响应面法优化酶法制备杏鲍菇蛋白及其营养评价

张梦甜 1,杨文建 1,裴 斐 1,赵立艳 2,安辛欣 2,马 宁 1,程 薇 3,胡秋辉 1,*

(1.南京财经大学食品科学与工程学院,江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心,江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室,江苏 南京 210023; 2.南京农业大学食品科技学院,江苏 南京 210095;3.湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所,湖北 武汉 430064)

摘 要:为确定纤维素酶法提取杏鲍菇蛋白的最佳工艺,并评价所得蛋白的营养价值,在单因素试验的基础上,选择液料比、加酶量(以原料干粉计)、pH值和酶作用温度为影响因素,以蛋白得率为响应指标,利用Box-Behnken进行响应面分析,利用氨基酸系数法来评价杏鲍菇蛋白的营养价值。结果表明:杏鲍菇蛋白提取的最佳工艺为:液料比35∶1(V/m)、加酶量2.6%、pH 7.2、酶解温度60 ℃,此条件下的杏鲍菇蛋白得率达10.68%;按此方法所得的杏鲍菇蛋白的必需氨基酸与非必需氨基酸比值(essential amino acids/nonessentia amino acids,EAA/NEAA)为0.65,必需氨基酸与总氨基酸比值(EAA/total amino acids,TAA)为0.40,氨基酸比值系数分(score of ratio coeffi cient,SRC)为75.02。该工艺操作简单,所得蛋白品质较高,可用于工业生产杏鲍菇蛋白产品。

关键词:杏鲍菇;蛋白;响应面法;氨基酸组成

杏鲍菇(Pleurotus eryngii)又名刺芹侧耳,隶属真菌门、担子菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属,被誉为“菇中之王” [1]。杏鲍菇蛋白含量丰富,是常规蔬菜的 3~6 倍 [2],有研究表明,杏鲍菇蛋白具有较高的生物活性,Mariga等 [3]进行了杏鲍菇蛋白对多种肿瘤细胞增殖抑制作用及免疫细胞生长影响作用等体外实验,结果表明杏鲍菇蛋白具有良好的抗氧化、抗肿瘤及免疫调节活性,因此杏鲍菇蛋白具有良好的产品开发潜质。目前关于杏鲍菇功能物质提取工艺的相关研究主要集中于多糖 [4-5],杏鲍菇蛋白高效制备工艺与产品开发的研究未见报道。

目前蛋白的提取方法大都为 传统的碱溶酸沉法 [6]、盐溶法 [7]、酶法 [8]、超声波辅助法 [9]等。其中酶法提取所需反应条件温和,不仅保持了蛋白质的营养价值和功能性质 [10-12],而且显著降低了反应成本。对于食用菌而言,真菌细胞的细胞壁使细胞保持一定的形状,其主要成分是几丁质、纤维素等己糖或氨基己糖构成的多糖链 [13],其中杏鲍菇中纤维素含量达12.74% [14],故可通过水解纤维素破壁释放蛋白,促进蛋白溶解的原理来提取杏鲍菇蛋白。

本实验主要研究纤维素酶法优化杏鲍菇蛋白的提取工艺,并进行了杏鲍菇蛋白的氨基酸组成分析,得到具有较高营养价值的杏鲍菇蛋白制品,为工业制备杏鲍菇蛋白制品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜杏鲍菇(Pleurotus eryngii)由江苏天丰生物科技有限公司提供。

纤维素酶(酶活力≥1.5×10 4U/g) 国药集团化学试剂有限公司;2,2'-联喹啉-4,4'-二甲酸二钠(butyleyanoacrylate,BCA)试剂盒 北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

FW高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司;Allegra系列冷冻离心机 美国Beckman Coulter有限公司;RE52CS旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;伯乐i-mark酶标仪 美国Bio-Rad公司;MD31透析袋 美国Spectrum公司;L-8900高速氨基酸分析仪 日立高新技术公司;Barnstead GenPure xCAD超纯水仪 南京微弗德科学仪器有限;BUCHI小型喷雾干燥仪 上海万捷科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料预处理

新鲜杏鲍菇经清洗、切片放于烘箱中50 ℃鼓风烘干,超微粉碎机粉碎,过100 目筛,置于4 ℃条件下备用。

1.3.2 蛋白质含量测定方法

采用BCA法 [15],以牛血清白蛋白为标准蛋白,BCA工作液染色。按公式(1)计算杏鲍菇蛋白得率。

式中:Y为杏鲍菇蛋白得率/%;ρ为蛋白提取液质量浓度/(mg/mL);V为蛋白提取液体积/mL;m为杏鲍菇干粉质量/mg。

1.3.3 杏鲍菇蛋白提取方法

1.3.3.1 酶法提取杏鲍菇蛋白

称取一定量杏鲍菇粉,按一定液料比加蒸馏水并调节pH值,加入一定比例纤维素酶(以原料干粉计)并充分搅拌,在一定温度下恒温振荡反应4 h,反应完成后放入80 ℃水浴10 min钝化酶,取出放置至常温后13 000×g离心20 min。收集上清液,取沉淀重复上述步骤再次提取,合并两次所得的上清液,测定总蛋白含量。将上清液直接喷雾干燥得到杏鲍菇粗蛋白(Pleurotus eryngii crude protein,PECP)。将所得上清液调pH值至5.0放置30 min,再4 000×g离心20 min,取沉淀透析,真空冷冻干燥得到杏鲍菇纯化蛋白(Pleurotus eryngii purified protein,PEPP)。

1.3.3.2 水提法提取杏鲍菇蛋白

取5 g杏鲍菇干粉,按比例加入蒸馏水,充分搅拌后置于恒温振荡器中反应4 h,离心取上清,沉淀再次提取,合并上清液,测蛋白含量。

1.3.4 酶法提取杏鲍菇蛋白工艺的确定

1.3.4.1 单因素试验

分别考察液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1(V/m),pH值(5、6、7、8、9),纤维素酶添加量(以原料干粉质量计)(0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%),反应温度(30、40、50、60、70 ℃)。考察单一因素时,其余条件固定为:液料比30∶1、pH 7、纤维素酶添加量2.5%、反应温度60 ℃。

1.3.4.2 响应面优化试验

在单因素试验的基础上,选择液料比、加酶量、酶作用pH值、酶作用温度为关键工艺参数,进行四因素三水平Box-Behnken试验设计。以杏鲍菇蛋白得率作为响应值,利用Design-Expert 8.0.6 软件对数据进行分析,得出最佳的纤维素酶法提取杏鲍菇蛋白工艺条件。

1.3.5 氨基酸组成分析及氨基酸比值系数法评价杏鲍菇蛋白的营养价值

参照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的测定》。准确称取一定量样品于水解管中,加入适量6 mol/L HCl,在减压下密封水解管,将其放入烘箱,在110 ℃条件下水解24 h。将水解后的样品过滤后放入圆底烧瓶,旋转蒸发去除盐酸。所得样品用0.02 mol/L HCl定容至50 mL,吸取少量水解液经0.22 μm滤膜过滤,装入进样瓶中待测。

氨基酸比值系数法是根据氨基酸平衡理论,并结合联合国粮食及农业组织/世界卫生组织(Food and Agriculture Organization/World Health Organization,FAO/WHO)的必需氨基酸模式,分别用公式(2)、(3)和(4)计算样品中必需氨基酸的包括氨基酸比值(ratio of amino acids,RAA)、氨基酸比值系数(ratio coefficient,RC)和氨基酸比值系数分(score of ratio coeffi cient,SRC)3 个指标,来评价蛋白质的营养价值。

式中:C 1为评价蛋白质中的必需氨基酸含量/(mg/g pro);C 2模式中对应的必需氨基酸含量/(mg/g pro) 分别为RAA、RC的平均值;n为WHO/FAO必需氨基酸参考模式中计算所得RC的个数。

1.4 数据处理

杏鲍菇蛋白提取优化响应面试验采用Design-Expert 8.0.6软件处理,数据以3 次独立样品测定结果的 ±s表示,并进行方差分析(analysis of variance,ANOVA),用SPSS 18.0软件进行显著性分析,检验水平α为0.05。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

由大量文献资料 [17-20]可知,影响酶法提取蛋白的主要影响因素有液料比、加酶量、pH值和酶解温度,故选取这4 个因素进行单因素试验,结果如图1所示。由图1A可知,杏鲍菇蛋白的得率随着液料比的增加呈先增大后减小的趋势,当液料比为30∶1时,蛋白得率达到最大为8.67%。这可能是因为溶液体积较小时,由于含水量低,底物与酶接触不充分,导致得率较低;随着含水量增加,底物与酶作用充分;继续增加水量而底物含量不变,酶与底物的结合机率下降,使得率减小 [21]。由图1B可知,随着加酶量的增加,蛋白得率先增加后趋向平缓,在加酶量取2.5%时达到最大。其中可能的原因是加酶量低导致细胞壁骨架不能被有效降解,细胞壁没有充分溶解,细胞内含物质释放不完全,导致提取率低 [22],当加酶量足够时,细胞壁被充分降解,蛋白从细胞中被释放出来,提高得率。由图1C可知,pH值为5~7时,蛋白得率随着pH值的增加而增加,而纤维素酶的最适作用pH值在5左右,这可能是因为纤维素酶酶解细胞壁释放细胞内含物是影响蛋白得率的关键因素之外 [23],溶液的酸碱度对促进蛋白溶解也起到了至关重要的作用 [24],在这个pH值范围内,两者对蛋白质的溶解起到了良好的共同促进效应;而当pH值为8时,蛋白得率有所下降,可能是因为此时纤维素酶的活性受到较大影响,酶解作用降低;当pH值继续增加到9时,蛋白得率增加,这很可能是碱溶作用,虽蛋白得率有所提高,但此反应pH值不温和,故此pH值不予考虑。由图1D可知,随着温度的增加,蛋白得率先增加后降低。在温度为60 ℃时,蛋白得率最大,这与纤维素酶的最适作用温度有关。温度对底物水解作用有两方面 [25]:一方面温度升高使分子活跃,增大酶分子与底物之间的碰撞概率,从而促进了水解作用,提高得率;另一方面温度升高也加速酶的变性,降低酶活性,水解作用减弱,得率降低。因此,选取液料比30∶1、加酶量2.5%、pH 7和酶解温度60 ℃作为响应面中心点。

图1 4 个单因素对杏鲍菇蛋白得率的影响
Fig.1 Effects of four single factors on the yield of Pleurotus eryngii protein

2.2 响应面优化试验

2.2.1 响应面试验设计及结果分析

响应面试验设计与结果如表1所示。

表1 Box-Behnken试验设计与结果
Table1 Design and results of Box-Behnken experiments

试验号X 1液料比X 2加酶量/%X 3酶解pH X 4酶解温度/℃Y蛋白得率/%实际值预测值11(40∶1)-1(1.5)0(7.0)0(60)7.127.12 20(30∶1)0(2.5)-1(6.0)-1(50)7.537.49 30-101(70)5.966.09 400 008.018.01 511(3.5)008.858.92 600007.367.62 7-1(20∶1)-1007.127.17 801-1011.0210.17 910018.338.60 10001(8.0)-19.9810.17 1110-106.876.82 120-1-109.019.02 1301017.567.80 1401108.158.37 1500008.808.66 16-115007.657.43 171-1007.577.19 1800-1-18.418.55 190-1019.9010.17 2000008.118.26 210-10-17.077.32 2210109.339.10 2300009.9810.17 24100-18.228.00 25010-18.618.42 26-10-107.237.32 270-1109.139.03 28-100-17.607.27 2900009.9 910.17

2.2.2 回归模型的建立与显著性分析

运用Design-Expert 8.0.6软件对表1的数据进行分析,得到液料比、加酶量、酶解pH值、酶解温度与蛋白得率之间的二次回归方程为

由表2回归模型的方差分析可知,回归模型极显著(P<0.000 1),失拟检验不显著,说明回归模型与实际情况拟合得很好,实验误差小,可用此模型对杏鲍菇蛋白得率进行分析及预测。模型中一次项X 1与X 4极显著,X 2、X 3显著;交互项X 1X 2、X 2X 3显著;二次项 均极显著。

为了能更好地反映液料比与加酶量(X 1X 2)、加酶量与酶解pH值(X 2X 3)交互作用对杏鲍菇蛋白得率的影响规律,分别将模型中其他2 个因素固定在0水平,绘制出相应的三维曲面图,如图2所示。

表2 拟合多元二次方程模型的方差分析
Table2 Analysis of variance for the fitted multivariate quadrati c equation model

方差来源方差和自由度均方差F值P值模型36.20142.5920.64<0.000 1 X 14.4514.4535.55<0.000 1 X 20.9410.947.470.016 2 X 30.9610.967.650.015 2 X 41.4411.4411.460.004 4 X 1X 20.7710.776.180.026 1 X 1X 30.01610.0160.120.729 2 X 1X 40.2410.241.920.187 9 X 2X 31.0811.088.630.010 8 X 2X 40.3010.302.370.145 9 X 3X 40.03610.0360.290.599 8 X 18.2618.2665.92<0.000 1 X2 2 5.2015.2041.55<0.000 1 X3 2 19.94119.94159.17<0.000 1残差1.75140.13失拟项0.85100.0850.380.902 5纯误差0.9040.22相关之和37.9528 3.8513.8530.76<0.000 1 X4 22决定系数:R 2= 0.953 8 调整决定系数:R 2 Adj= 0.907 6

图2 两显著交互效应对杏鲍菇蛋白得率的影响
Fig.2 Response surface plots showing the effects of interactions of enzyme/substrate ratio with water to solid ratio or initial pH on the yield of Pleurotus eryngi protein

图2 A表明了固定酶解pH 7、酶解温度60 ℃,液料比与加酶量交互作用对杏鲍菇蛋白得率的影响。在加酶量1.5%~3.0%范围内,液料比20∶1~35∶1范围内时,两者存在协同作用,得率随着液料比和加酶量的增加而增加;而加酶量3%~3.5%范围内,液料比35∶1~40∶1范围内时,蛋白得率随着2 个因素的增大并无增加,趋向平缓和降低。液料比和温度分别为30∶1和60 ℃时,加酶量与pH值交互作用对蛋白得率的影响如图2B所示。当加酶量固定不变时,随着pH值的增加,蛋白得率先增加后降低;pH值一定时,蛋白得率随着加酶量的增加而增加后趋向于平缓。

2.2.3 最优化工艺条件及验证

运用Design-Expert 8.0.6软件所获得杏鲍菇蛋白最佳提取工艺条件为:液料比为32.44∶1、加酶量为2.56%、pH 7.16、酶解温度为59.09 ℃,将此条件代入拟合方程,计算出来的响应值杏鲍菇蛋白得率为10.30%。为了便于生产中的实际操作的可行性,将提取条件调整为液料比为35∶1、加酶量为2.6%、pH 7.2、酶解温度为60 ℃,将此条件代入拟合方程,计算出来的响应值杏鲍菇蛋白得率为10.18%,通过验证实验,在此条件下的实际蛋白得率为(10.68±0.18)%,经SPSS软件显著性分析,实际蛋白得率与理论值差异不显著(P>0.05),因此证明该模型能很好地预测实验结果。

2.2.4 酶法提取与水提杏鲍菇蛋白比较

水提所得杏鲍菇蛋白得率为(6.10±0.49)%,酶法提取所得杏鲍菇蛋白得率(10.68±0.18)%明显高于水提法。

2.3 氨基酸结果分析

蛋白质中氨基酸种类齐全且符合FAO/WHO的氨基酸模式标准,则表示此蛋白质营养价值较高,适合人体生理需求。现通过实验测得杏鲍菇蛋白粉中的氨基酸组成并对其组成成分进行分析,分析结果如表3、4所示。

表3 杏鲍菇蛋白粉氨基酸组成分析
Table3 Amino acid composition of Pleurotus eryngii protein powder

注:EAA. 必需氨基酸(essential amino acids);NEAA. 非必需氨基酸(nonessentia amino acids);TAA. 总氨基酸比值(total amino acids)。

(mg/g)氨基酸种类氨基酸含量/(mg/g)苏氨酸(Thr)34.90天冬氨酸(Asp)70.97缬氨酸(Val)38.83丝氨酸(Ser)32.99蛋氨酸(Met)11.50谷氨酸(Glu)77.02异亮氨酸(Ile)34.01甘氨酸(Gly)34.80亮氨酸(Leu)59.33丙氨酸(Ala)42.87苯丙氨酸(Phe)28.35半胱氨酸(Cys)2.45赖氨酸(Lys)36.86酪氨酸(Tyr)31.52脯氨酸(Pro)27.72精氨酸(Arg)36.18组氨酸(His)13.83总量243.78总量370.35 EAA/NEAA0.65EAA/TAA0.40 EAANEAA氨基酸种类氨基酸含量/

由表3可知,杏鲍菇中的蛋白质中天冬氨酸和谷氨酸含量最高,Durand等 [26]关于海马LTP记忆参与功能依赖性突触形成的假说中证实了谷氨酸在学习和记忆神经元可塑性方面均起重要作用。必需氨基酸占杏鲍菇蛋白粉总氨基酸含量的40%,符合WHO/FAO标准模式所规定的40%;而杏鲍菇蛋白中必需氨基酸与非必需氨基酸含量的比值为0.65,明显符合WHO/FAO标准模式规定的0.60 [27],说明该蛋白粉具有很好的营养价值。

表4 杏鲍菇蛋白粉的RAA、RC及SRC分析
Table4 Analysis of RAA, RC and SRC of Pleurotus erynnggii protein powder

蛋白质ThrIleLeuLysMet+Cys Phe+TyrValSRC特征值40407055356050杏鲍菇蛋白RAA0.870.850.850.670.401.00.7875.02 RC1.131.101.100.870.521.301.01

本研究应用氨基酸系数比值法 [28],并选取已报道的动物蛋白中的鸡蛋蛋白和植物中的大豆蛋白进行对比来评价杏鲍菇蛋白粉的营养价值。氨基酸比值(RAA)表示食品中蛋白质的含量相当于模式氨基酸的倍数;氨基酸比值系数(RC)反映食物中氨基酸组成含量与模式氨基酸的偏离程度 [29],RC值为1时,表明食物蛋白的氨基酸组成含量比例与模式氨基酸一致,偏离1则表示偏离氨基酸模式,RC值最小的氨基酸为限制氨基酸,由表4可知,含硫氨基酸(蛋氨酸和半胱氨酸)为杏鲍菇蛋白的第一限制氨基酸;氨基酸比值系数分(SRC)越接近100,蛋白质的营养价值越高,鸡蛋蛋白和大豆蛋白的SRC值分别为84.09和61.22 [30],杏鲍菇蛋白的SRC为75.02。根据 SRC 值的大小进行3 种蛋白的营养排序:鸡蛋蛋白>杏鲍菇蛋白>大豆蛋白,酶法制得的杏鲍菇蛋白的营养明显较大豆蛋白更优,且接近于鸡蛋蛋白。

3 结 论

本研究通过单因素试验分析了纤维素酶法提取杏鲍菇蛋白的最优条件,并在此基础上采用Box-Behnken响应面试验设计得到最佳工艺参数:液料比为35∶1、加酶量为2.6%、pH 7.2、酶解温度为60 ℃,该条件下杏鲍菇蛋白得率达10.68%,建立的回归模型能很好地预测杏鲍菇蛋白得率。通过氨基酸含量测定及氨基酸系数比值法分析,可知杏鲍菇蛋白的必需氨基酸占杏鲍菇蛋白粉总氨基酸含量的40%,必需氨基酸与非必需氨基酸含量的比值为0.65,符合WHO/FAO的蛋白理想模式EAA/TAA比值在40%左右,EAA/NEAA值应大于0.60。该蛋白制品的氨基酸比值系数分75.02明显高于大豆蛋白61.22。因此,证明了杏鲍菇蛋白的纤维素酶法提取可为工业化生产杏鲍菇蛋白产品提供有效的理论依据,并可为杏鲍菇蛋白的更深入研究提供理论基础。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis for Preparing Pleurotus eryngii Protein by Response Surface Methodology and Nutritional Evaluation

ZHANG Mengtian 1, YANG Wenjian 1, PEI Fei 1, ZHAO Liyan 2, AN Xinxin 2, MA Ning 1, CHENG Wei 3, HU Qiuhui 1,*
(1. Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing, Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety, College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023, China;2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 3. Institute of Processing of Agricultural Produce and Nuclear Agricultural Research, Hubei Academy of Agricultural Science, Wuhan 430064, China)

Abstract:The objectives of this study were to develop an optimized enzymatic method for extracting proteins from Pleurotus eryngii and to evaluate the nutritional value of the obtained proteins. Response surface methodology (RSM)based on a Box-Behnken design was used in combination with single factor experiments to establish the optimal hydrolysis conditions as follows: water to solid ratio, 35:1 (V/m); enzyme/substrate ratio, 2.6% (on a dry weight basis); initial pH, 7.2;and temperature, 60 ℃, leading to an extraction yield of 10.68%. Amino acid coefficient method was used to evaluate the nutritional value of the proteins extracted from Pleurotus eryngii. The essential amino acids/non-essential amino acid (EAA/ NEAA) value, essential amino acids/total amino acids (EAA/TAA) value and score of ratio coefficient (SRC) of the obtained proteins were 0.65, 0.40 and 75.02, respectively. This extraction procedure was simple and the obtained proteins had good quality so that it can be used in industrial production of Pleurotus eryngii protein products.

Key words:Pleurotus eryngii; protein; response surface methodology; amino acid composition

中图分类号:TS210.4

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2015)13-0125-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201513024

收稿日期:2015-01-27

基金项目:公益性行业(农业)科研专项(201303080)

作者简介:张梦甜(1989—),女,硕士研究生,研究方向为食品科学。E-mail:15251879082@163.com

*通信作者:胡秋辉(1962—),男,教授,博士,研究方向为食品与农产品加工。E-mail:qiuhuihu@njue.edu.cn