正交试验优化黄河鲤鱼鳞酶促溶性
胶原蛋白提取工艺

肖 枫1,2，朱文学1,*，康怀彬1，刘丽莉1，贺家亮1，任国艳1

（1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023；2.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013）

摘 要：为提高黄河鲤鱼鳞胶原蛋白提取率，在4 ℃条件下，采用胃蛋白酶和0.5 mol/L乙酸溶液对其提取工艺进行研究，在单因素试验的基础上，采用正交试验设计方法探索了提取时间、加酶量和料液比3 个因素对黄河鲤鱼鳞酶促溶性胶原蛋白（pepsin soluble collagen，PSC）提取率的影响。结果表明，黄河鲤鱼鳞PSC的最适提取工艺参数为提取时间60 h、加酶量40 kU/g和料液比1∶10（g/mL），在此条件下，PSC提取率达到（17.7±0.7）%。所提取的产品与酸溶性胶原蛋白（acid soluble collagen，ASC）有相似的电泳性质和氨基酸组成，表明其可能与ASC具有相似的分子结构。

关键词：黄河鲤鱼鳞；胶原蛋白；提取工艺

Orthogonal Array Design for the Optimization of Pepsin Soluble Collagen Extraction from
Cyprinus carpio haematopterus Scale

XIAO Feng1,2, ZHU Wenxue1,*, KANG Huaibin1, LIU Lili1, HE Jialiang1, REN Guoyan1

(1. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China;

2. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

Abstract: Pepsin and 0.5 mol/L acetic acid were used to enhance the extraction of collagen from Cyprinus carpio haematopterus scale at 4 ℃. Using combination of single factor experiments and orthogonal array design, the effect of extraction time, enzyme concentration and ratio of solid to solvent on the yield of pepsin soluble collagen (PSC) from
C. haematopterus scale were explored. The results showed that the optimal conditions for PSC extraction were determined as follows: extraction time, 60 h; enzyme concentration, 40 kU/g; and ratio of solid to solvent, 1:10 (g/mL). The yield of PSC under these conditions was (17.7 ± 0.7)%. The PSC had electrophoretic properties amino acid composition similar to those of acid soluble collagen (ASC), suggesting similarity beween their molecular structures.

Key words: Cyprinus carpio haematopterus scale; collagen; extraction process

中图分类号：TS254.9 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2015）12-0060-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201512011

胶原蛋白是脊椎动物的主要结构蛋白，约占动物总蛋白含量的30%[1]。胶原蛋白是一个庞大而复杂的蛋白质家族，迄今为止研究人员已经从众多原料中分离并鉴定出21 种不同类型的胶原蛋白[2]。它们广泛分布在动物的皮肤、骨骼、腱、血管和肌肉组织中，以维持组织和器官的稳定和结构完整。特别是Ⅰ型胶原蛋白存在于所有脊椎动物的结缔组织中[3]。鱼鳞是生产胶原蛋白的重要原料，可作为哺乳动物原料的有效替代品。通常采用传统的酸提取法制备酸溶性胶原蛋白，其提取率较低，而胃蛋白酶能够打开胶原蛋白端肽区域的肽链，从而促进胶原蛋白的溶出[4]。

由于具有独特的理化特性和功能特性，水产胶原蛋白的研究已经广受关注[5-9]。目前，对水产胶原蛋白的研究主要集中在海洋水产动物[3-6,9-16]，而对淡水鱼类[17-20]胶原蛋白的研究较少，有关黄河鲤鱼鳞胶原蛋白的提取工艺、理化特性、功能性质、分子类型、组成结构等有待研究。本实验以黄河鲤鱼鳞为原料，采用胃蛋白酶促溶提取工艺，在单因素试验的基础上，利用正交试验设计对影响鱼鳞胶原蛋白提取效率较大的影响因素进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜黄河鲤鱼 河南三佳食品有限公司。

胃蛋白酶 美国Sigma公司；冰乙酸、柠檬酸、乙酸钠、对二甲氨基苯甲醛、高氯酸、氯胺-T等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

722N型分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；Fs4111型电子分析天平 上海衡平仪器仪表厂；HR152型电热恒温水浴锅 金坛市晶玻实验仪器厂；氨基酸自动分析仪 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 羟脯氨酸含量的测定

取鱼鳞样品约0.2 g于安培瓶中，加入6 mol/L的盐酸2 mL，封口后于130 ℃水解4 h。利用NaOH溶液中和，定容至100 mL。取2 mL水解液加入1 mL氯胺试剂，摇匀，室温条件下放置20 min，加入1 mL发色剂（溶解10 g对二甲胺基苯甲醛于35 mL 60%高氯酸溶液中，缓慢地加入65 mL异丙醇，并不断搅动，制备液当天使用），充分混合，于60 ℃水浴加热20 min，冷却后在558 nm波长处测其吸光度，同时做空白实验。配制不同质量浓度羟脯氨酸溶液按照上述方法测定吸光度，制作标准曲线。鱼鳞胶原蛋白提取率计算公式如下：

1.3.2 鱼鳞的预处理

先酸后碱处理：称取2.0 g鱼鳞，按料液比1∶10（g/mL）加入1 mol/L的HCl溶液浸泡2 h，用蒸馏水清洗干净。再按1∶10（g/mL）的比例加入0.1mol/L的NaOH溶液浸泡24h去除杂蛋白。按1.3.1节方法测定鱼鳞中羟脯氨酸的质量，计算样品中胶原蛋白的质量分数。

先碱后酸处理：称取2.0 g鱼鳞，按1∶10（g/mL）的比例加入0.1 mol/L的NaOH溶液浸泡24 h去除杂蛋白，用蒸馏水清洗干净。再按料液比1∶10（g/mL）的比例加入1 mol/L的HCl溶液浸泡2 h。按1.3.1节方法测定鱼鳞中羟脯氨酸的质量，计算样品中胶原蛋白的质量分数（湿基）。

以处理后样品中胶原蛋白的质量分数来表示杂蛋白脱除的效果，样品中胶原蛋白质量分数越高表明杂蛋白的脱除率越高。

1.3.3 鱼鳞胶原蛋白提取单因素试验

采用0.5 mol/L乙酸溶液提取鱼鳞酸溶性胶原蛋白（acid soluble collagen，ASC），以提取ASC后的残渣作为研究对象，采用胃蛋白酶辅助的方法进行胃蛋白酶促溶性胶原蛋白（pepsin soluble collagen，PSC）的提取。选择提取时间（24、36、48、60、72 h）、加酶量（20、30、40、50、60 kU/g）和料液比（1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14（g/mL））作为影响因素，计算PSC提取率。

1.3.4 鱼鳞PSC提取正交试验

在单因素试验结果的基础上，以提取时间、加酶量和料液比为影响因素，各取3 个水平，采用L9（34）正交试验设计，以PSC提取率为指标，确定黄河鲤鱼鳞PSC的最适提取工艺。试验的因素及水平见表1。

表 1 正交试验因素与水平

Table 1 Independent variables and their levels used in the
orthogonal array design

1.3.5 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析

参照文献[16]的方法并作适当的修改。使用垂直板电泳装置，分离胶质量分数为7.5%，浓缩胶质量分数为5%。分离胶配方为：去离子水3.3 mL，30%丙烯酰胺1.5 mL，10% SDS 100 µL，10%过硫酸铵100 µL，Tris-HCl（1.5 mol/L，pH 8.8）2.5 mL；电泳缓冲液为Tris-甘氨酸缓冲液（pH 8.3，含0.1% SDS）；样品缓冲液为pH 8.8的的Tris-HCl缓冲液；染色液为0.25%考马斯亮蓝、甲醇、去离子水混合；脱色液为7.5%甲醇、5%冰乙酸混合液。

1.3.6 氨基酸组成分析

将ASC和PSC样品分别用6 mol/L的HCl溶液于105 ℃水解24 h，采用氨基酸自动分析仪测定水解物的氨基酸组成。

2 结果与分析

2.1 酸碱处理顺序对鱼鳞预处理效果的影响

先利用HCl溶液脱除鱼鳞中的矿物质，再用碱液对其进行处理后，鱼鳞样品中胶原蛋白的质量分数（湿基）为（31.3±0.6）%；而根据已报道的相关文献中所采用的先碱液处理、再用HCl溶液处理的工艺对黄河鲤鱼磷进行处理后，鱼鳞样品中胶原蛋白的质量分数（湿基）为（19.5±0.9）%。可见，先用盐酸脱除鱼鳞中的矿物质、再用碱液处理更有利于鱼鳞杂蛋白的脱除，该处理组与先碱处理后酸处理组相比，鱼鳞样品中胶原蛋白质量分数显著提高（P＜0.01）。鱼鳞中除胶原蛋白外，还含有其他种类蛋白质，其中一些蛋白质可以在酸性、碱性或较高温度的水中溶出，因此，在提取鱼鳞胶原蛋白或明胶之前，有必要对其进行适当的处理以提高目标产物的纯度。根据相关的文献报道，对鱼鳞的前处理工艺基本是先采用一定料液比的NaOH溶液或NaCl溶液浸泡，以去除其中的杂蛋白，然后用一定料液比的酸溶液或乙二胺四乙酸溶液浸泡以脱除鱼鳞中的矿物质成分[16,18-19,21]。但是并没有关于处理工艺对其杂蛋白脱除效率影响的报道，也没有鱼鳞杂蛋白脱除工艺优化的研究报道。

实验结果表明，鱼鳞预处理流程对提高鱼鳞样品中胶原蛋白含量有显著影响（P＜0.01），因为鱼鳞在骨质层，矿物质与其中蛋白质等有机成分相结合，不利于其中蛋白质的溶出，而利用酸液脱除鱼鳞中矿物质后，鱼鳞的骨质层结构变得较为松散，杂蛋白与碱液接触更充分，因此脱除矿物质后更有利于鱼鳞中杂蛋白的溶出。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 提取时间对鱼鳞PSC提取率的影响

图 1 提取时间对PSC提取率的影响

Fig.1 Effect of extraction time on collagen yield

在加酶量40 kU/g、料液比1∶10（g/mL）条件下改变提取时间，测定鱼鳞PSC提取率。如图1所示，鱼鳞PSC提取率随提取时间的延长而提高，当提取时间超过60 h以后，提取率随提取时间的变化趋势较缓慢，提取率无显著变化（P＞0.05），因此选择60 h为较优提取时间。

2.2.2 加酶量对鱼鳞PSC提取率的影响

图 2 加酶量对PSC提取率的影响

Fig.2 Effect of enzyme concentration on collagen yield

在提取时间60 h、料液比1∶10（g/mL）的条件下研究加酶量对鱼鳞PSC提取率的影响。如图2所示，在加酶量0～40 kU/g范围内，提取率随加酶量的增大而迅速升高，继续提高加酶量则对提PSC提取率没有显著影响
（P＞0.05），因此选择加酶量40 kU/g作为较优水平。

2.2.3 料液比对鱼鳞PSC提取率的影响

图 3 料液比对PSC提取率的影响

Fig.3 Effect of ratio of solvent to solid on collagen yield

在提取时间60 h、加酶量40 kU/g的条件下研究料液比对鱼鳞PSC提取率的影响。如图3所示，PSC提取率随溶剂用量的增大呈增加趋势，表明溶剂用量的增大有利于鱼鳞中胶原蛋白的溶出。当料液比达到1∶10（g/mL）之后时，PSC提取率没有显著变化（P＞0.05），考虑实际生产的需要，选择1∶10（g/mL）作为较优水平。

2.3 黄河鲤鱼鳞PSC提取工艺优化结果

根据单因素试验的结果，选择提取时间、加酶量和料液比3 个因素按L9（34）正交设计表（表1）进行正交试验，正交试验结果及数据分析如表2所示。试验结果的极差分析表明，对黄河鲤鱼鳞酶促溶性PSC提取率影响最大的是提取时间，其次是加酶量，料液比的影响最小。

表 2 正交试验设计及结果

Table 2 Orthogonal array design and experimental results

如表3方差分析所示，可以看出提取时间和加酶量对黄河鲤鱼鳞PSC提取率有显著影响（P＜0.05），而料液比因素在试验中对鱼鳞PSC的提取率没有显著影响，对试验因素各水平进行最小显著差数法多重比较，结果表明提取时间和加酶量的1水平与2、3水平存在显著差异，2、3水平之间没有显著差异，而料液比各水平间均没有显著差异。根据试验结果的极差分析（表2），黄河鲤鱼鳞PSC提取率最优水平组合为A3B3C3，结合试验结果的方差分析，考虑到实际生产的方便，可修正黄河鲤鱼鳞PSC提取工艺最优组合为A2B2C2，即提取时间60 h、加酶量40 kU/g和料液比1∶10（g/mL）。

表 3 方差分析表

Table 3 Analysis of variance

在修正过的最优工艺条件下进行验证实验，重复3 次，其结果为黄河鲤鱼鳞PSC提取率为（17.7±0.7）%，因此，该工艺参数可以应用于黄河鲤鱼鳞PSC的提取。

2.4 黄河鲤鱼鳞PSC的SDS-PAGE分析

1. Marker；2. ASC；3. PSC。

图 4 黄河鲤鱼鳞胶原蛋白的SDS-PAGE图谱

Fig.4 SDS-PAGE patterns of collagens from
Cyprinus carpio haematopterus scale

图4中α1-带的强度大约是α2-带的2倍，表明黄河鲤鱼鳞胶原蛋白的分子可能为两条α1-链和一条α2-链构成，或者由α1-链、α2-链和α3-链各一条构成，可以看出，黄河鲤鱼鳞PSC属于Ⅰ型胶原。这与许多鱼类胶原蛋白如鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）[20]皮胶原、比目鱼（Paralichthys olivaceus）[22]皮胶原、鲤鱼（Cyprinus carpio）[23]皮和鳞胶原等类似。

由图4可知，黄河鲤鱼鳞PSC与ASC有相似的电泳图谱，但是PSC分子中α1-链和α2-链的分子质量较ASC要低，说明PSC与ASC的主体结构一致，但PSC只含有胶原的3 股螺旋主体结构，胃蛋白酶能够断开端肽区的交联分子，但不能破坏3 股螺旋的完整结构，因此，对于酸法难以提取的胶原蛋白，利用胃蛋白酶处理可以有效提高胶原蛋白提取率。

2.5 黄河鲤鱼鳞氨基酸组成分析

表 4 黄河鲤鱼鳞胶原蛋白氨基酸构成

Table 4 Amino acid composition of collagens from
Cyprinus carpio haematopterus scale

残基数/1 000 个

如表4所示，黄河鲤鱼鳞PSC的氨基酸组成与其他胶原蛋白类似，其中所含Gly比例最高（约为总氨基酸数量的1/3），而Tyr、His、Phe、Ile和Met所占比例较低。相对于Ⅰ型胶原蛋白而言，黄河鲤鱼鳞PSC中Met和Phe所占比例较高，而胶原蛋白的特征氨基酸Hyp的比例较低。其亚氨基酸（Hpy和Pro）残基所占比例分别为18.2%和19.8%，低于猪皮胶原蛋白的22%和Ⅰ型胶原蛋白的21.5%[18]，但是与一些鱼皮和鱼鳞的胶原蛋白比较接近[18,24]。黄河鲤鱼鳞PSC与ASC在氨基酸组成上比较接近，与其电泳图谱一致，表明黄河鲤鱼鳞PSC与ASC可能具有相似的理化特性。

3 结 论

先脱除黄河鲤鱼鳞中矿物质，再采用碱液处理，可以显著提高鱼鳞样品中胶原蛋白的含量，即脱除矿物质的处理更有利于鱼鳞样品中非胶原蛋白成分的脱除。所得产品与传统酸性介质提取的酸溶性胶原蛋白具有一致的分子结构和组成，胃蛋白酶可以促进黄河鲤鱼鳞中难溶性胶原蛋白溶出，提取时间、加酶量和料液比是影响黄河鲤鱼鳞PSC提取率的重要因素，通过单因素试验和正交试验确定黄河鲤鱼鳞PSC的提取工艺参数为提取时间60 h、加酶量40 kU/g和料液比1∶10（g/mL），提取率可达（17.7±0.7）%。胃蛋白酶不能破坏黄河鲤鱼鳞胶原蛋白的主体结构，所得PSC与ASC具有相似的电泳性质和氨基酸组成，电泳图谱表明黄河鲤鱼鳞PSC与ASC一样为典型的Ⅰ型胶原蛋白。

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