气相色谱-串联质谱法快速测定水果中咪鲜胺
及其代谢物2,4,6-三氯苯酚的残留量

卢俊文,李 蓉*,杨 芳,黄思允,陈丽斯

(中山出入境检验检疫局,广东 中山 528403)

 

摘 要:目的:建立基质分散固相萃取-气相色谱-串联质谱法快速测定水果中咪鲜胺及其代谢物2,4,6-三氯苯酚残留量的方法。方法:采用以乙腈作提取剂、以N-丙基乙二胺和十八烷基硅烷键合硅胶(C18)作为混合固相基质分散萃取净化剂的前处理方法,并利用气相色谱-串联质谱在多反应离子监测模式条件下进行检测,用基质匹配标准品的外标法定量。结果:咪鲜胺及其代谢物2,4,6-三氯苯酚在0.004~0.400 mg/kg范围内线性关系均良好,相关系数分别为0.999 4和0.999 2;在3 个添加水平(0.01、0.02、0.10 mg/kg)范围内的平均回收率分别为80.1%~101.5%和79.0%~97.4%,相对标准偏差分别为2.8%~6.8%和2.0%~6.0%,方法的定量限分别为0.004 mg/kg和0.005 mg/kg。结论:该方法前处理简单快速、灵敏度高、测定线性范围宽,可用于水果中咪鲜胺及其代谢物2,4,6-三氯苯酚残留的快速测定。

关键词:气相色谱-串联质谱;基质分散固相萃取;咪鲜胺;2,4,6-三氯苯酚;水果;残留

 

Rapid Determination of Residues of Prochloraz and Its Metabolite 2,4,6-Trichlorophenol in Fruits Using
Gas Chromatography with Tandem Mass Spectrometry

 

LU Junwen, LI Rong*, YANG Fang, HUANG Siyun, CHEN Lisi

(Zhongshan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhongshan 528403, China)

 

Abstract: Purpose: To develop a rapid method for the determination of residues of prochloraz and its metabolite, 2,4,6-trichlorophenol, in fruits using matrix dispersive solid-phase extraction and gas chromatography with tandem mass spectrometry (GC-MS-MS). Methods: Samples were extracted with acetonitrile, cleaned by matrix dispersive solid-phase extraction using PSA and C18, detected by GC-MS-MS under multiple reaction monitoring mode, and quantified by an external standard method using matrix-match standard solution. Results: In the linear range of 0.004-0.400 mg/kg, the correlation coefficients for prochloraz and 2,4,6-trichlorophenol were 0.999 4 and 0.999 2, respectively. Their average recoveries at spiked levels of 0.01, 0.02 and 0.10 mg/kg were 80.1%–101.5% and 79.0%-97.4% with relative standard deviations of 2.8%–6.8% and 2.0%–6.0%, respectively, and their limits of quantification (LOQ) (RSN = 10) were 0.004 and 0.005 mg/kg, respectively. Conclusions: The proposed method is simple and sensitive with a wide range of measurement, and can be suitable for the analysis of prochloraz and 2,4,6-trichlorophenol residues in fruits.

Key words: gas chromatography with tandem mass spectrometry (GC-MS-MS); matrix dispersive solid-phase extraction; prochloraz; 2,4,6-trichlorophenol; fruit; residue

中图分类号:TS255.7 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2015)12-0213-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201512040

咪鲜胺[1-2]化学名称:N-丙基-N-[2-(2,4,6-三氯苯氧基)乙基]咪唑-1-甲酰胺,又称施保克、菌百克、使百克、扑霉灵,是英国Boots公司(现在的德国艾格福公司)于1974年合成,1977年推向市场的一种咪唑类广谱杀菌剂,具有向顶性传导活性,其作用机理主要是通过抑制麦角甾醇的生物合成,使菌体细胞膜功能受破坏而起作用。对多种作物由子囊菌和半知菌引起的病害具有明显的防效,常用于防治柑橘的炭疽病、蒂腐病、青霉病、绿霉病,香蕉炭疽病、叶斑病及芒果炭疽病,也可用于水果采后处理,防治贮藏期病害。咪鲜胺在环境中首先降解为N-丙基-N-[2-(2,4,6-三氯苯氧基)乙基]脲(BTS44595)和N-醛基-N-丙基-N-[2-(2,4,6-三氯苯氧基)乙基]脲(BTS44596)[3-4],最终都降解为BTS45186,即2,4,6-三氯苯酚[5-8]。尽管咪鲜胺属低毒杀菌剂,但其最终产物2,4,6-三氯苯酚是环境中重要污染物之一,会对人类的健康造成潜在威胁,并污染生态环境,因此,其在水果生产和贮藏中的残留问题受到越来越多的关注。

目前,国内对咪鲜胺及其代谢物的检测主要采用气相色谱法[9-12]、液相色谱法[13-16]、气相色谱-质谱法[17]和高效液相色谱-串联质谱法[18-19]等。郑雪虹等[20]采用气相色谱法测定水果中咪鲜胺残留量的方法研究;乔鲁芹等[21]采用高效液相色谱法快速测定板栗中戊唑醇和咪鲜胺残留量;张世瑞等[22]采用气相色谱-质谱法测定番石榴中咪鲜胺消解动态和残留量;徐永等[23]采用超高效液相色谱-串联四极杆质谱联用法测定水果中多效唑、氯吡脲和咪鲜胺的残留。目前尚未见用气相色谱-串联质谱(gas chromatography-tandem mass spectrometry,GC-MS-MS)法[24]对咪鲜胺及其代谢物进行残留研究的报道。

有关水果中咪鲜胺及其代谢物的残留分析,普遍存在样品前处理繁琐、费用高、使用有机溶剂量较多等不足,尤其气相衍生法在前处理过程中需使用毒性较大的吡啶盐酸盐,对实验人员的健康和环境安全造成威胁;且水果样品基质杂质多,干扰大,已有的方法不能满足测定要求。本实验旨在采用N-丙基乙二胺(primary secondary amine,PSA)和十八烷基硅烷键合硅胶(C18)混合固相萃取的净化方法,建立简单、快速、基质干扰少、灵敏度高的水果中咪鲜胺及其代谢物残留量的GC-MS-MS测定方法。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

乙腈(色谱纯) 美国默克公司;PSA、C18(40~63 μm 德国CNW公司;无水硫酸钠、氯化钠(分析纯,使用前在650 ℃的马弗炉内灼烧4 h);水为去离子水;咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚标准品(纯度均不小于99.0%) 德国DR公司。

TSQ Quantum XLS系列三重四极杆质谱仪(配Xcalibur 数据处理系统) 美国赛默飞世尔公司; 2-16K台式离心机 德国Sartorius-Sigma公司;
MMV-1000W振荡器 日本东京理化器械株式会社;
涡旋混合器 德国IKA公司;TruboVapII全自动浓缩仪 美国Biotage公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

两种标准储备液的配制:分别准确称取咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚标准品10.0 mg(精确至0.01 mg)于100 mL容量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻度,配成质量浓度为100 μg/mL的标准储备液。

混合标准工作液的配制:分别精密量取1.0 mL两种标准储备液于50 mL容量瓶中,乙腈定容至刻度,配制成质量浓度为2 μg/mL的混合标准工作液。

1.2.2 GC条件

色谱柱:TR-PESTICIDE(30 m×0.25 mm,0.25 μm);进样方式:程序升温不分流进样,大体积进样口:起始温度60 ℃,以8 ℃/min升至280 ℃;载气(He):99.999%;柱温采用程序升温:初始温度60 ℃,保持2 min,以30 ℃/min升至160 ℃,以5 ℃/min升至300 ℃,再以20 ℃/min升至310 ℃,保持1.5 min;柱流量1.3 mL/min;进样量:1 μL

1.2.3 MS-MS条件

离子源温度:240 ℃;电离模式:电子电离源;质谱传输线温度280 ℃;溶剂延迟时间4.5 min;碰撞气(Ar)压力:1.5 mTorr;分析模式:定时选择性反应监测(timing selective reaction monitoring,SRM)模式;定量方法:峰面积外标法定量。

1.2.4 样品处理

准确称取水果果实匀浆10.0 g于50 mL的离心管中,加入10.0 mL乙腈,漩涡混匀器混匀30 s,加入3 g NaCl,再振荡混匀10 min,4 000 r/min离心5 min,静置1 min分层,取上清液于另一50 mL的离心管中;再往残渣里加入10.0 mL乙腈,重复上述步骤,合并2 次上清液,加入5 g无水硫酸钠,混匀30 s,静置1 min。准确吸取10 mL上清液上全自动浓缩仪(水浴温度调节到40 ℃),氮吹浓缩至约2 mL,定容至2.0 mL;再放入0.5 g无水硫酸钠、100 mg PSA和100 mg C18,振荡,置漩涡混匀器上混和匀1 min,4 000 r/min离心5 min。取上清液进行GC-MS-MS分析。

1.2.5 基质加标工作曲线的制作

分别称取10 g(精确到0.01 g)待测水果的空白样品,按1.2.4节步骤进行样品提取与净化,氮吹浓缩至近干时,依次加入5、25、50、100、250、500 μL标准工作液,用乙腈定容至1.0 mL,即得质量浓度分别为0.01、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL的基质加标工作曲线。

2 结果与分析

2. 1 提取溶剂的优化

选用乙腈、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯4 种作为提取溶剂进行比较。通过在同一基质中进行的添加回收率测定实验,最终选择了极性大、穿透力强、提取效率高的乙腈作为提取剂(表1)。

表 1 不同提取溶剂的提取效果比较

Table 1 Extraction efficiencies by several extraction solvents

提取溶剂

添加量/

(mg/kg)

平均回收率/%

咪鲜胺

2,4,6-三氯苯酚

乙腈

0.1

92.6

90.3

丙酮

0.1

88..0

85.5

二氯甲烷

0.1

85.3

90.6

乙酸乙酯

0.1

70.2

82.2

 

 

2.2 分散固相萃取条件的优化

分散固相萃取的净化吸附剂有很多种类,选择2 种离子交换吸附剂[PSA、磺酸型强阳离子交换剂(strong acid type cation exchange,SCX)]和2 种惰性吸附剂[C18、石墨化炭黑]进行筛选。SCX吸附剂以硅胶为基质,键合有苯磺酸官能团,易吸附样品提取液中的阳离子,石墨化炭黑吸附剂能去除食品基质中的色素和甾醇的影响,两者对咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚的吸附作用较大,添加回收率较低(50%~80%),不适合使用;故选用对多糖、肽类(包括氨基酸)和色素有强吸附作用的PSA和对油脂等弱极性杂质有较强保留作用的C18作为固相萃取组合进行净化处理。

本实验分别考察不同PSA和C18用量对净化效率的影响,以在苹果中添加水平为0.1 mg/kg的咪鲜胺进行加标回收实验。结果(表2和表3)表明,净化过程中PSA的用量对苹果中咪鲜胺的回收率有明显影响,其回收率高低顺序表现为100 mg PSA>50 mg PSA>200 mg PSA>300 mg PSA>无PSA;而添加100 mg的C18即可达到净化效果,继续添加C18,净化效果无明显改变;因此,100 mg PSA+100 mg C18可获得最佳的回收率。

表 2 PSA用量对咪鲜胺回收率的影响

Table 2 Influence of PSA sorbent concentration on the recovery of prochloraz

PSA用量/mg

添加量/

(mg/kg)

平均回收率/%

咪鲜胺

2,4,6-三氯苯酚

0

0.1

80.4

82.5

50

0.1

87.4

89.5

100

0.1

95.4

96.3

200

0.1

90.7

93.4

300

0.1

88.2

90.8

 

表 3 C18用量对咪鲜胺回收率的影响

Table 3 Influence of C18 sorbent concentration on the recovery of prochloraz

C18用量/mg

添加量/

(mg/kg)

平均回收率/%

咪鲜胺

2,4,6-三氯苯酚

0

0.1

79.8

81.0

50

0.1

88.6

90.3

100

0.1

90.2

91.0

200

0.1

91.0

91.4

300

0.1

91.4

90.9

 

 

2.3 质谱条件优化

本方法采用GC-MS-MS的SRM模式进行检测,为了获得最佳的质谱条件以保证定性定量的准确性,对各项质谱参数进行了优化。首先以全扫描方式测定其保留时间和选择碎片离子(图1),确定母离子,再采用产物离子扫描方式通过优化碰撞能量获得丰度比较高产物离子,确定2 对离子对;最后采用SRM模式对待测物进行定性定量分析。因此,经过方法优化可以得到较为理想的质谱条件(表4)和分离效果,基本消除了基质和样品假阳性的干扰,大大提高了检测灵敏度,且2 对离子对的特征选择确保了样品的准确定性。图1为优化条件下0.05 mg/L基质加标工作液的总离子流色谱图。

958656.jpg 

1. 2,4,6-三氯苯酚;2. 咪鲜胺。

图 1 基质加标工作液(质量浓度均为0.05 mg/L)的总离子流图

Fig.1 Total ion chromatogram of spiked matrix working solution
(at 0.05 mg/L)

表 4 优化后的多反应监测模式下的GC-MS-MS条件

Table 4 Optimized conditions in the MRM mode for GC-MS-MS

名称

保留时间/min

离子对(m/z

碰撞能量/V

咪鲜胺

7.09

308→70,310→70

10

10

2,4,6-三氯苯酚

26.81

132→97,196→132

10

15

 

 

2.4 方法的线性范围和定量限

为提高定量的准确性,采用基质匹配标准溶液校正方法对基质效应进行了补偿。采用1.2.3节方法配制成0.01~1.0 μg/mL系列质量浓度的不同基质加标工作曲线,按1.2.2节和1.2.3节所述的GC-MS-MS条件进样,以定量离子的峰面积Y对质量浓度Xμg/mL)绘制标准曲线,得到不同基质中咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚的线性方程分别为Y=-10 267.2+358.699XY =-54 548.9+11 296X,其相关系数r值分别为0.999 4和0.999 2,表明咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚在0.004~0.400 mg/kg范围内的线性关系均良好。根据实际添加实验测得,该方法对4 种水果中多咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚的定量限分别为0.004 mg/kg和0.005 mg/kg。

2.5 方法的回收率与精密度

本实验对番石榴、苹果、荔枝、龙眼等水果进行了加标回收实验,考察该方法的回收率与精密度。称取上述几种水果的空白样品10 g各18 份,在其中分别添加0.01、0.02、0.10 mg/kg 3 个水平的咪鲜胺标液,经前处理后上GC-MS-MS分析,测定后计算回收率。加标回收实验结果见表5。咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚平均回收率分别为80.1%~101.5%和79.0%~97.4%,相对标准偏差分别为2.8%~6.8%和2.0%~6.0%。

表 5 咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚在水果中的添加回收率(n=6)

Table 5 Recoveries of prochloraz and 2,4,6-trichlorophenol pesticides spiked in fruits (n = 6)

样品

添加量/

(mg/kg)

咪鲜胺

 

2,4,6-三氯苯酚

平均回收率/%

相对标准偏差/%

 

平均回收率%

相对标准偏差/%

苹果

0.01

88.0

5.6

 

85.6

4.3

0.02

92.5

3.1

 

89.5

4.0

0.10

101.5

4.0

 

97.4

3.5

 

 

 

 

 

 

 

番石榴

0.01

86.2

3.6

 

88.3

3.1

0.02

89.4

2.8

 

89.0

2.6

0.10

98.0

4.2

 

93.1

2.0

 

 

 

 

 

 

 

荔枝

0.01

80.1

6.8

 

79.0

5.7

0.02

83.6

5.3

 

84.9

4.6

0.10

92.4

4.3

 

89.2

4.2

 

 

 

 

 

 

 

龙眼

0.01

81.7

5.9

 

80.1

6.0

0.02

88.3

5.0

 

86.7

5.3

0.10

93.4

3.8

 

96.8

4.4

 

 

2.6 实际样品测定结果

取本地产的番石榴、荔枝、龙眼以及苹果样品各3 份,去核捣碎后准确称取样品各10 g,按1.2.4节方法进行检测,结果在一些番石榴、荔枝和苹果样品中检出了咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚(图2),其具体残留量见表6。

952757.jpg 

952774.jpg 

1. 2,4,6-三氯苯酚;2. 咪鲜胺。

图 2 阳性样品1(A)和样品2(B)的GC-MS-MS图

Fig.2 GC-MS-MS profiles of positive sample 1 (A) and sample 2 (B)

表 6 实际样品中咪鲜胺和2,4,6-三氯苯酚的残留检测结果

Table 6 Contents of prochloraz and 2,4,6-trichlorophenol pesticides in real samples

mg/kg

样品

咪鲜胺残留量

2,4,6-三氯苯酚残留量

番石榴1

0.039

0.602

番石榴2

ND

ND

番石榴3

0.250

0.341

荔枝1

ND

ND

荔枝2

ND

0.456

荔枝3

0.178

0.214

龙眼1

ND

ND

龙眼2

ND

ND

龙眼3

ND

ND

苹果1

0.159

0.347

苹果2

ND

ND

苹果3

ND

ND

 

注:ND. 未检出。

3 结 论

本实验建立了基质分散固相萃取-GC-MS-MS法快速测定水果中咪鲜胺及其代谢物2,4,6-三氯苯酚残留量的方法。该方法具有简便、快速、选择性好、灵敏度高、抗基质干扰能力强的特点,在0.004~0.400 mg/kg范围内具有良好的线性响应,且在0.01、0.02、0.10 mg/kg添加水平下,两种农药均有较好的回收率,适用于水果样品中咪鲜胺及其代谢物残留的定性和定量分析。

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收稿日期:2014-08-20

基金项目:广东检验检疫局科技计划项目(2013GDK27);国家质检总局科技计划项目(2015IK260)

作者简介:卢俊文(1981—),男,主管药师,学士,研究方向为食品分析及天然植物提取。E-mail:dutylu@163.com

*通信作者:李蓉(1969—),女,高级工程师,硕士,研究方向为食品安全检测技术。E-mail:lir@zs.gdciq.gov.cn