角鲨烯国家标准样品的研制

陈伟珠1,2,晋文慧1,方 华1,谢全灵1,张怡评1,洪 专1,*

(1.国家海洋局第三海洋研究所,福建 厦门 361005;

2.厦门大学化学化工学院,化学生物学福建省重点实验室,福建 厦门 361005)

 

摘 要为研制角鲨烯国家标准样品。以角鲨烯粗品为原料,制备高纯角鲨烯,采用红外光谱、高分辨质谱和核磁共振谱进行结构确证。样品分装成150 瓶后,采用气相色谱-氢火焰离子化检测器法进行均匀性、稳定性检验和定值分析。从样品中随机抽取15 瓶进行均匀性检验,经F检验表明在95%置信区间范围内样品均匀性良好;稳定性考察按照-18 ℃长期实验稳定性(24 个月)进行,结果表明在考察期间内样品稳定性良好;标准样品经国内8 家具有分析资质的实验室进行协同定值,并评定了定值结果的不确定度,角鲨烯标准样品定值结果为99.57%,相对扩展不确定度为0.30%(k=1.96)。该标准样品达到国家标准样品的技术要求,可用于有关角鲨烯的方法校正和质量控制。

关键词:角鲨烯;标准样品;气相色谱-氢火焰离子化法;定值;不确定度

 

Development of Squalene Certified Reference Material

 

CHEN Weizhu1,2, JIN Wenhui1, FANG Hua1, XIE Quanling1, ZHANG Yiping1, HONG Zhuan1,*

(1. Third Institute of Oceanography, State Oceanic Administration, Xiamen 361005, China;

2. The Key Laboratory for Chemical Biology of Fujian Province, College of Chemistry and Chemical Engineering,

Xiamen University, Xiamen 361005, China)

 

Abstract: Squalene certified reference material was developed by purification of crude squalene. The structure of the certified reference material was confirmed by infrared spectroscopy (IR), high resolution mass spectrometry (HRMS) and nuclear magnetic resonance (NRM) and squalene was divided into 150 aliquots. The homogeneity and stability tests and quantitative analysis were carried out by gas chromatography-flame ionization detection (GC-FID). Fifteen randomly selected aliquots showed good homogeneity as indicated by F-test analysis at a 95% confidence interval. The test samples were stable at −18 ℃ for 24 months. A cooperative certification was conducted with 8 qualified laboratories. The certified purity value of the reference material was 99.57% with a relatively expanded uncertainty of 0.30% (k = 1.96). The reference material can conform to the technical requirement of the certified reference material. This material was intended for use in the method validation and quality control regarding squalene.

Key words: squalene; certified reference material; gas chromatography-flame ionization detection (GC-FID);
certification; uncertainty

中图分类号:P745 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2015)12-0166-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201512031

角鲨烯,又称鱼肝油萜,也称鲨烯,是一种天然的开链三萜烯类、多不饱和脂肪族烃类化合物,含有6 个非共轭双键,是由日本化学家于1906年在鲨鱼的肝油中发现的,是人类从动物组织中最早发现的烃类化合物[1-2],其化学名称为2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯[3]。目前,角鲨烯主要来自于深海鲨鱼肝油,同时也少量存在于油脂不皂化物中,尤其在橄榄油、棕榈油及其脱臭馏出物中含量较多,菜籽油、大豆油、米糠油、棉籽油等植物油也含有一定量的角鲨烯[4-5]。角鲨烯在体内参与胆固醇的生物合成及多种生化反应,促进机体新陈代谢,提高机体的防御机能及应激能力,具有抗衰老、抗肿瘤和提高免疫调节等多种生理功能,可广泛地应用于化妆品、医药、食品等多个行业[6-7]。市场上角鲨烯相关的产品不计其数,产品中角鲨烯的含量检测需要角鲨烯标准样品作为检测对照;且在角鲨烯的相关研究和开发中,也需要角鲨烯标准样品作为检测基准,但是目前国内外尚无角鲨烯标准样品。因此迫切需要开展角鲨烯标准样品的研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

正己烷、甲醇(均为色谱纯) 德国默克公司;实验用水均来自Milli-Q纯水系统。

1.2 仪器与设备

7890A系列气相色谱(gas chromatography,GC)仪(配有氢火焰离子检测器(flame ionization detection,FID)) 美国Aglient公司;HP-8452型紫外-可见分光光度计 美国惠普公司;Nicolet Ftir-670型红外光谱仪 美国Thermo Scientific公司;LCT PremierTM XE型高分辨质谱仪 美国Waters公司;AL/104型天平 瑞士梅特勒-托利多集团;Milli-Q纯水机 美国Milli-Pore公司;New style半制备液相仪 江苏汉邦科技公司。

1.3 方法

1.3.1 角鲨烯样品的制备

957555.jpg 

957578.jpg 

图 1 角鲨烯粗品的高效液相色谱图(A)和单体的GC图(B)

Fig.1 Semi-preparative HPLC and GC profiles of squalene

以角鲨烯粗品为原料,经高效液相色谱纯化分离,收集主峰,去纯溶剂,获得角鲨烯单体。制备角鲨烯样品液相色谱条件:SB-C18色谱柱(150 mm×21.2 mm,4.6 µm);流动相:甲醇;检测波长210 nm;流速15 mL/min;进样量0.5 mL;样品质量浓度10 mg/mL(正己烷溶解)。

制备角鲨烯样品液相色谱图如图1A所示,角鲨烯主峰约在22 min出峰,收集该主峰流出液,去除溶剂,得到的角鲨烯单体经GC法检测,纯度大于99%,色谱图见图1B。

1.3.2 定性分析

采用红外吸收光谱、高分辨质谱及核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)谱等对角鲨烯标准样品进行定性分析。

1.3.3 定值分析

标准样品定值一般情况下采用技术有效、严谨认可的方法来完成。目前,关于角鲨烯检测方法有GC法[8-13]、GC-质谱法[14-16]、高效液相色谱法[2,7,17-20]以及超高效液相色谱法[21],但是尚无统一的国家标准或行业标准,所以本实验参考文献[10]采用GC-FID法。

GC-FID条件:HP-5色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 µm);柱流量1.0mL/min;分流进样(分流比130);进样量1 µL;进样口温度300 ℃;升温程序:初始柱温160 ℃,保持2 min,以速率15 ℃/min升至280 ℃,保持5 min,再以5 ℃/min升至300 ℃,保持8 min;FID温度330 ℃;进样口压力15 psi;载气为高纯氮气(99.999%),流速1 mL/ min,尾吹25 mL/ min;燃烧气:氢气,流速30 mL/ min;助燃气:空气,流速400 mL/min。

1.3.4 样品配制

取本品10 mg置于10 mL容量瓶中,加正己烷稀释至刻度,即得。

1.3.5 均匀性检验

标准样品均匀性是指特性量值在空间分布的均匀程度,它是对标准物质样品总体空间分布的评价,是标准样品的重要质量指标之一。对同一批制备的角鲨烯样品进行分装,每瓶标准样品净质量为50 mg,共150 瓶。按照GB/T 15000.3—2008《标准样品工作导则(3)标准样品:定值的一般原则和统计方法》[22]规定,本项目确定抽样数目为15 个,采用单因素多水平试验方差分析法对角鲨烯标准样品进行纯度均匀性检验,测定方法采用GC-FID,每个样品重复测3 次。检测数据用方差分析法进行分析以判断标准样品的均匀性是否合格。

1.3.6 稳定性检验

考察样品的稳定性,确定其有效期,取本标准样品模拟上市包装,进行-18 ℃、24 个月长期实验,分别于0、1、3、6、9、12、18、24 个月取样检测,通过考察标准样品纯度的变化来研究样品的稳定性。稳定性检测方法与均匀性检测的方法相同,均采用GC-FID法,每份样品连续进样2 次,然后用归一法求出其纯度的平均值。

2 结果与分析

2.1 角鲨烯的定性分析

角鲨烯通过红外光谱、高分辨质谱及NMR谱进行定性分析。

2.1.1 角鲨烯的红外光谱分析

表 1 角鲨烯红外光谱数据表

Table 1 IR spectral parameters of squalene

波数/cm-1

振动类型

基团

强度

2 969,2 854

v(CH3)伸缩振动

CH3

s

2 920

v(CH2)不对称伸缩振动

CH2

m

1 666

v(=CH)伸缩振动

=CH

m

1 443

δ(CH2)变形振动

与双键相连的CH2

s

1 379

δ(C—H)变形振动

—CH3

s

835

ω(C—H)非平面摇摆振动

=C—H

s

 

注:s.强峰;m.中等强峰。

 

如表1所示,波数为2 969、2 854、1 380 cm-1说明样品结构中存在CH3。波数为2 922、1 443 cm-1说明样品结构中存在与双键相连的CH2。波数为1 666、835 cm-1说明样品结构中存在三取代的烯烃。

2.1.2 角鲨烯的高分辨质谱分析

高分辨质谱测得的角鲨烯加钠离子[C30H50+Na]+精确质荷比为m/z 433.379 7,与理论值(433.380 5)一致。

2.1.3 角鲨烯的NMR图谱分析

对该样品进行NMR测试,核磁数据见表2。与文献[23]报道的角鲨烯核1H NMR图谱和13C NMR图谱等数据一致。从样品的红外光谱、高分辨质谱和NMR谱证明了所研制的样品是角鲨烯,结构式见图2。

957608.jpg 

图 2 角鲨烯的化学结构式

Fig.2 Chemical structure of squalene

表 2 角鲨烯的NMR数据表

Table 2 NMR data of squalene

峰序号

δC(100 MHz)

 

δH (多重性,400 MHz)

 

实测值

文献[23]值

 

实测值

文献[23]值

1(1’)

16.00

16.01

 

1.68(s,6H),CH3×2

1.71(s,6H),CH3×2

13(13’)

16.04

16.05

 

1.60(s,18H),CH3×6

1.63(s,18H),CH3×6

14(14’)

17.68

17.68

 

 

 

15(15’)

25.70

25.71

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6(6’)

135.10

135.09

 

 

 

10(10’)

134.89

134.89

 

 

 

2(2’)

131.24

131.22

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3(3’)

124.42

124.42

 

4.93~5.15(m),CH×6

5.11~5.18,CH×6

7(7’)

124.32

124.33

 

 

 

11(11’)

124.29

124.29

 

 

 

 

 

 

 

 

 

12(12’)

39.76

39.78

 

1.92~2.22(m),CH2×10

1.89~2.73,CH2×10

4(4’)

39.74

39.76

 

 

 

12(12’)

28.29

28.30

 

 

 

8(8’)

26.78

26.79

 

 

 

9(9’)

26.67

26.68

 

 

 

 

 

2.2 均匀性检验结果

标准样品的均匀性检验是标准样品研制过程中不可缺少的程序。因此在对样品进行分装后,对角鲨烯标准样品进行纯度均匀性检验,均匀性检验结果见表3、4。

表 3 角鲨烯标准品纯度均匀性检验结果

Table 3 Homogeneity of purified squalene

%

瓶号

测量1

测量2

测量3

平均值

1

99.45

99.48

99.47

99.46

11

99.43

99.46

99.45

99.45

21

99.44

99.42

99.41

99.42

31

99.43

99.42

99.40

99.42

41

99.46

99.45

99.43

99.45

51

99.47

99.50

99.48

99.48

61

99.49

99.41

99.43

99.44

71

99.46

99.45

99.42

99.44

81

99.45

99.40

99.44

99.43

91

99.45

99.45

99.40

99.44

101

99.40

99.44

99.46

99.43

111

99.46

99.43

99.40

99.43

121

99.44

99.43

99.42

99.43

131

99.44

99.41

99.44

99.43

141

99.44

99.43

99.44

99.43

 

表 4 角鲨烯均匀性方差分析的结果

Table 4 Results of variance analysis for the homogeneity of squalene

变差源

方差和

自由度

均方差

组间

0.011 371

14

0.000 812

组内

0.013 901

30

0.000 463

总和

0.025 271

55

 

 

 

统计量F值为1.75,小于F0.05(14,30)值2.04,说明在95%的置信区间,角鲨烯样品均匀性良好。

2.3 稳定性

取本标准样品,模拟上市包装,在温度-18 ℃条件下放置24 个月,分别于0、1、2、3、6、9、12、18、24 个月取样,按稳定性重点考察项目检测实验结果见
表5。根据GB/T 15000.3—2008的要求,采用直线模型作为经验模型,对长期稳定性获得的数据进行分析。

表 5 角鲨烯样品在-18 ℃贮存条件下的稳定性

Table 5 Stability of squalene at −18 ℃

时间/月

纯度/%

性状

0

99.89

无色油状液体

3

99.79

无色油状液体

6

99.79

无色油状液体

9

99.80

无色油状液体

12

99.84

无色油状液体

18

99.82

无色油状液体

24

99.87

无色油状液体

 

 

斜率b1按公式(1)计算:

960757.jpg (1)

式中:Xi为每次检测时间/月;Yi为每次检测纯度/%;

X

955040.jpg

为每次检测时间总和/间隔检测次数(

X

955069.jpg

=10.29月);

Y

954969.jpg

为检测纯度结果的平均值(

Y

954997.jpg

=99.83%)。

截距b0按公式(2)计算:

960780.jpg (2)

直线上点的标准差按公式(3)计算:

962183.jpg (3)

式中:n-2为自由度。

取其平方根S为0.042 802%,与斜率相关的不确定度按公式(4)计算:

960815.jpg (4)

自由度为n-2和P=0.95(95%置信水平)的学生t因子等于2.571。由于|b1|<t0.95(n-2)×sb1)=
2.571×0.002066%=0.005311%,故斜率是不显著的。因而未观测到不稳定性。长期实验稳定性的不确定度贡献度即成为:ults=sb×t=0.002066%×24=0.05%。直线模型分析的结果,表明角鲨烯标准样品在低温密闭环境中保存2 a稳定性良好。这说明在实际保藏条件下
(-18 ℃),角鲨烯的有效期可定为2 a。

2.4 定值结果及其不确定度评定

2.4.1 定值结果

本标准样品按照GB/T 15000.3—2008要求,采用多个实验室协作实验定值,选择获得国家或部门认可的、具备资质的8 家实验室进行样品定值。随机抽取8 瓶样品,每个定值实验室送1 瓶,采用GC-FID法进行测定,应用面积归一法进行定值,定值结果见表6。

表 6 角鲨烯的定值结果

Table 6 Certification results of squalene

%

序号

实验室名称

检测结果

平均

标准

1

2

3

4

5

6

1

厦门市产品质量监督检验院

99.54

99.54

99.55

99.55

99.56

99.57

99.55

0.01

2

福建省产品质量监督检验院

99.37

99.41

99.41

99.42

99.42

99.43

99.41

0.02

3

山东省分析测试中心

99.43

99.44

99.47

99.51

99.62

99.62

99.52

0.09

4

厦门市药品检验所

99.73

99.74

99.74

99.74

99.75

99.77

99.74

0.01

5

福建省药品检验所

99.48

99.49

99.50

99.51

99.58

99.58

99.52

0.04

6

厦门市出入境检验检疫技术中心

99.71

99.71

99.74

99.75

99.77

99.79

99.74

0.03

7

中国中医科学院中药研究所

99.59

99.64

99.65

99.66

99.66

99.67

99.65

0.03

8

北京理化测试中心

99.40

99.40

99.40

99.42

99.43

99.43

99.41

0.02

 

 

汇集各家实验室的检测数据后,对每家实验室的数据按大小顺序排列,用Grubb’s法和峰度法正态性检验组内数据的异常值。没有异常值,所有数据进行下一步统计,再用Grubb’s法对每家实验室的平均值进行检验,将其看成一组测定值进行异常值检验,无异常值。因此将各家实验室测得的数据作为无偏估计值,计算8 家测定结果的平均值及标准差。然后对各实验室测定结果的标准差进行Cochran检验,按公式(5)计算统计量:

962197.jpg (5)

式中:Si为各实验室测定结果的标准差;Smax为Si中的最大值。

C0.05(8,6)=0.360,C>C0.05(8,3),表明各实验室间的测量不属于等精度测量,因此计算加权平均值作为最佳值得到角鲨烯标准样品的定值结果。总平均值x=99.57%。

2.4.2 定值结果的不确定度评定

根据GB/T 15000.3—2008规定,定值结果由标准值和不确定度组成。标准样品特性标准值的测量不确定度UCRM由标准值定值实验的不确定度U(x)、均匀性检验的不确定度Ubb和稳定性检验的不确定度Ults组成。依据全部测定结果,计算角鲨烯标准样品的特性标准值和不确定度。

标准样品定值的不确定度为Uchar=0.14%。

均匀性检验的不确定度Ubb:瓶间方差按公式(6)计算:

962232.jpg (6)

式中:组间均方差、组内均方差数据来自表4。

瓶间标准差是该方差的平方根:

962221.jpg 

稳定性检验的不确定度Ults:由2.3节稳定性检验实验可知,ults=sb×t=0.002066%×24=0.05%,
标准样品定值结果的不确定度为957537.jpg,扩展不确定度为U95=kU=1.96×0.15%=0.30%。

通过上述统计学数据处理,角鲨烯标准样品的特性值定值结果为:特性标准值99.57%,置信度为95%的扩展不确定度值为0.30%。

3 结 论

研制角鲨烯标准样品,对其进行了均匀性检验、稳定性考察。考察结果表明该标准样品符合标准样品均匀性与稳定性的要求。研制的角鲨烯标准样品对食品安全、环境监测、卫生检验检疫等方面的测量和科学研究提供了技术支撑和量值溯源保证,具有重要意义。

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收稿日期:2014-10-30

基金项目:厦门海洋研究开发院共建项目(2014);海洋生物技术产业化中试技术研发公共服务平台项目(12PZP001SF10);

广东海洋经济发展区域示范项目(GD2012-D01-001)

作者简介:陈伟珠(1981—),女,助理研究员,硕士,研究方向为海洋天然产物标准样品研制与分析。E-mail:wzchen@tio.org.cn

*通信作者:洪专(1970—),男,高级工程师,博士,研究方向为海洋天然产物。E-mail:hzh@tio.org.cn