表1 待测样品
Table1 The tested samples
组别WG/g水/mLana-rLOX/ULA/mgWEAX/%空白组10070 ana-rLOX组100702 000210 WEAX组100701 ana-rLOX+WEAX组100702 0002101
任 娣，谢亚娟，陆兆新，张 充，别小妹，赵海珍，吕凤霞 *
（南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095）
摘 要：通过测定酶促作用前后面筋蛋白（wheat gluten，WG）的自由巯基含量、表面疏水性、黏弹性等的变化，研究了重组脂肪氧合酶（pET-32a-ana-lipoxygenase，ana-rLOX）对水溶性阿拉伯木聚糖（water-soluble arabi noxylan，WEAX）和WG相互作用的影响，并探讨了ana-rLOX对面包品质改良的作用。结果表明，与添加WEAX的样品相比，加入ana-rLOX和WEAX后WG的自由巯基含量下降了21%，表面疏水性指数增大，流体动力学半径增大了27.3%，WG的黏弹性明显增加；面包的硬度、胶着性、咀嚼性降低，回复性增强，明显改善了面包品质。
关键词：重组鱼腥藻脂肪氧合酶；水溶性阿拉伯木聚糖；面筋蛋白；黏弹性；面包品质
脂肪氧合酶（lipoxygenase，LOX，EC1.13.11.12）能专一性催化含1，4-顺，顺-戊二烯双键体系的多不饱和脂肪酸氧化形成具有共轭双键的氢过氧化物 ［1］，在面粉加工过程中可催化分子氧对面粉中具有戊二烯1，4双键的油脂发生氧化，形成不稳定的氢过氧化物氧化面筋蛋白质分子的巯基（—SH）形成二硫键（—S—S—），并能诱导蛋白质分子聚合，使蛋白质分子变得更大，从而起到增强面筋的作用。同时，LOX可通过偶合反应破坏类胡萝卜的双键结构，从而起到漂白面粉、改善面粉色泽的作用。由于LOX具有强筋和漂白双重作用，近年来已被应用于面粉及面制品的品质改良中 ［2］，而重组脂肪氧合酶（pET-32a-ana-lipoxygenase，ana-rLOX）基于其绿色安全、酶纯度高、成本低、效果明显等优点已成为研究的热点 ［3］，且作为新型绿色面粉改良剂无疑将具有巨大的市场需求和应用前景。
目前，国内外不少学者正在研究具有面粉品质改良作用的酶，如葡萄糖氧化酶、漆酶等。葡萄糖氧化酶可能导致了多糖结构中阿魏酸与蛋白质中酪氨酸的交联 ［4］，Carunchio等 ［5］发现漆酶具有使面粉多糖中的阿魏酸交联作用，Oudgenoeg等 ［6］研究发现辣根过氧化物纯酶能够催化阿魏酸与酪氨酸的聚合作用。另有研究表明，漆酶可以通过氧化面筋蛋白（wheat gluten，WG）中的酪氨酰残基，或经阿魏酸衍生基团强化面筋多聚物中二硫键的形成，改善面团的加工特性 ［7］。但目前关于ana-rLOX对水溶性阿拉伯木聚糖（water-soluble arabinoxylan，WEAX）及WG相互作用的影响的研究国内尚未见报道。
本实验研究了ana-rLOX对WEAX及WG相互作用的影响，探讨ana-rLOX对WEAX与WG之间的聚合作用及面包品质的影响，以期为研发一种绿色面粉改良酶制剂提供理论依据。
1.1 菌种、试剂与培养基
大肠杆菌E. coli BL-21（DE3）、重组表达载体pET-32a-ana-rLOX质粒 南京农业大学食品科技学院酶工程实验室保存备用。
ana-rLOX（酶活力30 000 U/mg）、WEAX、WG、小麦粉 自制；扬麦15 江苏金土地种业有限公司；氨苄青霉素、异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、正己烷、淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、1-苯氨基萘-8-磺酸（8-aminonaphthalene-1-sulphonic acid，ANS）、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、亚油酸（linoleic acid，LA） 美国Sigma公司。
LB液体培养基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化钠10 g、蒸馏水定容至1 000 mL，121 ℃ 20 min灭菌后备用。1.2 仪器与设备
SX-700高压蒸汽灭菌器 日本TOMY公司；SCIENTZ超声细胞破碎仪 苏净集团安泰公司；HYG-A全温摇瓶柜 太仓实验设备厂；UV-2450紫外分光光度计 日本岛津公司；AR1000Rhemeter TA Instrument动态流变仪 英国Anton Paar公司；HITACHI650-60型荧光光谱仪 日本日立公司；ALV-5000/E型激光光散射仪 德国ALV公司；TA-XT Plus 2i质构仪 英国Stable Micro System公司。
1.3 方法
1.3.1 重组脂肪氧合酶的制备及纯化
将含有重组表达载体pET-32a-ana-rLOX的重组菌，接种于含有100 μg/mL氨苄青霉素的液体LB 培养基中，37 ℃、180 r/min过夜培养12 h。再取出1 mL种子液到100 mL液体LB培养基中，37 ℃、 180 r/min 培养至 OD 600 nm为0.6～0.8左右，加50 μL IPTG（质量浓度200 mg/mL），16 ℃诱导16 h。将最终发酵液离心10 min，收集菌体 ［8］。将收集的菌体，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）重悬，超声波破碎，离心，收集上清液作为粗酶液，通过镍柱洗脱和酶切，获得纯酶 ［9］。
1.3.2 小麦麸皮中WEAX的提取及纯化
称取小麦麸皮，磨粉过40 目筛，取筛下物，加入正己烷得到脱脂麸皮。脱脂后，加入蒸馏水，匀速搅拌，煮沸10 min，降温至90 ℃左右，加入质量分数5% α-淀粉酶，控制温度在90～95 ℃，pH 6.0，匀速搅拌2 h停止，冷却至室温再加入质量分数0.3%糖化酶，60 ℃，pH 4.2保温1 h，再用 1 mol/L NaOH溶液调节pH值至9，加入0.03%～0.06%碱性蛋白酶，搅拌4 h，恒温50 ℃过夜，煮沸灭酶；离心分离混合液。收集上层清液，用水洗涤固体沉淀物2 次，用4 倍体积的无水乙醇进行沉淀，沉淀重新分散于水，离心收集上清液，冷冻干燥得WEAX粗品 ［10］。粗品先经过DEAE-纤维素层析柱，再经过Sephdex G-100凝胶柱进一步纯化得WEAX ［11］。
1.3.3 小麦粉中WG的提取
参照Weegels ［12］和陆启玉 ［13］等所采用的方法。称取过110 μm筛的脱脂面粉500 g于不锈钢和面盆中，加入一定量蒸馏水，用手充分揉成面团后，静置20 min。然后用2%的氯化钠溶液反复轻轻揉洗，揉洗过程中尽量保持面团完整。揉洗至洗液无混浊，无乳白色。在揉洗完成后，洗出的面筋进行冷冻真空干燥，冻干后磨碎，过筛，得到WG粉备用。
1.3.4 样品制备
按照表1将各组分混合，在室温下用玻璃棒搅拌样品5 min，手工揉搓5 min，再冷冻干燥，即得待测样品。
表1 待测样品
Table1 The tested samples
组别WG/g水/mLana-rLOX/ULA/mgWEAX/%空白组10070 ana-rLOX组100702 000210 WEAX组100701 ana-rLOX+WEAX组100702 0002101
1.3.4.1 自由巯基含量的测定
称取一定量的待测样品溶于pH 7.0的PBS中，离心取上清，取3 mL蛋白液，加入3 mL 0.1 mol/L含有l mmol/L EDTA和质量分数1% SDS的PBS，再加入0.1 mL二硫代二硝基苯甲酸（5，5'-dithiobis-2-nitrobenzoic acid，DNTB）（39.6 mg的DNTB溶于10 mL 0.1 mol/L pH 7.0的PBS），剧烈振荡后在25 ℃条件下水浴1 h，离心。以不加 DNTB的为对照，取上清液在412 nm波长处测定吸光度，计算巯基含量 ［14］。
1.3.4.2 表面疏水性的测定
表面疏水性是用ANS作为荧光探针进行测定的 ［15］。用0.01 mol/L，pH 7.0的PBS配制不同质量分数的待测样品溶液（0.005%、0.01%、0.02%、0.05%、0.1%、0.2%），取不同质量分数的稀释样品4 mL，加入20 μL 8 mmol/L ANS溶液。采用荧光分光光度 计在365 nm的激发波长（狭缝5 nm）和484 nm的发射波长（狭缝5 nm）下测定样品的荧光强度，测定混合液的荧光强度F 1及未加入ANS溶液的样品荧光强度F 2，以相对荧光强度（ΔF=F 1-F 2）对蛋白质浓度作图，曲线初始阶段的斜率即为蛋白质分子的表面疏水性指数H 0。
1.3.4.3 流体动力学半径的测定
将样品溶于pH 7.0的PBS中配制成质量分数为0.2%的溶液，取上清液通过孔径0.45 μm的醋酸纤维素膜，通过ALV-5000/E型激光光散射仪测定面筋蛋白流体动力学半径的大小 ［16］。
1.3.4.4 WG的动态流变学实验
采用振荡模式下的频率扫描实验研究ana-rLOX对WG动态流变学的影响 ［17］。称取一定量WG，按一定比例加入WEAX，ana-rLOX为20 IU/g WG，加水量70%，室温下混匀，流变仪的直径为35 mm的两个平行板之间进行流变性能测试，两板之间的间隙为2.5 mm，测量温度为（25±0.1）℃。由于该体系的流变性与样品装载时用力的大小有关，故样品应轻轻地放到平行板上，以一定的速率缓慢升高下板至测量位置，轻轻刮掉周围挤压出来的多余样品，用矿物油封住两板圆周，以防干燥。在测量开始前使样品在平行板上稳定10 min，以便使加样过程中破坏的结构得到恢复，分别对以上样品进行频率扫描（扫描频率：0.01～20 Hz）。
1.3.4.5 ana-rLOX对面包品质的影响
面包的制作：采用二次发酵法制作面包 ［17］，具体面包配方见表2。
表2 不同实验组面包配方
Table2 Ingredients used in different experiments
组别小麦粉/g酵母粉/g盐/g绵白糖/g水/mL ana-rLOX/（IU/g）WEAX/%空白组200322090 ana-rLOX组200 32209020 WEAX组2003220901 ana-rLOX+WEAX组200322090201
面包的比容测定：面包出炉后冷却2 h至室温，称质量并测定面包体积。参照GB/T 20981—2007《面包》。
面包芯质构的测定：将面包在切片器下成厚度为20 mm的厚薄均匀片。采用TA-XT Plus型质构仪测定被选取面包片的中间位置进，测3 次后取平均值，探头型号：P/50，测定前速率：1 mm/s，测定速率：1 mm/s，测定后速率：10 mm/s。
2.1 酶促前后WG及WEAX相互作用的自由巯基含量
图1 ana-rLOX及WEAX作用前后WG自由巯基含量
Fig.1 Change in gluten free sulfhydryl group before and after the interaction between ana-rLOX and WEAX
WG分子中—SH与—S—S—之间产生交换反应，可以使自由巯基的数量发生变化，巯基和二硫键对于维持面筋蛋白的网络结构具有重要作用 ［18］。从图1可以看出，向WG中添加ana-rLOX、WEAX后加入ana-rLOX、WEAX及ana-rLOX和WEAX后，其自由巯基含量均有所 降低。其中加入WEAX后WG的自由巯基含量由13.7 μmol/g降低为11.8 μmol/g，而向加入WEAX样品中再加入ana-rLOX后自由巯基含量由13.7 μmol/g降低为9.3 μmol/g，与加入WEAX的样品相比，又降低了21.1%。研究结果表明，ana-rLOX催化亚油酸产生初级自由基，可能诱导WEAX与WG发生的相互作用，使WG中的自由巯基相互交联为二硫键或自由巯基与WEAX的作用，从而降低了自由巯基的含量 ［19］。
2.2 ana-rLOX及WEAX对WG表面疏水性的影响
疏水相互作用是维持蛋白质结构的主要作用力，对蛋白质结构的稳定具有重要作用。利用ANS荧光探针法研究WG表面疏水性的变化，可以分析WG疏水性基暴露的情况，进而推断蛋白质相互作用的方式。
图2 ana-rLOX及WEAX对WG表面疏水性的影响
Fig.2 Influence of ana-rLOX and WEAX on surface hydrophobicity of wheat gluten
由图2可知，加入WEAX后，WG的表面疏水性指数有所增大，而加入ana-rLOX和WEAX的样品其表面疏水性显著增强。说明酶促作用使WG解折叠进而构象发生了改变，分子内部的疏水基团逐渐暴露在分子表面，引起了表面疏水性的上升，这一结果和黄友如 ［20］利用LOX催化大豆蛋白聚集的结果相一致。
2.3 ana-rLOX及WEAX对WG溶液流 体力学半径的影响通常蛋白质的流体力学体积反映的是蛋白质聚集的程度。通过动态光散射分析了溶液中EG颗粒的表观流体力学半径的平均值。ana-rLOX及WEAX对WG溶液粒径的影响，结果如图3所示。
图3 ana-rLOX及WEAX对WG溶液流体力学半径的影响
Fig.3 Influence of ana-rLOX and WEAX on the average radius of fluid dynamics for wheat gluten solution
由图3可知，酶促反应前WG溶液的平均粒径为241.2 nm，酶促反应后WG、WEAX后其溶液的平均粒径都有所增大，其中加入WG和WEAX相互作用后溶液平均粒径增加到324.7 nm，粒径增加显著，说明ana-rLOX催化亚油酸产生初级自由基，诱导WEAX与WG发生的相互作用，分子之间能发生相互交联和聚集，形成C—C或C—N共价交联形式聚集体的相对分子质量增大，聚集体粒径显著变大 ［20］。
2.4 ana-rLOX对WG动态流变学特性的影响
动态流变仪用于测定WG的黏弹性，主要评价参数有弹性模量G'和黏性模量G''。ana-rLOX对WG和WEAX黏弹性的影响，结果如图4所示。在0～20 Hz频率范围内，各样品随频率的增加其弹性模量和黏性模量都不断增大。WG中加入WEAX的样品后其弹性模量和黏性模量明显增大，其中在WG和WEAX的样品中加入ana-rLOX后其弹性模量和黏性模量增加最大。这一结果与葡萄糖氧化酶添加到含有戊聚糖的面团，其面团弹性模量增大，黏性模量减小 ［21］相一致。其原因可能为ana-rLOX催化亚油酸产生自由基诱导了WG交联，同时促进WEAX的氧化交联，且WG与WEAX发生了相互作用，使得各组分结合更加紧密，从而表现为面团黏弹性的提高。
图4 ana-rLOX及WEAX对WG流变学性质的影响
Fig. 4 Effect of ana-rLOX and WEAX on rheological properties of wheat gluten
2.5 ana-rLOX对面包比容的影响
面包的比容直接反映了面包芯的蜂窝体积大小，比容越大表明面团的持气性能好，面包越松软越容易得到消费者的喜爱 ［22］。分别对不同组别的面包进行比容测定，结果见表3。
表3 不同实验组面包的比容比较
Table3 Specific volumes of different breads
注：同列小写字母不同表示处理间差异显著（P＜0.05）。
组别面包体积/cm 3面包质量/g面包比容/（cm 3/g）空白组426.7±3.4 a137.8±0.2 e3.09 ana-rLOX组493.5±5.6 b138.9±0.4 e3.54 WEAX组478.2±4.3 c138.4±0.1 e3.45 ana-rLOX+WEAX组546.3±7.8 d139.2±0.2 e3.92
由表3可知，添加WEAX对面包的比容有明显的影响，较空白组增大了11.6%，而添加ana-rLOX面包的比容在此基础上又增大了13.6%。
2.6 ana-rLOX对面包芯质构的影响
质地剖面分析（texture profile analysis，TPA）测试是通过模拟牙齿的咀嚼行为和牙齿在二次咀嚼过程中时间和力的变化情况，对样品的硬度、弹性、黏聚性、胶着性、咀嚼性和回复性进行量化的评价方法 ［23］。各组面包硬度、胶着性、咀嚼性和回复性的结果如表4所示。
表4 不同实验组面包的质构分析
Table4 Texture properties of breads from different experimental groups
组别硬度/g胶着性/g咀嚼性/g回复性空白组1 9061 3891 2680.321 ana-rLOX组1 6371 2321 1310.338 WEAX组1 4281 0129430.368 ana-rLOX+WEAX组1 1368677820.394
由表4可知，添加ana-rLOX和WEAX后面包的品质较空白组得到明显改善，在硬度上与对照组和添加WEAX相比下降了30%和20.5%，说明添加WEAX后面包芯更为柔软；胶着性和咀嚼性方面与对照组和添加WEAX相比明显降低，表明面包黏牙性降低，口感更为细腻松软。另外，在回复性方面，添加ana-rLOX和WEAX面包的值高于其他各组，较对照组和添加WEAX提高16.6%和7%，表明面包下压后不易发生形变，弹性增加，这与Zhang Chong等 ［24］的研究结果较一致。
有关阿拉伯木聚糖（arabinoxylan，AX）和WG相互作用的研究主要集中在对面团流变学特性以及面制品品质的影响等方面 ［25］。基于AX和WG的交联方式，研究已表明：AX中的二聚阿魏酸通过其上的芳香环进行共价成交联 ［26］；WG中的酪氨酸残基与AX中阿魏酸的芳香环交联，WG中的酪氨酸上的芳香环之间形成交联 ［27］。Wang Mingwei等 ［28］提出AX与WG之间可能存在物理作用和化学作用，前者主要是AX与WG之间的物理吸附，后者指WG与AX之间通过阿魏酸形成化学键。尽管目前就AX与WG上氨基酸具体的交联方式还存在争议，但许多研究已证实，AX与WG的相互作用是通过阿魏酸连接的，而AX是在氧化条件下（指产自由基的酶，如漆酶、脂肪氧合酶）与阿魏酸通过酯键结合形成凝胶，AX中的阿魏酸侧链被羟自由基氧化，导致了与蛋白质中氨基酸残基上基团的交联，使阿拉伯木聚糖分子间的交联，以及AX与面筋蛋白之间交联和聚集。
本实验加入ana-rLOX 和WEAX后WG的自由巯基含量减少，表面疏水性作用增强，面筋蛋白的流体动力学半径平均值增大，说明ana-rLO X催化亚油酸产生自由基对AX及面筋蛋白之间的有催化聚合作用，从而引起蛋白质聚集体 的形成，使面筋的强度变大。至于ana-rLOX如何作用于AX及WG，可能是通过ana-rLOX催化亚油酸过氧化产生的脂质自由基，通过抽氢使蛋 白质分子变成自由基，导致蛋白质-蛋白质的交联，从而引起小麦蛋白聚集体的形成。同时，脂质自由基诱导阿拉伯木聚糖侧链上的阿魏酸基团发生氧化交联，使阿拉伯木聚糖分子间的交联，以及AX与WG之间交联和聚集，形成大分子网状 结构。具体作用机理有待进一步探索研究。
目前国内外脂肪酶、葡萄糖氧化酶、脂肪氧合酶、半纤维素酶、戊聚糖酶等多种酶制剂，用于面粉品质改良。其中脂肪氧合酶主要以大豆粉为主要来源，但大豆粉含有多种同工酶，存在成分复杂、酶纯度差、颜色深，效果不佳等缺点。本研究ana-rLOX对面粉及其面制品具有很好的强筋作用，增强了面团的黏弹性，面包的硬度、胶 着性、咀嚼性均明显降低，回复性增加，有效地改善面包的比容、硬度、质地等烘焙特性，提高面包烘焙品质，将为研制开发一种绿色、安全、低成本、高效的新型面粉改良剂提供依据。
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Effect of Recombinant Lipoxygenase on Rheological Properties of Wheat Dough and Bread Quality
REN Di， XIE Yajuan， LU Zhaoxin， ZHANG Chong， BIE Xiaomei， ZHAO Haizhen， L☒ Fengxia
*
（College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）
Abstract：The interaction between arabinoxylan and wheat gluten is essential for rheological properties of dough and wholewheat bread. In this paper， free thiol content， surface hydrophobicity and viscoelasticity of wheat gluten after enzymatic action were measured to investigate the effect of recombinant lipoxygenase （ana-rLOX） on the interaction between watersoluble arabinoxylan （WEAX） and wheat gluten. Meanwhile， further exploration of gluten rheology and bread quality was conducted by adding recombinant lipoxygenase and soluble arabinoxylan. The results showed that the addition of anarLOX and WEAX could decrease free thiol content by 21%， increase gluten protein surface hydrophobicity and enlarge hydrodynamic radius by 27.3%. At the same time， the viscoelasticity of gluten was significantly enhanced and bread quality was remarkably improved as indicated by reduced harness， gumminess， chewiness and increased resilience.
Key words：recombinant lipoxygenase； water-soluble arabinoxylan； wheat gluten； viscoelasticity； bread quality
中图分类号：TS202.3
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）13-0001-06
doi：10.7506/spkx1002-6630-201513001
收稿日期：2015-01-19
基金项目：国家自然科学基金面上项目（31071605；31470095）；江苏省科技支撑计划项目（BE2011390）
作者简介：任娣（1991—），女，硕士研究生，主要从事食品微生物研究。E-mail：18761868179@163.com
*通信作者：吕凤霞（1963—），女，教授，博士，主要从事酶工程研究。E-mail：lufengxia@njau.edu.cn