橘油处理对柑橘果皮组织结构物质的影响

许佳妮，崔文静，邓丽莉，曾凯芳*

（西南大学食品科学学院，重庆 400715）

摘 要：以果皮塌陷指数、变色指数以及与细胞膜、细胞壁相关的物质为测定指标，研究橘油处理致柑橘果实油胞病对果皮组织结构物质的影响。结果表明，橘油处理可引起柑橘油胞病的发生，病症随贮藏时间的延长而加剧；橘油可促使果皮组织内脂氧合酶活性和超氧阴离子自由基产生速率增加，从而加速细胞膜降解，果皮组织电导率明显上升、丙二醛含量迅速增加；橘油处理前期，果皮细胞壁结构物质木质素、纤维素会迅速合成，果胶甲酯酶与多聚半乳糖醛酸的活性受到抑制，果皮细胞壁会有一定程度加厚。

关键词：柑橘；油胞病；橘油处理；细胞膜；细胞壁

Effects of Orange Oil Treatment on Structural Materials of Orange Peel Tissue

XU Jiani, CUI Wenjing, DENG Lili, ZENG Kaifang*

(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Abstract: The effects of oleocellosis induced by orange oil on the structural materials of Navel orange peel tissue were studied based on collapse index, color index, cell membrane and cell wall-related index. Results showed that the oil treatment could induce oleocellosis on Navel orange and the disease was more notable as the storage time was prolonged. Orange oil could result in a rise in lipoxygenase (LOX) activity and superoxide anion production rate of peel tissue, in turn accelerating the degradation of the cell membrane, increasing dramatically the cell membrane permeability and the content of malondialdehyde (MDA). During the early storage period, the contents of cell wall-related materials such as lignin and cellulose of the oil-treated peel tissue increased quickly and the activities of pectin methylesterase (PME) and polygalacturonase (PG) were inhibited. Thus, the cell wall could be thickened to some degree. This study can provide a theoretical reference for exploring the mechanisms and control strategies of oleocellosis.

Key words: citrus; oleocellosis; oil treatment; cell membrane; cell wall

中图分类号：S609.3；S667.7 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2015）12-0237-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201512045

柑橘是世界第一大水果，我国柑橘产业发展迅速，2011年我国已超过巴西和美国，成为世界柑橘种植面积和产量均为世界第一的国家[1]。柑橘果实具有较高的营养价值和药用价值，色香味兼优，广受消费者青睐[2]。然而，采后柑橘在不同贮藏环境因子的共同作用下，生理代谢易发生紊乱，从而导致采后病害的发生，加速果实衰老和品质劣变[3-4]。目前，柑橘果实病害研究集中在其侵染性病害的发生机制和控制措施方面，而对果实生理性病害研究较少[5-6]。

油胞病是柑橘果实常见的一种生理性病害，发病初期果皮出现形状不规则的浅绿色或淡黄色病斑，病斑内油胞突出，油胞周围组织稍凹陷；此后随病症加重，病害区果皮下沉且病斑颜色加深至深褐色，油胞塌陷萎缩[7-8]。油胞病病变部位一般仅在柑橘外果皮组织中，内果皮组织无明显病状，对果实食用品质无太大影响；然而病变部位易受病原菌如青霉、绿霉、炭疽菌等入侵，从而导致果实腐烂[9]。关于柑橘果皮油胞病害发生的原因，有研究[10-13]认为是由于柑橘果皮在各种不利外部因素如光照、温度、湿度、气体成分以及机械损伤的影响下受损，导致油胞释放具有光毒性的橘油而引起相应的生理病症。然而，目前柑橘果皮油胞病的发病机制还存在很大争议，油胞病的发病实质仍是一个悬而未解的难题。因此，本实验采用橘油处理脐橙果实，一方面为橘油伤害可能是果实油胞病发病的根本原因补充研究基础；另一方面通过橘油快速诱导果实产生油胞病，分析油胞病发病果实果皮组织细胞膜、细胞壁相关结构物质变化，从而进一步探讨油胞病发病的机理机制，为柑橘果实油胞病的预防与控制提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试柑橘（Citrus sinensis L.Osbeck），产地为重庆北碚区，挑选饱满、色泽光亮呈黄色、大小均一、成熟度一致的新鲜成熟果实，剔除病、伤果；柑橘精油（纯度为100%） 植优雅香精油公司。

1.2 方法

1.2.1 橘油处理

参照Wild[14]、刘丽丹[15]等的处理方法并做一定修正。剪切宽为1.0 cm的滤纸条吸附在透明胶带上，每隔2 cm滴上15 μL 100%纯度的柑橘精油，最后将胶带沿脐橙果实赤道部位缠绕一圈。用0.015 mm厚的聚乙烯袋单果包装处理后的脐橙果实，于5 ℃条件下贮藏3 d；拆除胶带，再用聚乙烯袋单果包装果实后置于相应的温度（5 ℃）条件下贮藏8 d。对照组为刚采摘、擦净并晾干后的果实，用厚度为0.015 mm的聚乙烯袋单果包装，于5℃、相对湿度为85%的条件下贮藏，周期为11 d。果实分别于贮藏期间第0、1、3、5、7、11天进行观察并取样测定；观察组每组8 个果实，3次重复；取样组每次取样每处理8 个果实，3 次重复，以锋利的不锈钢刀切取果实赤道部位果皮，置于－18 ℃保存，用于测定。

1.2.2 塌陷指数和褐变指数的测定

参照Knight等[16]的评定方法进行评价，果皮塌陷指数和变色指数评分标准见表1，计算见式（1）、（2）。

表 1 果皮塌陷指数和变色指数评分标准

Table 1 Evaluation criteria for collapse and discoloration of citrus peel

塌陷指数=Σ（塌陷级别×该级别果实占总果实的百分比） （1）

变色指数=Σ（变色级别×该级别果实占总果实的百分比） （2）

1.2.3 指标测定

1.2.3.1 电导率和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的测定

参照曹建康[17]、王国泽[18]、Hodges[19]等的方法并加以改进。

1.2.3.2 超氧阴离子自由基产生速率的测定

参照王爱国等[20]的方法并加以改进。

1.2.3.3 脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）活性的测定

参照陈昆松等[21]的方法，以每分钟每克鲜样酶促反应体系234 nm波长处吸光度增加0.01为1个LOX活性单位（U）。

1.2.3.4 原果胶和可溶性果胶含量的测定

参照Manganaris等[22]的方法并加以改进，以每克鲜样中生成的半乳糖醛酸含量（%）作为原果胶或可溶性果胶的含量。

1.2.3.5 果胶甲酯酶（pectin methylesterase，PME）和多聚半乳糖醛酸（polygalacturonase，PG）活性的测定

参照Riov[23]、罗自生[24]等的方法，以30 min内释放出1 mmol的CH3O—为一个PME活性单位（U），以每小时每克鲜样37 ℃时分解果胶产生1 mg半乳糖醛酸为一个PG活性单位（U）。

1.2.3.6 木质素和纤维素含量的测定

参照Morrison等[25]的方法并作修改，以每克鲜样在280 nm波长处的吸光度表示木质素含量。纤维素含量测定参照牛森[26]的测定方法，在620 nm波长处测定吸光度，在标准曲线上查出相应的纤维素含量；结果为所查相应纤维素含量与样品质量的比值。

1.2.3.7 苯丙氨酸解氨酸（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）和纤维素酶（cellulase，Cx）活性的测定

参照Luo Yang等[6]的方法，以每小时每克鲜样酶促反应体系290 nm波长处吸光度增加0.01为1 个PAL活性单位（U）。参照Gorhamann等[27]的方法并作修改，以每小时每克鲜样37℃时产生1 μg葡萄糖为一个Cx活性单位（U）。

1.2.4 数据统计及图形分析

采用Excel 2003统计分析所有数据，计算标准误并制图；应用SPSS软件对数据进行方差分析，利用t检验对差异显著性进行分析。P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 橘油处理对柑橘果皮塌陷指数和变色指数的影响

如图1所示，橘油处理组和对照组果皮病斑塌陷指数随贮藏时间延长而增加，其第11天塌陷指数分别为第1天的3.10、3.81 倍。橘油处理组病斑塌陷指数一直高于对照组，其在第1 天和第11天塌陷指数分别是对照组的1.66 倍和1.34 倍。

橘油处理组和对照组果皮病斑变色指数随贮藏时间延长而增加，其第11天变色指数分别为第1天的5.50 倍和2.31 倍。橘油处理组病斑变色指数一直高于对照组，其变色指数在第3天迅速增加，其在第1、3、11天变色指数分别是对照组的1.50、2.88、3.57 倍。

图 1 橘油处理对脐橙果皮塌陷指数（A）和变色指数（B）的影响

Fig.1 Effect of oil treatment on collapse index (A) and discoloration index (B) of Navel orange peel

2.2 橘油处理对柑橘果皮膜脂过氧化的影响

如图2A所示，橘油处理组和对照组LOX活性均呈现先增加后降低的趋势。对照组在第1天活性迅速上升并达峰值，随后其活性缓慢下降并保持在较低水平。贮藏至第3天，橘油处理组LOX活性达到峰值，为对照的1.6 倍（P＜0.05），表明经橘油处理会刺激果实LOX活性增加；但橘油处理在后期对LOX活性影响较小，第7天后其LOX活性均低于对照组。

图 2 橘油处理对脐橙果皮LOX活性（A）、超氧阴离子自由基产生
速率（B）、MDA含量（C）和相对电导率（D）的影响

Fig.2 Effect of oil treatment on LOX activity (A), superoxide anion production rate (B), MDA content (C), and cell membrane permeability (D) in Navel orange peel

如图2B所示，橘油处理组超氧阴离子自由基产生速率一直处于较高水平，与对照组均呈现先增加后降低的趋势，但始终高于对照组。处理组和对照组超氧阴离子自由基产生速率均于第3天达到峰值，此时处理组是对照组的1.15 倍（P＜0.05），随后各组速率均下降但橘油处理组下降趋势较对照组小。

如图2C所示，橘油处理组和对照组MDA含量总体呈上升趋势，除第7天外橘油处理组MDA含量均高于对照组。橘油处理组MDA含量在第1天迅速增加且保持在较高水平，贮藏第11天MDA值达到峰值，为对照组的1.18 倍（P＜0.05）。

如图2D所示，橘油处理组和对照组相对电导率总体呈上升趋势，橘油处理组相对电导率一直高于对照组。橘油处理组电导率从第5天开始上升趋势明显大于对照组，在第11天达到峰值时，处理组相对电导率是对照组的1.36 倍（P＜0.05）。

2.3 橘油处理对柑橘果皮细胞壁结构物质的影响

2.3.1 对原果胶含量、可溶性果胶含量、PME活性和PG活性的影响

图 3 橘油处理对脐橙果皮原果胶含量（A）、可溶性果胶含量（B）、PME活性（C）、PG活性（D）的影响

Fig.3 Effects of oil treatment on protopectin content (A), water-soluble pectin content (B), PME activity (C) and PG activity (D) in Navel orange peel

如图3A、B所示，橘油处理组和对照组原果胶含量均呈现不断下降的趋势；处理组原果胶含量总体下降程度较对照组小，其一直保持在较高水平且始终高于对照组。橘油处理组在第11天原果胶含量是对照组的2.10 倍（P＜0.01）。橘油处理组和对照组可溶性果胶含量呈现先增加后下降的趋势；但各组可溶性果胶含量峰值出现时间不同，对照组可溶性果胶含量在第7天迅速增加并达到峰值；橘油处理组可溶性果胶含量在第5天迅速增加并在第9天达到峰值，随后其含量迅速下降。

如图3C、D所示，对照组PME活性总体呈现缓慢下降趋势。橘油处理组PME活性在贮藏前7 d一直低于对照组，变化较平缓，第9 天急剧升高并达到峰值，其活性为对照的1.97 倍（P＜0.01），此后PME活性急剧下降到最低水平。由此说明，橘油在贮藏前期抑制PME活性，但后期PME活性急剧升高。橘油处理组和对照组PG活性变化趋势基本一致，其活性在贮藏前7 d均波动较大，均在第5天急剧升高达到峰值后迅速下降，随后维持在一定的酶活水平。

2.3.2 对木质素含量、纤维素含量、PAL活性和Cx活性的影响

图 4 橘油处理对脐橙果皮木质素含量（A）、 纤维素含量（B）、PAL活性（C）、Cx活性（D）的影响

Fig.4 Effects of oil treatment on lignin content (A), cellulose content (B), PAL activity (C) and Cx activity (D) in Navel orange peel

如图4A、B所示，橘油处理组和对照组木质素含量呈现先增高后降低的趋势，但至贮藏末期，各组木质素含量差异并不明显（P＞0.05）。橘油处理组木质素含量在第3天达到峰值，为对照组的1.47 倍
（P＜0.05）；表明橘油处理可以在贮藏前期诱导木质素的大量合成。橘油处理组和对照组纤维素含量呈现先增高后降低的趋势；但贮藏末期各组纤维素含量无明显差异
（P＞0.05）。橘油处理组纤维素含量在第3天急剧增加并达到最大值，其含量是对照组的3.06 倍（P＜0.01），随后其纤维素含量于第7天急剧下降；表明橘油处理可以在贮藏前中期诱导纤维素的大量合成。

如图4C、D所示，对照组PAL活性总体呈现缓慢下降的趋势。橘油处理组在PAL活性呈现先增高后降低的趋势，其活性在第3天急剧增加并达到峰值，是对照组的2.31 倍（P＜0.01），随后PAL活性急剧下降并维持在较低水平上。橘油处理组和对照组Cx活性总体上呈现先升高后降低的趋势，但处理组酶活性峰值出现较晚。橘油处理组和对照组在0～5 d内Cx活性基本保持较低水平；对照组Cx活性在第7天迅速增加并达到峰值，橘油处理组Cx活性第9天急剧增加并达到峰值，其活性为对照的1.67 倍（P＜0.01）。

3 讨 论

采后柑橘果实经橘油处理后，果皮出现塌陷与变色症状，其症状随贮藏时间延长而加重，与油胞病的典型特征一致，也与大多数研究结果[16,28-29]类似。本实验采用外源涂抹橘油的方式诱导油胞病发生，为油胞病的发生机制，即油胞病的发生很可能与柑橘果皮中的橘油密切相关，提供了理论依据。

油胞病的发生可引起果皮细胞代谢紊乱，对果皮组织如细胞膜和细胞壁造成影响[30]。有研究报道，细胞膜的降解和过氧化是在磷脂酶、LOX和活性氧的共同作用下发生的，从而引起细胞膜通透性改变，组织电导率发生明显变化；MDA是细胞膜的降解产物，可用来衡量细胞膜破损的程度[31-32]。本实验表明，橘油处理诱导油胞病可提高果皮组织内LOX活性，激起活性氧爆发；处理组较高的超氧阴离子自由基产生速率加速细胞膜降解，贮藏后期组织电导率维持在较高水平，MDA含量大量增加。细胞膜结构组分的变化表明油胞病发病期间细胞膜完整性受到严重破坏，这与刘丽丹[15]关于油胞病果实抗氧化酶系统变化的研究结果相似，也与油胞病果实超微结构观察结果一致：Knight等[16]用橘油诱导油胞病，30 min后观察到在果皮组织皮层细胞中细胞膜出现轻微破损，病害后期则几乎难以观察到细胞膜存在。果皮细胞膜的降解是对油胞病的反馈，膜脂过氧化导致的细胞膜受损可能为橘油毒害细胞器提供途径，细胞器如叶绿体的损伤将导致果实病斑部位的褐变。

细胞壁的主要成分是果胶、木质素和纤维素等大分子物质。在PME的水解作用下原果胶被分解为可溶性果胶，可溶性果胶进而在PG作用下被分解为葡萄糖，从而引起细胞壁水解；木质素是复杂的苯丙烷单体聚合物，它的合成经过苯丙氨酸途径进行，受该代谢途径关键酶PAL调控，是木质组织的重要成分，可增加细胞壁的厚度和韧性；纤维素是细胞壁的骨架物质，是外层初生壁和内层次生壁的主要成分，它的降解意味着细胞壁的解体和果实的软化[33-35]。在本实验中，橘油处理前期可抑制PME活性，从而使原果胶含量保持在较高水平，而其可溶性果胶含量峰值也有所延迟。橘油处理组在第3天PAL活性和木质素含量均达到峰值；橘油处理前期可提高PAL活性，从而诱导组织内木质素大量合成，使细胞壁韧性变强。处理组Cx在贮藏前中期活性保持在较低水平，峰值出现时间较对照组晚，这与处理组贮藏前中期较高的纤维素含量相符。因此，在油胞病发病初期，果皮细胞壁会因纤维素和木质素的大量合成以及原果胶降解受抑制而加厚，在外观上表现为病斑变硬的症状；这与Knight[16]、Shormer[7]等通过透射电镜观察到的油胞病发病后果皮组织和外表皮层细胞壁折叠加厚的现象一致。随着贮藏时间的延长，PE、PG和Cx活性的增强以及PAL活性的降低将使果皮结构物质包括原果胶、纤维素发生降解，从而在外观上表现为病斑下陷的症状，果实果皮最终呈现软化现象。

本实验结果表明，橘油可导致柑橘果实油胞病的发生，致使果皮细胞膜和细胞壁组分发生变化，橘油致柑橘果皮劣变机制的进一步明确为研究采后柑橘果实油胞病变提供了理论依据。然而，关于如何消除橘油对果皮的负面影响需要后续更深入的研究；若能从橘油作用的角度入手，探索一种有效防止橘油损伤果皮组织细胞膜和细胞壁的措施，将为油胞病的控制提供新的、更加可行的思路和方法。

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