超高效液相色谱-串联质谱法同时测定蜂蜜中
雷公藤红素和雷公藤次碱

雷美康1,彭 芳1,祝子铜1,丁 涛2,徐佳文1,吴晓勤1

(1.衢州出入境检验检疫局技术中心,浙江 衢州 324002;2.江苏出入境检验检疫局食品实验室,江苏 南京 210001)

 

摘 要:建立了一种超高效液相色谱-串联质谱同时检测蜂蜜中雷公藤红素和雷公藤次碱的快速分析方法。样品用水溶解后,乙腈盐析提取,采用Hypersil GOLD C18柱(50 mm×2.1 mm,1.9 μm)分离,电喷雾离子源正离子多反应监测模式串联质谱进行检测。结果表明:雷公藤红素和雷公藤次碱在0.01~20 ng/mL范围内具有较好的线性关系,相关系数均大于0.997。该方法定量限均为0.05 μg/kg。在0.05 μg/kg和1.0 μg/kg添加量条件下,雷公藤红素和雷公藤次碱的回收率为69.9%~101.5%,相对标准偏差均不大于10%(n=6)。本方法快速、灵敏、准确,适用于蜂蜜中雷公藤相关物质残留的定性、定量检测。

关键词:超高效液相色谱-串联质谱;蜂蜜;雷公藤红素;雷公藤次碱

 

Determination of Triptolide and Wilforine in Honey by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

 

LEI Meikang1, PENG Fang1, ZHU Zitong1, DING Tao2, XU Jiawen1, WU Xiaoqin1

(1. Technology Center of Quzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Quzhou 324002, China;

2. Laboratory of Food, Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Nanjing 210001, China)

 

Abstract: A method based on ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS-MS) has been proposed for the determination of triptolide and wilforine residues in honey. The samples were dissolved in water and extracted with acetonitril, separated on a Hypersil GOLD C18 column (50 mm × 2.1 mm, 1.9 μm) with gradient elution. The determination was carried out with electrospray ion source under the positive mode and multiple reaction monitoring (SRM) mode. The concentrations of triptolide and wilforine in the range of 0.01–20 ng/mL were linearly correlated to the peak area, with correlation coefficients greater than 0.997. The limits of quantification (RSN > 10)for both triptolide and wilforine were 0.05 μg/kg. The recoveries of triptolide and wilforine were 69.9%–101.5%, respectively, at spiked concentrations of
0.05 μg/kg and 1.0 μg/kg, with relative standard deviations (RSD, n = 6) lower than 10%. Our results indicate that the developed method is rapid, sensitive and accurate for the qualitative and quantitative analysis of triptolide and wilforine in honey.

Key words: ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; honey; triptolide; wilforine

中图分类号:S896.8 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2015)12-0218-03

doi:10.7506/spkx1002-6630-201512041

蜂蜜作为一种传统的天然保健食品,主要是由蜜蜂采集植物花蜜、分泌物或蜜露,与自身分泌物混合后,经充分酿造而成的天然甜物质[1]。蜜蜂如果采集有毒植物的花粉,蜂蜜就可能混进有毒物质[2-5],国内外关于使用有毒蜂蜜事件时有报道[6-9]。GB 14963—2011《蜂蜜》中明确规定蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露应安全无毒,不得来源于雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.F.)等有毒蜜源植物[1]。因此,建立蜂蜜中痕量雷公藤相关物质的快速筛查方法十分必要。

蜂蜜中雷公藤相关物质检测方法报道较少,闫继红[10]介绍了采用化学检验方法定性判断蜂蜜中是否含有雷公藤碱,此方法准确性和灵敏度低,同时检测过程中需使用三氯化锑等危险化学品。郭艳红等[11]采用高效液相色谱法检测昆明山海棠蜜中雷公藤甲素,但溶剂消耗量大,耗时繁琐、灵敏度低。雷公藤红素和雷公藤次碱是雷公藤的主要毒性成分[12-16],目前国内外同时检测蜂蜜中雷公藤红素和雷公藤次碱的方法尚未见报道。

本实验建立了超高效液相色谱-串联质谱同时测定蜂蜜中雷公藤红素和雷公藤次碱的分析方法。该方法操作简便、灵敏度高、结果准确,适用于蜂蜜中雷公藤相关物质的快速筛查和确证的检测手段。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

蜂蜜样品为浙江省衢州地区出口企业提供。

雷公藤红素(≥98%)和雷公藤次碱(≥98%) 南通飞宇生物科技有限公司;甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯,氯化钠、无水硫酸镁均为分析纯。

Ultimate 3000超高效液相色谱-TSQ Vantage三重四极杆串联质谱联用仪、MULTIFUGE XIR高速离心机
美国Thermo Scientific公司;MS 3 digital漩涡混合器 德国
IKA公司。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配制

标准储备液:称取雷公藤红素和雷公藤次碱标准品10 mg(精确至0.1 mg)置于100 mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,混匀配制成100 mg/L的单标储备液;标准中间液:分别准确移取1mL各单标储备液置于100 mL棕色容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配成
1.0 mg/L的混合标准中间液;标准工作液:根据需要移取适量混合标准中间液,用甲醇-水(11,v/v)稀释成0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20 ng/mL的标准工作溶液。各种标准溶液避光保存于4 ℃冰箱中。

1.2.2 试样制备

对未结晶的蜂蜜将其用力搅拌均匀,对有结晶析出的蜂蜜可将样品瓶盖塞紧后,置于不超过60 ℃的水浴中温热,待样品全部融化后搅拌,迅速冷却至室温。在融化时必须防止水分挥发[17]。

1.2.3 样品前处理

称取试样5.0 g(精确至0.01 g)于50 mL具盖离心管中,加入10 mL水溶解,加入10 mL乙腈、1 g NaCl、4 g无水硫酸镁,摇匀,涡旋后离心(6 000×g,5 min),取上层溶液经0.22 µm有机相滤膜过滤后用于分析。

1.2.4 色谱条件

色谱柱:Hypersil GOLD C18柱(50 mm×2.1 mm,1.9 μm);柱温:35 ℃;进样量:2 μL;流速:0.25 mL/min。
流动相:A为水,B为含0.15%甲酸的甲醇溶液。梯度洗脱程序:0~2.0 min,70% A;2.0~5.0 min,70%~5% A;5.0~10.0 min,5%A;10.1~14.0 min,70% A。

1.2.5 质谱条件

扫描方式:正模式扫描;检测方式:多反应监测;电喷雾电压:+3 500 V;鞘气:207 kPa;辅助气:10 arb;;毛细管温度:350 ℃;蒸发温度:300 ℃;碰撞气:氩气(1.5 mTorr)。S-Lens电压、碰撞电压、扫描模式和保留时间等条件见表1。

表 1 雷公藤红素和雷公藤次碱的多反应监测质谱参数

Table 1 Mass spectrometric parameters for the analysis of triptolide and wilforine by multiple reaction monitoring (MRM)

名称

定量离子(m/z

定性离子(m/z

S-Lens电压/V

碰撞能量/eV

正负模式

保留时间/min

雷公藤红素

451.5/201.2

451.5/215.2

75

29:22

7.25

雷公藤次碱

868.5/206.0

868.5/178.0

155

41;54

6.17

 

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

分别考察甲醇-水、酸化甲醇-水等流动相对雷公藤红素和雷公藤次碱目标分析物的分离效果。结果表明,以酸化甲醇-水溶液为流动相时,目标物的分离度和峰形较好。雷公藤红素和雷公藤次碱的多反应监测色谱图如图1所示。

951568.jpg 

951583.jpg 

图 1 雷公藤红素(A)和雷公藤次碱(B)标准溶液(5 μg/kg)的
多反应监测色谱图

Fig.1 Chromatograms of standards of triptolide and wilforine
(5 μg/kg) in MRM mode

2.2 质谱条件的优化

将雷公藤次碱标准品溶液采用流动注射直接进样,通过全扫描确定化合物母离子,再对母离子进行二级质谱扫描,得到碎片离子,通过优化S-Lens电压、碰撞能量等参数进行优化,得到二级质谱图。

分别考察电喷雾电离源的正离子和负离子模式和大气压力化学电离源的正离子和负离子模式4 种电离方式,结果表明,目标物在ESI源的正离子模式条件下最佳。

通过SRM选择相对丰度较高的离子对,确定为定量和定性离子对。同时,优化S-lens电压、碰撞电压等参数,优化后的质谱参数如表1所示。

2.3 基质效应

分别以蜂蜜的空白提取净化液作为标准溶液的稀释液,以各组分的峰面积对质量浓度绘制基质加标标准曲线,将其斜率与标准品的标准曲线的斜率相比。结果表明经过净化处理后对各目标测定物的基质效应影响不明显[18]。

2.4 方法的线性范围和定量限

配制一系列不同质量浓度的混合标准工作溶液(0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20 ng/mL),并依次进样,分别以雷公藤红素和雷公藤次碱的峰面积Y为纵坐标,以相应的质量浓度X为横坐标,作标准曲线,结果表明:这2 种目标物在0.01~20 ng/mL范围内其质量浓度与峰面积呈良好的线性关系。雷公藤红素和雷公藤次碱的线性方程分别为
Y=-408.081+58 216.7XY=-166.356+14 146.4X,相关系数r大于0.997。以实际检测时的信噪比大于10确定方法定量限均为0.05 μg/kg。

2.5 方法的回收率和精密度

分别在0.05 μg/kg和1.00 μg/kg水平下进行空白加标回收率实验,每个水平重复6 次,测定平均回收率及精密度。0.05 μg/kg添加水平时雷公藤红素和雷公藤次碱的回收率分别为69.9%~88.6%和84.3%~101.5%,相对标准偏差分别为9.2%和10%;1.0 μg/kg添加水平时雷公藤红素和雷公藤次碱的回收率分别为75.2%~93.1%和81.2%~99.8%,相对标准偏差分别为7.7%和7.9%,均符合残留检测的要求[19]。

3 结 论

本实验建立了固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱同时检测蜂蜜中雷公藤红素和雷公藤次碱残留的分析方法。采用直接水溶解后离心净化,有效提高了提取率,快速、简洁。该方法作为蜂蜜中雷公藤相关物质残留的确证和定量方法,具有简便、快捷、准确的优点,可以用于蜂蜜的质量安全检测和蜂蜜中毒事件中有毒样品的定性和定量分析。

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收稿日期:2014-10-10

基金项目:浙江省公益性技术应用研究计划项目(2013C37101)

作者简介:雷美康(1982—),男,工程师,硕士,研究方向为分析检测及标准化。E-mail:leimeikang@163.com