正交试验优化超声波辅助同时提取
桑叶总黄酮、单宁工艺

钟雨珅1，王历琼1，韩小丹1，黄先智2，丁晓雯1,*

（1.西南大学食品科学学院，重庆市农产品加工及贮藏重点实验室，重庆 400716；

2.西南大学蚕学与生物系统研究所，重庆 400716）

摘 要：采用超声波辅助法同时提取桑叶中总黄酮、单宁并用分光光度法对其含量进行测定，为这两类物质快速分离测定提供参考。在单因素试验基础上用正交试验优化，得到超声波同时提取桑叶总黄酮、单宁的最佳条件为：乙醇体积分数75%、料液比1∶30（g/mL）、提取温度80 ℃、提取时间10 min、超声功率128 W。在此条件下测得桑叶单宁提取量为6.32 mg/g，总黄酮提取量为18.55 mg/g。结论：与传统方法相比，超声波辅助提取法具有提取时间短、提取温度低、提取率高、精确度高的优点，且同时提取总黄酮、单宁的效果较好，适合于桑叶中总黄酮、单宁分离测定的提取。

关键词：超声波；总黄酮；单宁；桑叶

Optimization of Simultaneous Ultrasonic-Assisted Extraction of Total Flavonoids and Tannins from Mulberry Leaves

ZHONG Yushen1, WANG Liqiong1, HAN Xiaodan1, HUANG Xianzhi2, DING Xiaowen1,*

(1. Key Laboratory of Processing and Storage of Agricultural Products of Chongqing, College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China; 2. Institute of Bombycology and Biology, Southwest University, Chongqing 400716, China)

Abstract: Ultrasonic-assisted extraction was adopted to simultaneously extract total flavonoids and tannins from mulberry leaves and these two classes of compounds were spectrophotometrically determined. Results showed that the best conditions for simultaneous ultrasonic-assisted extraction of total flavonoids and tannins from mulberry leaves were as follows: ethanol concentration, 75%; material to liquid ratio, 1:30; extraction temperature, 80 ℃; extraction time, 10 min; and ultrasonic power, 128 W. The yields of tannins and total flavonoids were 6.32 mg/g and 18.55 mg/g, respectively under these optimized conditions. Compared with the traditional extraction methods, UAE achieved a higher extraction efficiency and a higher accuracy in a shorter time at a lower extraction temperature, making it an appropriate method to extract total flavonoids and tannins from mulberry leaves.

Key words: ultrasonic; total flavonoids; tannins; mulberry leaves

中图分类号：TS218 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2015）12-0044-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201512008

桑树在我国已有4 000多年的栽培历史，具有较高的经济、药用价值。近年来桑园种植的面积增加很快，但对桑叶的利用除桑蚕养殖外，应用较少，出现了桑叶过剩的现象[1-2]。因此开发桑叶的新用途，不仅可以提高桑叶的利用价值，还可以增加蚕桑产业的经济效益和社会效益。

单宁作为一种具有较高功能价值的酸性物质，其抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、抑菌性等作用被逐步揭示[3-5]。然而我国单宁的来源主要依靠进口，价格非常昂贵。如果能利用桑叶提取单宁，不但可以提高桑叶的附加值，还可以增加单宁的来源。黄酮类化合物中的许多种类具有较高的药用价值，研究表明其在抗菌、抗氧化、抗肿瘤、降血脂、抑制心血管疾病等方面均具有较好的功效[6-9]。

国内外对总黄酮、单宁提取的研究较多，但从桑叶中同时提取总黄酮、单宁的报道却并不多见。目前提取桑叶单宁、总黄酮主要采用的是回流提取法，但该方法有提取率低、生产周期长的缺点，本研究中所使用的超声波辅助提取法则具有收率高、速率快、能耗低等特点[10-12]。为了充分利用桑叶这一优良的植物资源，本实验对超声波辅助同时提取桑叶中总黄酮、单宁的工艺条件进行了优化，以期为桑叶中这两类物质的快速分离、测定提供新的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

嘉陵江2号桑叶粉（Morus alba） 西南大学桑园；芦丁标准品（纯度≥98%） 北京德威钠生物技术有限公司；单宁酸标准品（纯度≥99%） 美国Sigma-Aldrich公司；常用化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

KQ5200DB型超声波清洗机 昆山市超声仪器有限公司；SHZ-Ⅲ循环水真空泵 上海亚荣生化仪器厂；Centrifuge5810型离心机 德国Eppendorf公司；UV2450S（E）紫外-可见分光光度计 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 样品总黄酮含量的测定

芦丁标准曲线的绘制：称取120 ℃条件下常压干燥至质量恒定的芦丁标准品0.015 0 g，用70%乙醇溶液溶解并定容至50 mL，其质量浓度为0.30 mg/mL。分别准确量取芦丁标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于25 mL容量瓶中，亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定吸光度[13-16]，以芦丁质量浓度（mg/mL）为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线并得到回归方程。

测定样品总黄酮含量时需先进行提取，取1.00 g桑叶粉于50 mL离心管中，加入体积分数为70%的乙醇溶液，放入超声波清洗机中提取，提取完毕后，于5 000 r/min离心2 min，取出上清液，在残渣中加入乙醇溶剂再提取，重复3 次，合并上清液并离心、过滤，收集滤液，定容至100 mL待测。测定时取25 mL用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定其吸光度[17]。

1.3.2 样品单宁含量的测定

单宁酸标准曲线的绘制：准确称取单宁酸0.010 g，用纯水溶解并定容至100 mL，其质量浓度为0.10 mg/mL。分别准确吸取单宁酸标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于50 mL容量瓶中，加Folir-Denis试剂2.5 mL及饱和碳酸钠溶液5 mL，加水稀释至刻度并充分混合，静置30 min后，在750 nm波长处测其吸光度[18-19]。以单宁酸质量浓度（μg/mL）为横坐标、吸光度A为纵坐标绘制标准曲线并得到回归方程。

测定样品单宁含量时，取1.0 mL 1.3.1节已提取并定容至100 mL的待测样液，加Folir-Denis试剂2.5 mL及饱和碳酸钠溶液5 mL，加水稀释至刻度并充分混合，静置30 min后在750 nm波长处测其吸光度。

1.3.3 单因素试验

1.3.3.1 乙醇体积分数对提取效果的影响

料液比1∶20（g/mL）、提取温度60 ℃、提取时间10 min、超声功率80 W的条件下，考察乙醇体积分数分别为50%、60%、70%、80%、90%对桑叶中总黄酮和单宁提取量的影响，筛选出较佳乙醇体积分数。

1.3.3.2 料液比对提取效果的影响

乙醇体积分数70%、提取温度60 ℃、提取时间10 min、超声功率80 W条件下，分别按1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的料液比加入70%乙醇溶液处理桑叶，考察料液比对桑叶中总黄酮和单宁提取量的影响，筛选出较佳料液比。

1.3.3.3 提取温度对提取效果的影响

乙醇体积分数70%、料液比1∶20、提取时间10 min、超声功率80 W条件下，分别按30、40、50、60、70、80 ℃的提取温度处理桑叶，考察提取温度对桑叶中总黄酮和单宁提取量影响，筛选出较佳提取温度。

1.3.3.4 提取时间对提取效果的影响

乙醇体积分数70%、料液比1∶20、提取温度60 ℃、超声功率80 W条件下，分别按每次5、10、15、20、25 min的提取时间处理桑叶，考察提取时间对桑叶中总黄酮和单宁提取量的影响，筛选出较佳提取时间。

1.3.3.5 超声功率对提取效果的影响

乙醇体积分数70%、料液比1∶20、提取时间10 min、提取温度为60 ℃条件下，分别按64、80、96、112、128、144、160 W超声功率处理桑叶，考察超声功率对桑叶中总黄酮和单宁提取量的影响，筛选出较佳超声功率。

1.3.4 正交试验优化超声波提取条件

在上述单因素试验的基础上，选择对桑叶中单宁、总黄酮提取量影响比较大的因素，较好的水平进行正交试验，得到用超声波同时提取桑叶单宁、总黄酮的最优因素水平。

1.4 数据处理

每组实验均重复3 次以上，所得实验数据为

±s。用Excel 2003分析、处理相关数据，用Origin 7.5作图。

2 结果与分析

2.1 芦丁、单宁酸标准曲线回归方程

芦丁标准曲线线性回归方程为：y=11.622x－0.003 1，r=0.999 7。单宁酸标准曲线线性回归方程为：y=0.089 9x＋0.004 2，r=0.999 7。上述标准曲线线性回归方程的相关系数均大于0.999，表明方程的线性关系良好，可用于样品总黄酮、单宁含量的测定。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 乙醇体积分数对提取效果的影响

总黄酮在乙醇中有较好的溶解度，单宁酸的极性较强，根据相似相溶原理，选用乙醇作为提取溶剂[20-21]。乙醇体积分数对桑叶总黄酮、单宁提取效果的影响如图1
所示。

图 1 乙醇体积分数对提取量的影响

Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction efficiency

由图1可知，其他条件一定时，单宁和总黄酮的提取量均随乙醇体积分数的增加呈先增大后减小的趋势，当乙醇体积分数为70%时，总黄酮、单宁在乙醇中的溶解度达到最高，提取量达到最大，分别为9.69 mg/g和6.26 mg/g。因此，选取70%为较佳的乙醇体积分数。

2.2.2 料液比对提取效果的影响

料液比是考察物质提取效果的重要因素，选择最佳的料液比不仅可以将所需物质提取充分，还能避免试剂的浪费。料液比对桑叶总黄酮、单宁提取量的影响如图2所示。

图 2 料液比对提取量的影响

Fig.2 Effect of material/liquid ratio on extraction efficiency

由图2可知，其他条件一定，当料液比达到1∶20时桑叶单宁提取量达到最大，为6.38 mg/g；料液比为
1∶25时桑叶总黄酮提取量达到最大，为9.70 mg/g，单宁的提取量也达到6.37 mg/g。综合考察同时提取的效果、单位溶剂的提取效率及最大产出比，将较佳的料液比定为1∶25。

2.2.3 提取时间对提取效果的影响

通常情况下目标物质的提取量随着超声时间的延长而增大，在得到充分提取后则开始下降[22]。提取时间对桑叶总黄酮、单宁提取效果的影响如图3所示。

图 3 提取时间对提取量的影响

Fig.3 Effect of ultrasonication time on extraction efficiency

由图3可知，其他条件一定，当提取时间为10 min时单宁提取量达到最大，为6.79 mg/g，此后随时间的延长而减小，表明10 min时单宁得到了充分提取。而当提取时间延长到15 min时总黄酮提取量达到最大为19.16 mg/g。
充分考察同时提取的效果、成本控制和实验消耗等因素，将较佳的提取时间定为10 min。

2.2.4 提取温度对提取效果的影响

超声提取时，目标物质均存在着一个最适提取温度，在该温度条件下提取量达到最大[12]。提取温度对桑叶总黄酮、单宁提取效果的影响如图4所示。

图 4 提取温度对提取量的影响

Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

由图4可知，其他条件一定，当提取温度为70 ℃时单宁、总黄酮提取量均达到最大，分别为7.14 mg/g和18.30 mg/g，这表明70 ℃为二者的最适提取温度。因此将较佳的提取温度定为70 ℃。

2.2.5 超声功率对提取效果的影响

图 5 超声功率对提取量的影响

Fig.5 Effect of ultrasonic powers on extraction efficeincy

提高超声功率可利用超声波的机械效应，增大介质分子的运动速率，从而增大介质分子与生物分子的摩擦力，使目标成分更多地溶解于溶剂中[23]。超声功率对桑叶总黄酮、单宁提取效果的影响如图5所示。

由图5可知，在试验功率范围内，桑叶总黄酮提取量在16.37～18.73 mg/g之间，单宁提取量在5.68～7.46 mg/g之间，且二者提取量随超声功率的增大并无明显的增大或减小趋势，表明超声功率对桑叶总黄酮、单宁提取效果的影响是有限的。因此不将超声功率作为考察的因素。

通过单因素试验得到同时提取桑叶总黄酮、单宁较好提取条件是乙醇体积分数70%、料液比1∶25、提取时间10 min、提取温度70 ℃，超声功率固定在128 W。

2.3 正交试验结果

在单因素试验的基础上，以对桑叶总黄酮、单宁提取量影响较大的因素和较好的条件作为因素水平进行正交试验，优化出提取桑叶中总黄酮和单宁的最佳条件。综合考虑同时提取桑叶总黄酮、单宁时二者的提取量、提取条件及实验消耗，以总评分的方式考察二者的综合提取效果，且将总黄酮、单宁的评分比重分别定为40%、60%。正交试验结果如表1所示。

表 1 正交试验设计与结果

Table 1 Results of orthogonal array design

由表1可知，在正交试验范围内得到的最佳试验条件为A3B3C3D1，即乙醇体积分数75%、料液比1∶30、提取温度80 ℃、提取时间10 min、超声功率128 W，在此条件下进行验证实验，测得桑叶的单宁提取量为6.32 mg/g，总黄酮提取量为18.55 mg/g。

为了验证单宁、总黄酮测定结果的准确度，取一定量桑叶粉并分别加入单宁标品1.0、2.0、3.0 mg和芦丁标品12.0、23.4、46.1 mg，在最佳条件下提取并测定其中单宁、总黄酮的含量。单宁的回收率在85%～92%之间，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）小于5%；总黄酮的回收率在94%～104%之间，RSD小于5%，符合对该指标的分析要求。

2.4 超声波辅助提取桑叶总黄酮、单宁与传统提取方法的比较

提取桑叶总黄酮的传统方法为回流提取法[24]。用该方法得到的桑叶总黄酮提取量及其与超声波辅助提取法的对比如表2所示。

表 2 回流提取与超声波辅助提取对比

Table 2 Comparison between reflux extraction and
ultrasonic-assisted extraction

提取桑叶单宁的传统方法为热水提取法[25]。用该方法得到的桑叶单宁提取量及其与超声波辅助提取法的对比如表3所示。

表 3 热水提取与超声波辅助提取对比

Table 3 Comparison between hot water extraction and
ultrasonic-assisted extraction

由表2、3可知，超声波辅助提取桑叶总黄酮、单宁得到的提取量均大于二者的传统提取方法，且精确度更高。此外，综合分析各方法的提取条件，超声波辅助提取法与回流提取法、热水提取法相比均具有提取时间短、提取温度低的优点。

3 结 论

通过单因素试验和正交试验优化，确定超声波同时提取桑叶总黄酮、单宁的最佳提取条件为乙醇体积分数75%、料液比1∶30、提取温度80 ℃、提取时间10 min、超声功率128 W，在此条件下测得的单宁提取量为6.32 mg/g，总黄酮提取量为18.55 mg/g，回收率分别在在85%～92%之间和94%～104%之间，RSD小于5%。相比于传统工艺对单一物质的提取研究，本实验的工艺条件可使桑叶中总黄酮、单宁的提取量均达到较高水平，适于桑叶中总黄酮、单宁的同时提取。

与传统的回流提取法、热水提取法相比，超声波辅助提取法具有提取时间短、提取温度低、提取率高、精确度高的优点，且同时提取总黄酮、单宁时可使二者的提取量均达到较高水平，提取效果较好，适合于桑叶中总黄酮、单宁分离测定的提取。

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