郑环宇 1，2，3，邵红梅 2，赵丹丹 2，白小娟 2，朱秀清 1，2，3，韩建春 1，2，3，刘天一 2，*
（1.东北农业大学 国家大豆工程技术研究 中心，黑龙江 哈尔滨 150028；2.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030；3.黑龙江省大豆技术开发研究中心，黑龙江 哈尔滨 150030）
摘 要：研究超高压对风味蛋白酶处理大豆分离蛋白（soybean protein isolate，SPI）中致敏原P34免疫活性的影响。并对脱敏后的SPI功能特性进行了研究。结果表明：超高压处理对风味蛋白酶消除SPI中致敏原P34具有促进作用，将消除P34致敏性的酶解时间由120 min缩短到了60 min。超高压联合风味蛋白酶酶解脱敏的SPI溶解性、黏度、保水性、吸油性、乳化性和乳化稳定性、起泡性和泡沫稳定性都比单纯酶酶解的SPI明显提高。
关键词：大豆；致敏蛋白；P34；超高压；酶解
大豆蛋白作为一种优质的植物蛋白源被广泛应用于食品和饲料业。但大豆蛋白中的一些致敏蛋白限制了其应用领域，特别是在婴幼儿食品和仔畜饲料中。目前已发现的大豆致敏蛋白多达38 种 ［1］，其中Gly m Bd 30K也称为油脂体相关蛋白P34。属于半胱氨酸蛋白酶的木瓜蛋白酶超家族边缘成员，是一种糖蛋白，糖基化位点位于成熟蛋白低170位天冬酰胺处，多糖组成为甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖、岩藻糖、木糖，比例分别为3∶2∶1∶1 ［2-3］。P34中含有3 对二硫键，主要由α-螺旋和β-折叠结构组成 ［4］。易引发过敏性皮炎，其特异性IgE抗体识别率高达65% ［5］，是大豆蛋白中主要的致敏蛋白成分 ［6-8］，因此研究如何去除P34对降低大豆蛋白的致敏性具有重要意义。
超高压技术也称高静压技术，是一种新型的非热加工手段，被誉为“当今世界十大尖端科技之一”，也是食品加工高新技术 ［9-12］。超高压通过影响蛋白质的分子体积、非共价键等，引起蛋白质分子结构的变化，进而改变其活性 ［13］。生物酶技术是改变蛋白质结构和性质的有效手段。利用生物酶酶解蛋白可使蛋白质的肽链发生断裂，生成分子质量更小的多肽或氨基酸，因此可利用酶解反应降解致敏蛋白，破坏其致敏蛋白的分子结构，从而降低其致敏性 ［14-15］。
本实验采用超高压联合风味蛋白酶水解对大豆分离蛋白（soybean protein isolate，SPI）进行处理，探讨其对致敏性蛋白P34的免疫活性的影响，以期为开发脱敏大豆蛋白产品提供理论依据。
1.1 材料、试剂与仪器
SPI（蛋白质含量92.5%） 哈尔滨高科技（集团）股份有限公司。
风味蛋白酶 诺维信（中国）生物技术有限公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、β-巯基乙醇、N，N，N'，N'-四甲基乙二胺、考马斯亮蓝R-250、甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷、牛血清白蛋白、预染的蛋白Marker（14.4～97 kD）、小鼠抗P34单细胞多克隆抗体、碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG、氮蓝四唑、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐 美国Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。
DYY-6C型电泳仪、DYY-24D型电泳槽、DYCZ-40D转印电泳仪、水平摇床 北京六一仪器厂；GL-20B高速冷冻离心机 上海安亭实验仪器厂；521-1恒温磁力搅拌器 上海司乐仪器厂；水浴恒温摇床 上海天呈仪器厂；GJJ型超高压均质机 美国PHD科技有限公司；FD-1D-50型真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 风味蛋白酶酶解SPI样品的制备
称取一定质量的SPI，以实际蛋白含量为准，配制成实际蛋白质含量为5%的SPI溶液，在4 800 r/min条件下高速均质2 min，所得溶液备用。取上述溶液调节pH 7.0，温度50 ℃后，按照酶活力为1 000 U/g SPI加入风味蛋白酶，在水浴恒温摇床中分别酶解一定时间，期间不断控制pH值使其保持不变，然后100 ℃沸水浴灭酶15 min，冷却，经真空冷冻干燥后冷藏备用。
1.2.2 超高压联合风味蛋白酶酶解SPI样品的制备
为探究超高压联合风味蛋白酶对消除大豆蛋白致敏原P34的影响，将SPI先经过超高压处理，再经风味蛋白酶酶解。具体步骤为：称取一定质量的SPI，以实际蛋白含量为准，配制成实际蛋白质含量为5%的SPI溶液，在4 800 r/min条件下高速均质2 min，所得溶液备用。取上述溶液经超高处理（压力为600 MPa，保压时间为20 min）后，调节pH 7.0，温度50 ℃后，按照酶活力为1 000 U/g SPI加入风味蛋白酶，在水浴恒温摇床中分别酶解一定时间，期间不断控制pH值使其保持不变，然后100 ℃沸水浴灭酶15 min，冷却，经真空冷冻干燥后冷藏备用。
1.2.3 蛋白酶酶活力的测定
参照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力测定法》中的福林-酚法进行测定。
1.2.4 蛋白酶解物水解度的测定
参照赵新淮等 ［16］方法进行。
1.2.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）
量取0.5 mL质量分数5%的SPI溶液置于1.5 mL离心管中，加入1 mL Tris-HCl（pH 8.2）缓冲液，涡旋混匀，超声30 min（每间隔10 min涡旋混匀一次）后，10 000 r/min离心30 min，取上清液，通过Bradford法测定其蛋白质含量。
利用SDS-PAGE法，分离胶质量分数为12%，浓缩胶质量分数为4.5%，交联度为3.6%，进行垂直电泳，浓缩胶压力为100 V，分离胶压力为150 V，恒压运行2 h。根据样品中蛋白质的定量分析，将蛋白质样品适当稀释与质量分数0.05%溴酚蓝缓冲液按1∶1混合后制备成蛋白质量浓度为2 μg/μL的上样液，沸水浴煮沸5 min，冷却后加样，加样量为10 μL，电泳完毕后，采用考马斯亮蓝R-250染色40 min，然后经电泳脱色液脱色，待蛋白带清晰后照相保存。
1.2.6 酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法对P34免疫活性的定量分析
采用间接酶联免疫法 ［17］，通过测定大豆蛋白致敏原P34在450 nm波长处的光密度（OD）值来说明P34的致敏性，并以SPI提取液和空白作对照，结果以致敏性残存率表示P34致敏性的变化。计算公式如下。
1.2.7 Western blotting法对P34免疫活性的定性分析
通过观察大豆蛋白致敏原P34在Western blotting图谱中相应谱带的颜色深浅变化和有无，来说明其致敏性的强弱和有无，具体操作见参考文献［17］。
1.2.8 脱敏SPI的功能特性研究
1.2.8.1 溶解性的测定
溶解性以氮溶解指数（nitrogen solubility index，NSI）表示，分别称取2 g脱敏SPI（SPI作对照），加入50 mL去离子水，配制成一定浓度的蛋白质溶液，调节pH值至7.0，搅拌30 min后离心（2 000 r/min，15 min），测定上清液中氮含量，重复实验3 次，以平均数表示测定结果。样品中上清液与总氮含量均采用凯氏定氮法测定，NSI的计算公式如下。
1.2.8.2 黏度的测定
采用毛细管黏度计法测定：配制底物质量分数为2.0%的脱敏SPI（SPI作对照）溶液，用 NDJ-8S型黏度计测定其黏度，重复测定3 次，结果取平均值表示。
1.2.8.3 吸油性的测定
准确称取3.00 g脱敏SPI（SPI作对照），加入大豆油9 mL，搅拌均匀后室温放置30 min，使之充分吸油，然后离心（7 500 r/min，30 min），除去液体后，测定残留物的质量，重复实验3 次，结果取平均值表示。
1.2.8.4 保水性的测定
准确称取5.00 g脱敏SPI（SPI作对照）加入50 mL去离子水，搅拌均匀后室温放置30 min，然后离心（4 500 r/min，30 min）分离出上清液，测定残留物质量，同时测定上清液中的氮含量转换为蛋白质质量，重复实验3 次，结果取平均值。
1.2.8.5 乳化性（emulsion ability，EA）及乳化稳定性（emulsion stability index，ESI）的测定
配制质量分数为0.75%脱敏SPI溶液（SPI作对照）15 mL，大豆油5 mL，高速乳化均质机以一定速率均质40 s，连续3 次共计2 min，制成乳浊液后，立即用微量注射器从底部3 个不同点分别抽取20 μL乳状液放入3 支试管中，再各加入5 mL质量分数0.1% SDS混匀，用0.1%的SDS作为空白，在500 nm波长处记录此时的吸光度（A 0），以此表示EA。30 min后，同样方法再抽取20 μL测定吸光度（A t）。其计算公式如下。
式中：t为30 min。
1.2.8.6 起泡性（foaming capacity，FC）及泡沫稳定性（foaming stability，FS）的测定
取100 mL质量分数为0.75%脱敏SPI溶液（SPI作对照），置于500 mL量筒中，使用高速乳化均质机以一定速率均质40 s，连续3 次共计2 min，记录均质后液面高度记为V 0，静置30 min后记录液面高度，记为V t。计算公式如下。
2.1 SPI的蛋白亚基组成及致敏原P34免疫活性验证
SPI的SDS-PAGE结果如图1所示，其中电泳图谱中颜色较深的相关条带分别为β-伴大豆球蛋白的α'亚基、β-伴大豆球蛋白的α亚基、β-伴大豆球蛋白的β亚基、11S大豆球蛋白的G1酸性链和G2碱性链、P34（Gly m Bd 30K）。为了进一步明确SPI中大豆蛋白致敏原P34的致敏性是否存在及其在电泳图中的位置，进行了P34的免疫印迹（Western blotting）测定，结果如图2所示。大豆蛋白致敏原P34在SPI中存在致敏性，并且活性很强。大豆蛋白致敏原P34在电泳图中的位置大约近于分子质量为31 kD的条带处。
图1 大豆分离蛋白的SDS-PAGE图
Fig.1 SDS-PAGE of soybean protein isolate
图2 大豆蛋白致敏原P34的Western blotting图
Fig.2 Western blotting pattern of soybean protein P34
2.2 超高压处理对风味蛋白酶酶解SPI水解度的影响
图3 超高压处理对风味蛋白酶水解SPI反应水解度的影响
Fig.3 Effect of ultra-high pressure on hydrolysis degree of SPI by flavourzyme
为了研究超高压对风味蛋白酶酶解SPI水解度的影响效果，以未经超高压处理而直接酶解的SPI进行对比。由图3可知，在各个时间下，经超高压处理后再用风味蛋白酶酶解SPI的水解度明显高于未经超高压处理的SPI的水解度，说明超高压处理有助于加速风味蛋白酶对SPI的酶解，超高压联合酶酶解优于单纯酶酶解反应效果。经超高压处理后的SPI，酶解时间90 min时水解度达到最大，时间继续延长，水解度基本保持不变。而未经超高压处理的SPI，酶解120 min时水解度才达到最大值，并且单纯用风味蛋白酶酶解SPI的水解度均低于超高压联合酶酶解处理SPI酶的水解度。
2.3 超高压对风味蛋白酶酶解SPI中P34含量和蛋白质组成的影响
图4 超高压处理对风味蛋白酶酶解SPI反应产物SDS-PAGE图谱的影响
Fig.4 SDS-PAGE of SPI hydrolyzed with flavourzyme combined with or without ultra-high pressure
M. Marker；0. SPI；1～5.酶解时间分别是10、30、60、90、120 min；A.未经超高压处理，风味蛋白酶酶解SPI；B.超高压处理联合风味蛋白酶酶解SPI。
由图4可知，未经超高压处理的SPI在风味蛋白酶酶解120 min时，大豆蛋白致敏原P34的谱带才完全消失，而经超高压处理的SPI只需经风味蛋白酶酶解60 min，P34的谱带就已完全消失，说明超高压处理有助于风味蛋白酶对大豆蛋白致敏原P34的降解。从电泳图中可以看到，经超高压处理后酶解物中小分子蛋白明显增加，这可能是由于超高压环境下，大豆蛋白分子发生解离，暴露出更多的风味蛋白酶作用位点，从而生成更多的小分子蛋白。
2.4 超高压对风味蛋白酶酶解SPI中P34致敏性的影响
图5 超高压处理对风味蛋白酶酶解SPI产物中P34致敏性的影响
Fig.5 Effect of ultra-high pressure on allergenicity of P34 in flavourzyme hydrolysate of SPI
由图5可知，不同酶解时间下，经超高压联合酶法处理的SPI中P34的致敏性明显低于单纯用酶酶解的SPI。并且经超高压处理后的SPI酶解60 min时，SPI中P34的致敏性为0。而未经超高压处理的SPI则需酶解120 min，SPI中P34的致敏性才能完全消除。这一分析结果与电泳分析结果相一致。
综合以上分析，超高压处理能够明显提高风味蛋白酶对大豆蛋白致敏原P34的降解效率，确定出超高压联合风味蛋白酶消除大豆蛋白致敏原P34的最佳工艺条件为：超高压压力600 MPa，保压20 min后，经风味蛋白酶在pH 7.0，温度50 ℃条件下，酶解60 min。
2.5 脱敏SPI中大豆蛋白致敏原P34免疫活性的验证
图6 超高压联合风味蛋白酶脱敏SPI中P34的Western blotting图
Fig.6 Western blotting profile of P34 in SPI subjected to combined treatment with flavourzyme and ultra high pressure
M. Marker；UFSPI.超高压联合风味蛋白酶脱敏大豆分离蛋白。
由图6可知，经超高压联合风味蛋白酶脱敏的SPI在Western blotting图谱中P34的相应位置上没有谱带，因此说明超高压联合风味蛋白酶脱敏的方法能将SPI中致敏原P34完全脱除，与SDS-PAGE图谱和ELISA结果一致。
2.6 脱敏SPI的功能特性
为了使去除大豆致敏蛋白P34的脱敏SPI得到更好的应用，对脱敏SPI的功能特性进行了研究，结果见图7。
图7 脱敏SPI的功能特性
Fig.7 Functional properties of desensitized SPI
FSPI.风味蛋白酶脱敏SPI；UFSPI.超高压联合风味蛋白酶脱敏SPI。
由图7A可知，经酶法处理和超高压联合酶法处理后的SPI溶解性都明显增加，其中超高压联合酶法处理的脱敏SPI的溶解性高于酶法处理的脱敏SPI。由图7B可知，两种脱敏大豆蛋白的黏度都明显降低，其中超高压联合酶法处理的脱敏SPI的黏度略高于酶法处理的SPI。由图7C可知，两种脱敏SPI的保水性都明显增加，其中超高压联合酶法处理的脱敏SPI的保水性要高于酶法处理的SPI。由图7D可知，两种脱敏SPI的吸油性明显降低，其中超高压联合酶法处理的脱敏SPI的吸油性要明显高于酶法处理的脱敏SPI。由图7E可知，两种脱敏SPI的EA都降低，而ESI升高，其中超高压联合酶法处理的脱敏SPI的EA和ESI高于酶法处理的脱敏SPI。由图7F可知，两种脱敏SPI的FC都降低，而FS升高，其中超高压联合酶法处理的脱敏SPI的FC和FS高于酶法处理的脱敏SPI。
综合以上分析，经超高压联合风味蛋白酶脱敏所得到的SPI不但P34的致敏性降低，而且产物的溶解性、黏度、吸水性、吸油性、EA、ESI、FC、FS都明显好于只经风味蛋白酶降解所得到的脱敏SPI。这可能是因为SPI在超高压环境下，其蛋白质的二级 ［18］、三级 ［19-21］和四级 ［22-24］结构发生了改变，致使蛋白质的肽链中局部肽段的构象、肽链中所有肽键和残基（包括侧链）间的相对位置或亚基结构发生了改变。从而使蛋白中具有活性的基团发生改变、暴露或隐藏，增加了风味蛋白酶的作用位点，不但能加速其降解P34的能力，还能使其水解物的功能特性得到更好地改善。
超高压联合风味蛋白酶消除大豆蛋白致敏原P34的最佳工艺条件为：超高压压力600 MPa，保压20 min后，经风味蛋白酶在pH 7.0，温度50 ℃条件下，酶解60 min。超高压处理对风味蛋白酶消除大豆蛋白致敏原P34具有促进作用，在此最佳条件下，将消除P34致敏性的酶解时间由120 min缩短到了60 min。超高压联合风味蛋白酶酶解脱敏的SPI部分功能特性明显优于只经风味蛋白酶酶解脱敏的SPI。
参考文献：
［1］ L'HOCINE L， BOYE J I. Allergenicity of soybean： new developments in identification of allergenic proteins， cross-reactivities and hypoallergenization technologies［J］. Critical Reviews in Food Science and Nutrition， 2007， 47（2）： 127-143.
［2］ OGAWA T， BANDO N， TSUJI H， et al. Investigation of the IgE binding proteins in soybeans by immune blotting with the sera of the soybean sensitive patients with atopic dermatitis［J］. Journal of Nutritional Science and Vitaminlogy， 1991， 37（6）： 555-565.
［3］ BANDO N， TSUJI H， YAMANISHI R， et al. Identification of the glycosylation site of a major soybean allergen， Gly m Bd 30K［J］. Bioscience， Biotechnology， and Biochemistry， 1996， 60（2）： 347-348.
［4］ ZHAO Xiaoyan， CHEN Fusheng， XUE Wentong， et al. FTIR spectra studies on the secondary structures of 7S and 11S globulins from soybean proteins using AOT reverse micellar extraction［J］. Food Hydrocolloids， 2008， 22（4）： 568-575.
［5］ HELM R M， COCKRELL G， CONNAUGHTON C， et al. Mutational analysis of the IgE-binding epitopes of P34/Gly m Bd 30K［J］. Journal of Allergy and Clinical Immunology， 2000， 105（2Pt1）： 378-384.
［6］ BATISTA R， MARTINS I， JENO P， et al. A proteomic study to identify soya allergens： the human response to transgenic versus nontransgenic soya samples［J］. International Archives of Allergy and Immunology， 2007， 144（1）： 29-38.
［7］ BIN Liu， DA Teng， WANG Xiumin， et al. Expression of the soybean allergenic protein P34 in Escherichia coli and its indirect ELISA detection method［J］. Applied Microbiology and Biotechnology， 2012，94（5）： 1337-1345.
［8］ 秦贵信， 孙泽威， 赵元， 等. 大豆中主要抗原蛋白的研究进展［J］. 吉林农业大学学报， 2008， 30（4）： 553-558.
［9］ 白腾辉， 潘润淑， 马亚萍， 等. 超高压处理对鸡肉品质影响的研究进展［J］. 农产品加工： 学刊， 2014（15）： 57-60.
［10］ 尚校兰， 李丛胜， 路彦霞， 等. 超高压协同温度处理武昌鱼茶香鱼肠的制备方法及其风味测定［J］. 食品科学， 2014， 35（16）： 80-84. doi：10.7506/spkx1002-6630-201416015.
［11］ 金湘云， 潘见， 张恩广， 等. 超高压处理提高鲜橙汁果乳稳定性研究［J］.食品工业， 2014， 35（6）： 83-86.
［12］ 许秀举， 戈娜， 王海英， 等. 超高压羊奶中蛋白质和氨基酸含量的实验研究［J］. 食品研究与开发， 2014， 35（13）： 100-101.
［13］ 李仁杰， 廖小军， 胡小松， 等. 超高压对蛋白质的影响［J］. 高压物理学报， 2014， 28（4）： 498-506.
［14］ TSUMURA K， WATAUR K， BNADO N. Preparation of hypoallergenic soybean protein with processing functionality by selective enzymatic hydrolysis［J］. Food Science and Technology Research， 1999， 5（2）： 171-175.
［15］ 王之盛， 况应谷， 周安国， 等. 酶解去除大豆产品抗原蛋白效果的研究［J］. 饲料博览， 2004（11）： 3-4.
［16］ 赵新淮， 冯志彪. 大豆蛋白水解物水解度测定的研究［J］. 东北农业大学学报， 1995， 26（2）： 178-181.
［17］ 郑环宇， 白小娟， 张丽丽， 等. 酶水解对大豆致敏蛋白P34免疫活性的影响及酶解产物理化性质研究［J］. 东北农业大学学报， 2014，45（6）： 6-15.
［18］ MOZHAEV V V， HEREMANS K， FRANK J， et al. High pressure effects on protein structure and function［J］. Proteins： Structure，Function， and Bioinformatics， 1996， 24（1）： 81-91.
［19］ SILVA J L， FOGUEL D， ROYER C A. Pressure provides new insights into protein folding， dynamics and structure［J］. Trends in Biochemical Sciences， 2001， 26（10）： 612-618.
［20］ BOONYARATANAKORNKIT B B， PARK C B， CLARK D S. Pressure effects on intra- and intermolecular interactions within proteins［J］. Biochimca et Biophysica Acta， 2002， 1595（1/2）： 235-249.
［21］ KNORR D， HEINZ V， BUCKOW R. High pressure application for food biopolymers［J］. Biochimca et Biophysica Acta， 2006， 1764（3）：619-631.
［22］ KING L， WEBER G. Conformational drift of dissociated lactate dehydrogenases［J］. Biochemistry， 1986， 25（12）： 3632-3637.
［23］ SILVA J L， MILES E W， WEBER G. Pressure dissociation and conformational drift of the beta dimer of tryptophan synthase［J］. Biochemistry， 1986， 25（19）： 5780-5786.
［24］ RUAN K， WEBER G. Dissociation of yeast hexokinase by hydrostatic pressure［J］. Biochemistry， 1988， 27（9）： 3295-3301.
Effect of Ultra-High Pressure on Allergenicity of Soybean Protein P34 and Functional Properties of Soybean Protein Isolate
ZHENG Huanyu
1，2，3， SHAO Hongmei
2， ZHAO Dandan
2， BAI Xiaojuan
2， ZHU Xiuqing
1，2，3， HAN Jianchun
1，2，3， LIU Tianyi
2，*
（1. National Research Center of Soybean Engineering and Technology， Northeast Agricultural University， Harbin 150028， China；2. College of Food Science， Northeast Agricultural University， Harbin 150030， China； 3. Soybean Technology Development Research Center of Heilongjiang Province， Harbin 150030， China）
Ab stract：The effect of ultra-high pressure （UHP） combined with enzymatic hydrolysis on the allergenicity of P34 in soybean protein isolate （SPI） and the functional properties of desensitized SPI was studied. The results showed that ultra-high pressure could accelerate the hydrolysis process to eliminate the immune activity of soybean protein P34 using flavourzyme and improve the hydrolysis efficiency by 50%. The solubility， viscosity， emulsification， water-holding capacity， oil-absorbing capacity， emulsion stability， foaming capacity and foam stability of SPI subjected to the combined treatment of ultra-high pressure and hydrolysis were improved obviously when compared with the latter alone.
Key words：soybean； allergenic protein； P34； ultra-high pressure； hydrolysis
中图分类号：TQ936.2
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）13-0095-06
doi：10.7506/spkx1002-6630-201513019
收稿日期：2014-11-01
基金项目：国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2013AA102208）；“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD34B04）
作者简介：郑环宇（1975—），女，副研究员，博士，研究方向为大豆精深加工。E-mail：841625891@qq.com
*通信作者：刘天一（1980—），女，讲师，博士，研究方向为粮油加工。E-mail：ltyone80@gmail.com