皂化率的计算

在叶黄素酯的皂化反应中，随着反应的不断进行，叶黄素酯逐渐水解为叶黄素和脂肪酸盐，通过观察色谱板上斑点的变化，来分析皂化反应发生的程度。对皂化得到的叶黄素和未皂化的叶黄素酯进行紫外测试[19-20]，并按下式计算皂化率：

式中：A1为皂化前少量叶黄素含量/g；A2为皂化后的叶黄素含量/g；A3为未皂化完的叶黄素酯类含量/g。

1.3.3 单因素试验

针对叶黄素酯的皂化反应中各种条件（溶剂的选择、碱量的选取、皂化反应的温度以及时间）对万寿菊中叶黄素酯皂化程度的影响，采用单因素试验进行研究分析，用皂化率评价试验的工艺参数。

1.3.3.1 溶剂种类及用量的影响

称取质量为2 g（准确到0.001 g，下同）万寿菊叶黄素酯5 份于250 mL的三口瓶中，均加入10 mL石油醚[21]为叶黄素酯的分散剂，再分别加入30 mL的甲醇、无水乙醇、乙二醇、丙醇、丙三醇，最后各加入2 g KOH和磁子，置于集热式恒温加热磁力搅拌器中，设置皂化温度60 ℃、转速30 r/min、皂化时间4 h，选出最佳的溶剂，同时考察醇的用量对皂化的影响。

1.3.3.2 KOH用量的影响

称取质量为2 g叶黄素酯5 份于250 mL的三口瓶中，石油醚用量10 mL、无水乙醇用量30 mL，置于集热式恒温加热磁力搅拌器中，设置皂化温度60 ℃、转速
30 r/min、皂化时间4 h，研究KOH用量1、2、3、4、5 g时对叶黄素酯皂化效果的影响。

1.3.3.3 皂化时间的影响

称取质量为2 g叶黄素酯5 份于250 mL的三口瓶中，石油醚用量10 mL、无水乙醇用量30 mL、KOH用量2 g，置于集热式恒温加热磁力搅拌器中，设置皂化温度60 ℃、转速30 r/min，研究皂化时间1、2、3、4、5 h 对叶黄素酯皂化效果的影响。

1.3.3.4 皂化温度的影响

称取质量为2 g叶黄素酯5 份于250 mL的三口瓶中，石油醚用量10 mL、无水乙醇用量30 mL、KOH用量2 g，置于集热式恒温加热磁力搅拌器中，设置转速30 r/min、皂化时间4 h，考虑到石油醚的沸程为60～90 ℃和无水乙醇的沸点为78 ℃，研究皂化温度为室温（22 ℃）、30、40、50、60 ℃时叶黄素酯的皂化效果。

1.3.4 响应面法优化叶黄素酯皂化工艺参数

通过单因素试验，选择无水乙醇作为皂化剂，固定皂化时间为4 h，以无水乙醇用量（X1）、皂化温度（X2）和KOH用量（X3）3 个因素与叶黄素酯的皂化率进行响应面试验设计（表1），优化叶黄素酯的皂化工艺。通过Design-Expert软件对试验数据进行回归分析，确定最佳工艺参数。

表 1 响应面试验因素与水平

Table 1 Factors and levels used in response surface analysis

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 溶剂种类及用量的选择

图 2 皂化溶剂种类对皂化率的影响

Fig.2 Effect of different solvents on the saponification rate of lutein esters

由图2可知，溶剂的皂化能力大小顺序为甲醇＞无水乙醇＞丙醇＞乙二醇＞丙三醇，皂化结果表明，黏度的大小对皂化程度有很大的影响，黏度越小，皂化反应的传质阻力会越小，反之，黏度最大的丙三醇，皂化率只有8.1%，几乎没发生反应，故应选择黏度小溶剂。在保证皂化率的同时，考虑到叶黄素的应用和溶剂的安全、低毒，而甲醇有一定的毒性，选取无水乙醇作为皂化剂。

图 3 无水乙醇用量对皂化率的影响

Fig.3 Effect of absolute ethanol volume on the saponification rate of lutein esters

保持其他条件不变，固定皂化溶剂为无水乙醇，改变其用量。如图3所示，初始阶段叶黄素酯的皂化率随无水乙醇用量的增加幅度变化较大，当无水乙醇用量从10 mL增加到20 mL，皂化率提高了13.6%，皂化程度相比无水乙醇量为10 mL时提高了25%；无水乙醇用量达到30 mL后，每增加10 mL无水乙醇量，皂化率的提高值不超过5%，皂化率增加的幅度出现了降低的趋势。原因可能为无水乙醇用量增加使叶黄素得到了充分分散，增大了反应物之间的接触，从而提高了反应的传质速率，使得皂化比较完全。无水乙醇用量的增加在提高皂化率同时，也势必提高了生产成本，给后续处理造成困难，故无水乙醇用量选择30 mL较适宜。

2.1.2 KOH用量的选择

图 4 KOH用量对皂化率的影响

Fig.4 Effect of KOH concentration on the saponification rate of lutein esters

如图4所示，在1～2 g范围内，KOH用量的增加对叶黄素酯的皂化有很大程度的影响，皂化率增大值约为10%，继续增大其用量，对皂化的程度不再有较大的影响，同时考虑到皂化后的剩余碱量的处理，需要大量的水洗去除，对叶黄素产品有一定的损失。故KOH用量选择为2 g左右。

2.1.3 皂化时间的选择

由图5可知，反应时间在0～4 h范围内，皂化率随时间的延长逐渐升高，当反应时间为4 h时，皂化率达到了最大，之后再延长时间，皂化率出现了减小的趋势。故选择反应时间为4 h左右。

图 5 皂化时间对皂化率的影响

Fig.5 Effect of saponification time on the saponification rate of lutein esters

2.1.4 皂化温度的选择

图 6 皂化温度对皂化率的影响

Fig.6 Effect of saponification temperature on the saponification rate of lutein esters

由图6可知，随着皂化温度的升高，皂化率呈现“S”形的增加。这一结果与酯类的皂化属于吸热反应一致，根据反应热力学，升高温度增大了反应速率常数[22]，
从而有利于叶黄素酯的皂化反应。但是叶黄素酯皂化生成的游离态叶黄素热不稳定[23]，温度升高在增大反应速率的同时，可能会出现降解或者异构化等反应的发生，致使增加的幅度出现了降低的趋势。综合考虑设置温度为60 ℃。

2.2 响应面法优化叶黄素酯皂化工艺结果

表 2 皂化反应工艺响应面试验设计与结果

Table 2 Experimental results of response surface analysis for optimizing the saponification of lutein esters

以无水乙醇用量、皂化温度、KOH用量为自变量，叶黄素酯的皂化率为响应值，按响应面试验设计，平行试验3次所得的平均值为响应值，结果见表2，响应面图和等高线见图7。

A.无水乙醇用量和皂化温度（KOH用量为2 g）

B.无水乙醇用量和KOH用量（皂化温度为60℃）

C.皂化温度和KOH用量（乙醇用量为30 mL）

图 7 各因素交互作用对万寿菊花中叶黄素酯皂化效果影响的
响应面和等高线

Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of saponification temperature and KOH concentration on the saponification rate of lutein esters

由图7A可知，无水乙醇用量和皂化温度的交互作用对叶黄素酯皂化反应有一定影响。无水乙醇用量不变时，皂化率随着温度的升高而增加；皂化温度一定时，叶黄素皂化率先逐渐增加，达到极大值后逐渐下降。通过等高线的疏密可以判断在交互影响中皂化温度对响应值的影响大于无水乙醇用量。由图7B可知，无水乙醇用量一定时，皂化率随着KOH用量增加而增大，达到极大值后对皂化的程度影响不显著。KOH用量一定时，皂化率随着无水乙醇用量增加而增加，当无水乙醇用量增加到一定值后，皂化率增幅呈逐渐下降的趋势。由图7C可知，皂化温度不变时，叶黄素皂化率随着KOH用量增加而增加，当KOH用量增加到一定值后，叶黄素皂化率呈逐渐下降的趋势。KOH用量不变时，叶黄素皂化率随着皂化温度的升高而增加，但超过一定值后温度的升高对叶黄素皂化率的影响不显著。

由图7可以直观地看出，无水乙醇用量和KOH用量之间的交互作用对叶黄素提取皂化效果影响显著，而KOH用量和皂化温度的交互作用次之，表现在曲面比较陡，并且等高线呈现椭圆状；皂化温度和无水乙醇用量之间的交互作用对叶黄素提取皂化效果影响不显著，表现在曲面比较平滑。

2.3 方差分析结果

使用Design-Expert 8.0.6软件对表2响应面试验数据进行二次多元回归拟合，得出皂化率Y与自变量X1、X2、X3的二次回归方程：

Y=78.24＋0.99X1＋1.05X2＋1.16X3－0.48X1X2＋0.35X1X3－0.13X2X3－1.17X12＋0.41X22－2.92X32

表 3 回归方程方差分析

Table 3 Analysis of variance of regression equation

注：**. P＜0.01，差异极显著；*. P＜0.05，差异显著。

表3分析结果表明，回归模型P＜0.000 1，说明该二次方程模型极其显著，失拟项P=0.089 5＞0.05，说明失拟项不显著，回归模型的决定系数为R2=0.944 2，
说明该二次方程模型与数据拟合程度较好，试验随机误差及噪声的波动影响较小，可以用上述二次回归方程分析和预测叶黄素酯皂化反应的工艺参数。

此外，回归系数显著性检验表明，在所选择的各因素水平范围内，对影响叶黄素酯皂化反应的因素排序：KOH用量（X3）＞皂化温度（X2）＞无水乙醇用量（X1）。回归方程各项的方差分析结果表明，一次项X1、X2、X3及二次项X12、X32对叶黄素酯皂化反应效果的影响较显著，X1X2、X1X3、X2X3、X22对叶黄素酯皂化反应效果的影响不显著。

由Design-Expert 8.0.6软件分析出万寿菊叶黄素酯皂化反应的最佳工艺条件编号为：X1=0.25、X2=1、X3=0.19。转化成的最佳工艺参数为：无水乙醇用量31.25 mL、皂化温度60 ℃、KOH用量2.1 g。在此条件下，叶黄素酯的理论皂化率为79.86%。选择无水乙醇用量31.3mL、皂化温度60 ℃、KOH用量2.1 g、皂化时间4 h，选择进行3 次平行实验，得出叶黄素酯的实际皂化率为78.4%。与理论预测值误差仅为－1.8%，验证结果与预测值偏差很小，说明采用响应面分析所得到的工艺条件是简便可行。

3 结 论

通过响应面数据统计分析，得出万寿菊叶黄素酯皂化反应的最佳工艺条件为无水乙醇用量31.3 mL、皂化温度60 ℃、KOH用量2.1 g、皂化时间4 h，进行3 次平行实验，得出叶黄素酯的实际皂化率为78.4%。验证结果与预测值偏差很小，说明采用响应面分析叶黄素酯皂化工艺条件简便可行。

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