响应面试验优化阿魏酰基脂肪酰基结构酯合成工艺及产物稳定性

王 强1,2，龙 洁1，任彦荣1，王 存1，彭 荣3，袁 君4

（1.重庆第二师范学院生物与化学工程系，重庆 400067；2.西南大学食品科学学院，重庆 400715；

3.重庆工商大学环境与生物工程学院，重庆 400067；4.普研（上海）标准技术服务有限公司，上海 201210）

摘 要：利用响应面试验对在溶剂体系中脂肪酶Lipozyme RM IM催化玉米胚芽油与阿魏酸酸解制备阿魏酰基脂肪酰基结构酯的反应条件进行优化。在摇床转速为220 r/min的条件下，选取投料比（阿魏酸与玉米胚芽油质量比）、反应温度、反应时间3 个因素作为考察对象，以阿魏酸转化生成阿魏酰基脂肪酰基结构酯的得率为考察指标，运用Design-Expert软件的星点设计功能进行试验设计并对结果进行分析。结果表明，3 个因素均为影响阿魏酸酯化的显著因素；经响应面分析可确定最优值为投料比8.9∶1（g/g）、反应温度76.0 ℃、反应时间28.1 h。该条件下的平均得率达59.1%，与响应面拟合方程的得率预测值58.8%吻合良好。在煎炸过程中新制备的结构酯产生较低的聚合物，同时其具有较高的贮藏稳定性。

关键词：阿魏酸；阿魏酰基脂肪酰基结构酯；响应面优化；稳定性

Optimized Synthesis and Stability of Feruloylated Acylglycerols

WANG Qiang1,2, LONG Jie1, REN Yanrong1, WANG Cun1, PENG Rong3, YUAN Jun4

(1. Department of Biological and Chemical Engineering, Chongqing University of Education, Chongqing 400067, China;

2. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China;

3. College of Environmental and Biological Engineering, Chongqing Technology and Business University, Chongqing 400067, China;

4. Gratech Co. Ltd., Shanghai 201210, China)

Abstract: This study was intended to model and optimize the reaction conditions for enzymatic esterification of ferulic acid with maize germ oil using a commercial lipase, Lipozyme RM IM, in a solvent system to obtain feruloylated acylglycerols by response surface methodology (RSM). The experiments were designed with central composite design. The reaction factors investigated were molar ratio of maize germ oil to ferulic acid, temperature and time. The yield of feruloylated acylglycerols was selected as the response variable. All the factors investigated significantly affected the yield of feruloylated acylglycerols. The optimal reaction conditions were found to be a molar ratio of maize germ oil to ferulic acid of 8.9:1 (g/g),
76.0 ℃ and 28.1 h, leading to a feruloylated acylglycerol yield of 59.1%, which was in good agreement with the predicted value of 58.8%. The prepared acylglycerols produced low polymer during frying process, and they had high storage stability.

Key words: ferulic acid; feruloylated acylglycerols; response surface methodology; stability

中图分类号：R151；TQ925 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2015）12-0017-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201512004

阿魏酸化学名为4-羟基-3-甲氧基-2-苯丙烯酸，在植物细胞壁中，与多糖和木质素交联构成细胞壁的一部分，是阿魏、当归、川芎、升麻等中药的有效成分之一，其熔点为174 ℃，阿魏酸微溶于冷水，可溶于热水，水溶液中稳定性差，见光易分解，易溶于乙醇等极性较强有机溶剂[1-2]。现代药理学研究表明，阿魏酸具有明显的抗氧化、清除自由基、抗感染和神经保护作用[3-4]。但是，阿魏酸应用存在一些问题，例如，阿魏酸脂溶性较差，限制其在油脂基食品、医药、及化妆品中应用[3,5]。因此，将阿魏酸与一些脂溶性较强分子相结合，既可保持其生物活性，还可增强其亲脂性，从而扩大其应用范围。国内外研究[6-8]发现，将天然抗氧化性成分制备成改性结构脂质后，可显著地提高天然抗氧化性成分的应用范围。

目前研究较多的阿魏酸脂溶性衍生物是阿魏酰基脂肪酰基结构酯，研究表明，经分子改性的阿魏酰基脂肪酰基结构酯表现出比阿魏酸更强脂溶性，并保持阿魏酸生物活性，如抗氧化、抗紫外吸收等功效[9-13]。研究发现，溶液体系、投料比例和反应条件等因素均对合成阿魏酰基脂肪酰基结构酯具有显著影响[14-17]。因此，本研究采用脂肪酶Lipozyme RM IM在甲基乙基酮溶剂体系中催化阿魏酸和玉米胚芽油酯交换合成阿魏酰基脂肪酰基结构酯，通过响应面试验设计对该体系中酶催化酯交换合成阿魏酰基脂肪酰基结构酯的条件进行优化，并考察投料比（阿魏酸与玉米胚芽油质量比）、反应温度、反应时间3 个因素对产物得率的影响，确立了一个新的反应时间短、得率高的合成路径和方法；在此基础上，研究了产物在煎炸和贮藏等环境下的稳定性，实验结果揭示该工艺合成的阿魏酰基脂肪酰基结构酯在高温煎炸和长期贮藏过程中具有较高稳定性。通过脂肪酶Lipozyme RM IM在甲基乙基酮溶剂体系中催化阿魏酸和玉米胚芽油酯交换合成阿魏酰基脂肪酰基结构酯，不仅没有丢失阿魏酸的功能特性，还提高了其功能，拓宽其应用领域，提高应用效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米胚芽油 益海嘉里（重庆）粮油有限公司；阿魏酸、脂肪酶Lipozyme RM IM 诺维信（中国）生物技术有限公司；甲基乙基酮、其他试剂（均为分
析纯） 成都科龙试剂厂；所用水为双蒸水，所用溶液均自行配制。

1.2 仪器与设备

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 河南省巩义市予华仪器有限公司；AR1140电子分析天平 美国
奥豪斯贸易公司；DSY-Ⅲ氮吹仪 金科精华苑科技有限公司；高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪（配备有ZORBX-SB ODS色谱柱（4.6 mm×250 mm，0.45 μm）、蒸发光散射检测器和紫外检测器） 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 酯交换反应

称5.0 g玉米胚芽油和适量阿魏酸加入到50 mL具塞锥形瓶中，在甲基乙基酮为溶剂条件下，按照一定投料比（4∶1～10∶1）合成阿魏酰基脂肪酰基结构酯，当达到预定反应温度（60～80 ℃）时，加入12%（占底物质量分数）的脂肪酶Lipozyme RM IM（来自于黑根毛霉Rhizomucor miehei），在转速200 r/min条件下，密闭振荡反应（20～30 h）。定时取样，考察投料比、反应温度、反应时间3个因素对产物得率的影响。

1.3.2 响应面优化酯化制备工艺

在单因素试验基础上，采用响应面法对影响阿魏酰基脂肪酰基结构酯制备的主要因素投料比（A）、反应温度（B）、反应时间（C）进行优化。每个因素设计5 个水平，分别用代码－α、－1、0、1、α（α=1.732）表示，因素水平见表1。

表 1 星点试验设计因素与水平表

Table 1 Factor and levels used in central composition design

1.3.3 反应产物分离和HPLC分析

反应混合物离心，除去脂肪酶。取一定质量的样品离心后，加入30 mL正己烷和10 mL 0.8 mol/L的KOH醇水溶液（30%乙醇），剧烈振荡2 min，静置5 min。下层醇水溶液再加入15 mL正己烷二次提取，剧烈振荡2 min，静置。合并两次萃取所得上清液，旋转蒸发去除有机溶剂（40 ℃），所得样品称质量，冰箱保存用于后续分析[18]。

HPLC条件：色谱柱：Nova-Pak C18柱（3.9 mm×150 mm，4.6 μm）；流动相由0.75%冰醋酸（A）和甲醇（B）组成，起始流动相为50% A和50% B，流动相比例变为90% A和10% B 10 min，然后变为100% B 40 min；流速为1 mL/min；洗脱液在325 nm波长条件下检测。

1.3.4 煎炸实验和聚合物含量的测定

参考李东锐等[19]报道的煎炸实验方法。油脂中二聚物和高聚物含量可用高效体积排阻色谱来测量；操作参数：柱的选择：PLGEL（30 cm×0.8 cm，0.25 μm）；流动相：HPLC纯的四氢呋喃；流速：0.85 mL/min；操作柱温：35 ℃；注射量：20 mL油和四氢呋喃（1∶1，V/V）。在相同检测器响应的条件下，聚合物总含量以峰面积为基准进行计算。

1.3.5 加速氧化测试

采用Schall烘箱法加热加速氧化实验。分别取20 mL原始玉米胚芽油和改性结构酯装入100 mL透明玻璃瓶，密封后避光放置于65 ℃恒温培养箱中加热加速氧化5 d，每隔24 h测定样品体系的过氧化值和β-茴香胺值，所有样品测定3 次。过氧化值按GB/T 5009.37—2003《食用植物油卫生标准的分析方法》测定[20]。β-茴香胺值测定参照GB/T 24304—2009《动植物油脂：茴香胺值的测定》[21]。

1.4 数据统计分析

采用SPSS 17数据处理软件，各组数据结果均以

±s（n=3）表示，并进行方差分析，最小显著性法进行多重比较，P＜0.05表示差异具有显著性。

2 结果与分析

2.1 响应面优化结构酯制备工艺条件

2.1.1 回归方程与方差分析

表 2 星点试验设计与结果

Table 2 Central composite design with response values

试验利用Design-Expert 7.1.6软件中的星点试验设计，可获得阿魏酰基脂肪酰基结构酯得率（Y）的三因素三水平试验设计及结果（表2）。对表2中的结果进行统计分析，可建立如下二次回归方程：

Y=54.97＋2.55A＋5.56B＋4.42C＋7.10AB＋1.58AC＋5.88BC－6.12A2－22.54B2－7.11C2

对二次回归方程进行方差分析，结果见表3。从表3可知，阿魏酰基脂肪酰基结构酯得率Y的A、B、C、AB、BC、A2、B2、C2均表现出了显著水平，仅AC项不显著。进一步对该回归模型进行显著性检验发现，模型的决定系数R2为0.971 9，表明预测值和实测值之间的相关性很好。回归模型P＜0.000 1，极显著；表3中，失拟项
P＞0.05，不显著，因此证明该模型可以充分地解释响应中的变异，模型拟合度良好。

表 3 阿魏酰基脂肪酰基结构酯得率回归方程的方差分析表

Table 3 Analysis of variance for the yield of feruloylated acylglycerols

注：P＜0.01，差异极显著；P＜0.05，差异显著。

2.1.2 响应面分析

图 1 各因素交互作用对阿魏酰基脂肪酰基结构酯得率的影响

Fig.1 Influence of reaction conditions on the yield of feruloylated acylglycerols

为了考察投料比（A）、反应温度（B）、反应时间（C）及其交互作用对结构酯得率（Y）的影响，固定其他因素条件不变，获得任意2 个因素及其交互作用对得率（Y）影响的响应面图，结果如图1所示。交互作用与阿魏酰基脂肪酰基结构酯得率均为正相关关系，二因素交互作用的重要性由AB、BC、AC依次递减。

2.1.3 响应面分析和优化参数验证

分析结果表明，回归模型存在稳定点编码值（0.633、0.595、0.627），稳定点的特征值表明，稳定点为阿魏酰基脂肪酰基结构酯得率最大值点，即投料比8.9∶1、反应温度76.0 ℃、反应时间28.1 h。该条件下的平均得率达（59.1±0.86）%，与响应面拟合方程的得率预测值58.8%吻合良好。该酶法催化阿魏酸和玉米胚芽油直接制备阿魏酰基脂肪酰基结构酯的反应条件温和、催化效率高、催化剂可重复利用。Compton等[22]研究了Novozyme 435酶在无溶剂体系条件下催化阿魏酸乙酯与大豆油酯交换合成阿魏酸甘油酯，结果表明，阿魏酸甘油酯的产率为60%。

2.2 改性处理对玉米胚芽油煎炸过程中聚合物含量的影响

图 2 改性处理对玉米胚芽油在煎炸过程中聚合物含量的影响

Fig.2 Effects of modification on the polymer content of maize germ oil during frying

油炸过程中产生的聚合物包括二聚体化合物、三聚体化合物和高分子化合物等，聚合物含量是衡量油脂中发生氧化聚合和热聚合形成聚合产物多少的重要指标，聚合物的产生影响了油的品质，同时还影响了食品的水分损失和吸油情况[23-24]。如图2所示，在煎炸过程中，改性处理降低了玉米胚芽油的聚合物生成，表明该工艺改性的结构脂质具有较高的氧化稳定性。通过对原始玉米胚芽油和阿魏酰基脂肪酰基结构酯在煎炸过程中聚合物指标所发生的变化研究，对进一步探讨如何减缓油脂煎炸过程中氧化变质和如何延长煎炸食品的货架寿命具有重要的意义。

2.3 改性处理对玉米胚芽油过氧化值和β-茴香胺值的影响

过氧化值是油脂初始氧化反应的产物，大部分初始氧化产物都分解成酮醛等有害物质；而β-茴香胺值反映的是油脂氧化时二次氧化产物的含量，是评价油脂二次氧化最好的方法[25]。图3A显示，改性前后样品过氧化值均随时间延长而增大，但过氧化值变化趋势有明显差异。0～5 d范围内，空白对照组试样过氧化值随时间延长而显著增大，而改性处理可以显著改善玉米胚芽油在高温中的氧化稳定性。β-茴香胺值随着贮藏时间的变化规律如图3B所示，随着高温贮藏时间的延长，各种样品的β-茴香胺值均呈增大趋势，与空白样品对比，改性处理对玉米胚芽油有抗氧化作用。从以上结果可以看出，通过对玉米胚芽油改性，该结构脂质具有传统油脂的营养和物理性能，而且最大限度地发挥了油酸和亚油酸功效，提高了氧化稳定性与货架期内的品质，是一种可替代传统油脂使用的高品质结构脂质。

图 3 改性处理对玉米胚芽油的过氧化值（A）和
β-茴香胺值（B）的影响

Fig.3 Effects of modification on the peroxide value (A) and β-anisidine value (B) of maize germ oil

3 结 论

通过对响应面试验的优化分析，得出3 个反应因素对阿魏酰基脂肪酰基结构酯得率影响大小的顺序为：反应温度＞反应时间＞投料比。并且获得在甲基乙基酮溶剂体系中酶法催化玉米胚芽油交换合成阿魏酰基脂肪酰基结构酯的最佳工艺条件为：投料比8.9∶1、反应温度76.0 ℃、反应时间28.1 h。在此工艺条件下可获得阿魏酰基脂肪酰基结构酯得率为59.1%。稳定性实验研究发现，经过阿魏酸酯化改性后，玉米胚芽油结构脂质表现出较高的煎炸稳定性和耐高温贮藏稳定性。采用脂肪酶Lipozyme RM IM合成阿魏酰基脂肪酰基结构酯是一种高效、专一性强、副产物少、环境友好的工艺技术，可用于阿魏酰基脂肪酰基结构酯的放大实验。

参考文献：

[1] BACANLI M, AYDIN S, TANER G, et al. The protective role of ferulic acid on sepsis-induced oxidative damage in Wistar albino rats[J]. Environmental Toxicology and Pharmacology, 2014, 38(3): 774-782.

[2] 赵文红, 邓泽元, 范亚苇, 等. 阿魏酸体外抗氧化作用研究[J]. 食品科学, 2010, 31(1): 219-223.

[3] KUMAR N, PRUTHI V. Potential applications of ferulic acid from natural sources[J]. Biotechnology Reports, 2014, 4: 86-93.

[4] MANCUSO C, SANTANGELO R. Ferulic acid: pharmacological and toxicological aspects[J]. Food and Chemical Toxicology, 2014, 65: 185-195.

[5] 孙玥, 余燕影, 曹树稳. 阿魏酸、根皮素和水溶性VE的抗氧化协同效应及其配方优化[J]. 食品科学, 2012, 33(3): 33-38.

[6] TROMBINO S, CASSANO R, FERRARELLI T, et al. Trans-ferulic acid-based solid lipid nanoparticles and their antioxidant effect in rat brain microsomes[J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2013, 109: 273-279.

[7] SOROUR N, KARBOUNE S, SAINT-LOUIS R, et al. Enzymatic synthesis of phenolic lipids in solvent-free medium using flaxseed oil and 3,4-dihydroxyphenyl acetic acid[J]. Process Biochemistry, 2012, 47(12): 1813-1819.

[8] TAKEMI K, JUNICHI T. Ferulic acid and angelica archangelica extract in dementia: effects on cognitive functions and behavioral and psychological symptoms of dementia[J]. Diet and Nutrition in Dementia and Cognitive Decline, 2015, 69: 993-1001.

[9] GRUCZYNSKA E, PRZYBYLSKI R, ALADEDUNYE F. Performance of structured lipids incorporating selected phenolic and ascorbic acids[J]. Food Chemistry, 2015, 173(15): 778-783.

[10] 曹茜, 冯凤琴. 微生物脂肪酶的研究进展及其在食品中的应用[J]. 中国食品学报, 2013, 13(10): 136-143.

[11] 辛嘉英, 陈林林, 张蕾, 等. 无溶剂体系脂肪酶催化阿魏酸油酸甘油酯合成研究[J]. 中国粮油学报, 2009, 24(5): 74-79.

[12] KARDAR M N, ZHANG T, COXON G D, et al. Characterisation of triterpenes and new phenolic lipids in Cameroonian propolis[J]. Phytochemistry, 2014, 106: 156-163.

[13] ZHENG Yan, WU Xiaomei, BRANFORD-WHITE C. Dual response surface-optimized process for feruloylated diacylglycerols by selective lipase-catalyzed transesterification in solvent free system[J]. Bioresource Technology, 2009, 100(12): 2896-2901.

[14] 秦飞. 离子液体体系中酶催化合成阿魏酰基脂肪酰基结构酯的研究[D]. 郑州: 河南工业大学, 2013.

[15] 宋范范. 酶催化阿魏酸乙酯与甘一酯的酯交换反应合成阿魏酰基结构脂的研究[D]. 郑州: 河南工业大学, 2013.

[16] 周文雅, 孙尚德, 毕艳兰. 响应面优化溶剂体系酶催化阿魏酸乙酯与甘二酯酯交换合成阿魏酰基脂肪酰基结构酯[J]. 粮食与油脂, 2013(12): 48-51.

[17] 孙尚德. 酶法合成阿魏酰基脂肪酰基结构酯的研究[D]. 无锡: 江南大学, 2009.

[18] 潘向昆, 王瑛瑶, 刘建学, 等. KOH醇水溶液分离纯化结构脂质条件研究[J]. 中国油脂, 2012, 37(8): 39-42.

[19] 李东锐, 毕艳兰, 肖新生, 等. 食用油煎炸过程中的品质变化研究[J]. 中国油脂, 2006, 31(6): 34-36.

[20] 卫生部. GB/T 5009.37—2003 食用植物油卫生标准的分析方法[S]. 北京: 中国标准出版社, 2003.

[21] 卫生部. GB/T 24304—2009 动植物油脂茴香胺值的测定[S]. 北京: 中国标准出版社, 2009.

[22] COMPTON D L, LASZLO J A, EVANS KERVIN O. Antioxidant properties of feruloyl glycerol derivatives[J]. Industrial Crops and Products, 2012, 36(1): 217-221.

[23] LI F, HANSON M V, LAROCK R C. Soybean oil-divinylbenzene thermosetting polymers: synthesis, structure, properties and their relationships[J]. Polymer, 2001, 42(4): 1567-1579.

[24] 邓云, 吴颖, 杨铭铎, 等. 煎炸油中产生的极性成分对食品微观结构和质构的影响[J]. 农业工程学报, 2004, 20(6): 160-164.

[25] YING Z, LEI Y, YUANGANG Z, et al. Oxidative stability of sunflower oil supplemented with carnosic acid compared with synthetic antioxidants during accelerated storage[J]. Food Chemistry, 2010, 118: 656-662.