姜太玲，吴红洋，申光辉，董小华，张志清*
（四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014）
摘 要：利用酸性蛋白酶酶解花椒籽蛋白制备抗菌肽，以底物质量浓度、酶与底物比、pH值、酶解温度、酶解时间为影响因子，在单因素试验结果的基础上，应用Box-Behnken方法进行三因素三水平的试验设计，以对大肠杆菌的抑菌率为响应值，应用响应面法对花椒籽蛋白制备抗菌肽工艺进行优化。其最佳工艺条件为：底物质量浓度30 mg/mL、酶与底物比3.0%、酶解pH 4.0、酶解温度51.2 ℃、酶解时间4.7 h，此条件下酶解产生的抗菌肽复合物的水解度为9.05%，对大肠杆菌的抑菌率为56.98%。
关键词：花椒籽蛋白；抗菌肽；酸性蛋白酶；抑菌率
抗菌肽又叫抗生素肽、抗微生物肽，是由多种生物细胞特定的基因编码经外界条件诱导而产生的一类具有广谱抗细菌、真菌、病毒、寄生虫、抑杀肿瘤细胞等生物活性作用的多肽，由12～100 个氨基酸组成，分子质量小于10 kD，是生物先天免疫系统的重要组成部分 ［1-4］。由于抗菌肽具有广谱杀菌性以及良好的溶解性和稳定性，易在 消化系统中降解成对人类副作用小、使用安全的氨基酸，对人类而言这将成为一种具有前途的新型食品防腐剂。目前有学者用从天然蚕蛹、甲基营养型芽孢杆菌中分离得到的抗菌肽分别对鲜猪肉、罗非鱼片进行处理后，表现出良好的防腐效果 ［5-6］，而从乳酸菌中分离得到的乳酸链球菌素（Nisin）已在50多个国家和地区广泛应用于食品的防腐保鲜 ［7］。
花椒籽，是花椒果皮生产中的主要副产物，除含有丰富的油脂外，还含有18%的蛋白质 ［8］。目前，对于花椒籽蛋白的研究主要集中在提取工艺上，而从其蛋白中提取活性肽的研究除王辉 ［9］、宋燕 ［10］等制备出的抗氧化肽外，还未见从花椒籽蛋白中提取具有抑菌活性多肽的研究报道。而在植物种子中，有学者已从咖啡豆、豇豆、小麦、苏铁和稗草等植物种子中分离出抗菌肽 ［11-15］，这为从花椒籽蛋白中制备具有抗菌活性的多肽提供了理论上的依据。
目前，制备抗菌肽常用到的蛋白酶包 括胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶等，利用这些蛋白酶已从酪蛋白、螺旋藻、油茶粕蛋白和小麦蛋白等多种材料中分离出抗菌肽 ［16-19］，而选用酸性蛋白酶制备抗菌肽的研究很少见报道。本实验以花椒籽蛋白为原料，以其酶解产物为研究对象，对大肠杆菌的抑菌率为指标，优化酸性蛋白酶制备花椒籽蛋白抗菌肽的条件，对制备抗菌肽的主要因素进行研究，同时利用响应面回归分析对酶解条件进行优化，以期为花椒籽蛋白抗菌肽在食品中的应用提供理论基础。
1.1 材料、试剂与仪器
花椒籽 凉山州金阳县花椒产区。
大肠杆菌（ATCC 25922） 四川农业大学食品学院微生物实验室鉴定保存；酸性蛋白酶（酶活力≥50 U/mg） 北京华迈科生物技术有限责任公司；氢氧化钠、琼脂粉、氯化钠 成都科龙化工试剂厂；蛋白胨、牛肉膏 北京奥博星生物科技有限责任公司；LB液体培养基：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g，蒸馏水1 000 mL，调pH值至7.4，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。
CP225D型电子天平 德国赛多利斯股份公司；真空冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；SYQ-DSX-280B型手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；SW-CJ型洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；HZQ-A型恒温振荡培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；Thermo ST16R冷冻离心机 美国赛默飞有限公司。
1.2 方法
1.2.1 花椒籽蛋白的提取 ［20］
脱脂花椒籽→NaOH溶液提取→离心去沉淀→HCl溶液进行酸析→离心去上清液→水洗沉淀→调pH值→真空冷冻干燥→花椒籽蛋白
1.2.2 酸性蛋白酶对花椒籽蛋白的酶解
酶解制备工艺参考薛培宇等 ［21］的方法，并作一定的修改。取1.0 g花椒籽蛋白溶于适量的去离子水中，在适当温度的恒温水浴锅中预热，达到酶解温度后用HCl调节溶液的pH值至适宜值，加入酸性蛋白酶进行酶解。酶解过程中不断搅拌，并滴加HCl或NaOH以维持溶液的pH值。酶解完成后取出放入95 ℃水浴锅中灭酶15 min，冷却，然后4 ℃、8 000 r/min离心10 min，取上清液调节pH值至中性，真空冷冻干燥，冻干粉保存备用。
1.2.3 单因素试验设计
按照1.2.2节的方法制备花椒籽蛋白的酶解液，对其中的底物质量浓度（10、20、30、40、50 mg/mL），酶与底物比（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）、酶解pH值（2.5、3.0、3.5、4.0、4.5）、酶解温度（40、45、50、55、60 ℃）、酶解时间（2、3、4、5、6 h）进行考察。
1.2.4 响应面试验设计
根据单因素试验结果，在底物质量浓度30 mg/mL、pH 4.0的条件下，采用Box-Behnken设计原理，选取酶与底物比（X 1）、酶解温度（X 2）、酶解时间（X 3）这3 个影响酶解产物抑菌活性的主要因素作为响应面考察因素，以对大肠杆菌抑菌率为响应值，利用Design Expert 8.0.5b软件对试验数据进行多元回归拟合及对模型进行方差分析。
1.2.5 水解度的测定
采用甲醛滴定法 ［22］测定。
1.2.6 抑菌活性的测定
称取0.250 g冻干粉溶于2 mL去离子水中，调节样液的pH值至近中性，4 ℃、12 000 r/min离心5 min，然后用0.22 μm的滤膜过滤除菌后进行抑菌实验。
抑菌率的测定参照文献［23］，并作一定的修改。以大肠杆菌为受试菌，接种于LB液体培养基中，37 ℃恒温培养24 h。取过滤除菌后的样液100 μL，加LB培养基30 μL和菌悬液70 μL（菌悬液浓度为10 3～10 4CFU/mL）并混匀，37 ℃、150 r/min摇床孵育1 h，取100 μL倾注于LB平板，37 ℃培养过夜，计算菌落数。以去离子水为对照组。计算抑菌率。实验重复3次，结果取平均值。
1.3 数据处理
响应面分析以外的其他数据采用Excel进行分析，0.01＜P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。
2.1 酸性蛋白酶酶解花椒籽蛋白制备抗菌肽主要影响因素分析
2.1.1 底物质量浓度对酶解产物抑菌效果的影响
在酶与底物比4.0%、pH 3.0、酶解温度50 ℃、酶解时间3 h的条件下，测定不同底物质量浓度对酶解产物抑菌效果的影响，结果见图1。随着底物质量浓度的增大，酶解产物的抑菌活性增加，当底物质量浓度为30 mg/mL时，酶解产物对大肠杆菌的抑菌率达到最大；随着底物质量浓度的增加，酶解产物的抑菌活性呈现先下降后升高的趋势，下降的原因可能是底物质量浓度增大导致酶解不完全，其中具有抑菌活性组分的比例下降，致使抑菌率降低，而质量浓度在40 mg/mL后的抑菌率出现升高，其具体原因还有待进一步研究。因此，最佳底物质量浓度为30 mg/mL，优化试验底物质量浓度选用30 mg/mL。
图1 底物质量浓度对酶解产物抑菌活性的影响
Fig.1 Effect of substrate concentration on the antibacterial activity of hydrolysate
2.1.2 酶与底物比对酶解产物抑菌效果的影响
在底物质量浓度30 mg/mL、pH 3.0、酶解温度50 ℃、酶解时间3 h的条件下，测定不同酶与底物比对酶解产物抑菌效果的影响，结果见图2。随着酶与底物比的增加，酶解产物的抑菌活性呈现先增加后降低的趋势，酶与底物比为3.0%时酶解产物的抑菌活性达到最大。原因可能是酶与底物比较低时，酶解不充分，随着酸性蛋白酶与花椒籽蛋白比例的增加，酶解产物中具有抑菌活性的多肽量增加，抑菌活性随之增强；当酶与底物比较高时，酶与酶之间会产生竞争性抑制，过量的蛋白酶会将具有抑菌活性的多肽酶解成无抑菌活性的小分子片段或酶解成具有促进大肠杆菌生长作用的氨基酸等营养物质。因此，最佳酶与底物比为3.0%，优化试验酶与底物比选用2.0%～4.0%。
图2 酶与底物比对酶解产物抑菌效果的影响
Fig.2 Effect of enzyme/substrate ratio on the antibacterial activity of hydrolysate
2.1.3 pH值对酶解产物抑菌效果的影响
在底物质量浓度30 mg/mL、酶与底物比3.0%、酶解温度50 ℃、酶解时间3 h的条件下，测定不同pH值对酶解产物抑菌效果的影响，结果见图3。随着pH值的增加，酶解产物的抑菌活性呈现先升高后降低的趋势，pH值为4.0时，抑菌活性达到最大。原因可能是，当pH值低于或高于酶的最适pH值时，pH值会破坏蛋白酶的空间结构，引起酶的失活；也可能改变了底物的解离状态，导致底物不能与酶结合。因此，最佳pH值为4.0，优化试验pH值选用4.0。
图3 pH值对酶解产物抑菌效果的影响
Fig.3 Effect of pH on the antibacterial activity of hydrolysate
2.1.4 酶解温度对酶解产物抑菌效果的影响
在底物质量浓度30 mg/mL、酶与底物比3.0%、 pH 4.0、酶解时间3 h的条件下，测定不同酶解温度对酶解产物抑菌效果的影响，结果见图4。随着酶解温度的升高，酶解产物的抑菌活性呈现先增加后降低的趋势，酶解温度为55 ℃时，抑菌活性达到最大。原因可能是，酶解温度的升高，提高了酶分子与花椒籽蛋白分子间的碰撞概率，使抑菌活性增大；当酶解温度过高时，可能会使蛋白酶变性失活，或影响酶与底物的结合，不利于酶解反应的进行，导致抑菌活性降低。因此，最佳酶解温度为55 ℃，优化试验酶解温度选用50～60 ℃。
图4 酶解温度对酶解产物抑菌效果的影响
Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on the antibacterial activity of hydrolysate
2.1.5 酶解时间对酶解产物抑菌效果的影响
在底物质量浓度30 mg/mL、酶与底物比3.0%、pH 4.0、酶解温度55 ℃的条件下，测定不同酶解时间对酶解产物抑菌效果的影响，结果见图5。随着酶解时间的延长，酶解产物的抑菌活性呈现先增加后降低的趋势，酶解时间为5 h时，抑菌活性达到最大。原因可能是，在5 h以前，酶解时间太短，酶解不充分，酶解产物的抑菌活性受到限制；5 h以后，具有抑菌活性的多肽可能会酶解成无抑菌活性的小分子片段或酶解成具有促进大肠杆菌生长作用的氨基酸等营养物质。因此，最佳酶解时间为5 h，优化试验酶解时间选用4～6 h。
图5 酶解时间对酶解产物抑菌效果的影响
Fig.5 Effect of hydrolysis time on the antibacterial activity of hydrolysate
通过上述单因素试验结果分析可知，酶与底物比、酶解温度和酶解时间这3 个因素对酸性蛋白酶提取花椒籽蛋白所得抗菌肽复合物的抑菌活性影响显著。单因素试验所确定的酸性蛋白酶制备花椒籽蛋白抗菌肽的合适条件为：底物质量浓度30 mg/mL、酶与底物比3.0%、酶解pH 4.0、酶解温度55 ℃、酶解时间5 h，此试验结果为设定响应面试验因素水平的零点提供参考。
2.2 响应面优化酸性蛋白酶酶解花椒籽蛋白制备抗菌肽
2.2.1 响应面法试验设计及制备的抗菌肽抑菌效果
根据Box-Behnken设计原理，结合上述单因素试验结果分析，运用Design Expert 8.0.5b软件，选取酶与底物比、酶解温度和酶解时间这3 个影响显著的因素，各取3 个水平，采用三因素三水平的响应面分析方法，对酸性蛋白酶酶解花椒籽蛋白制备抗菌肽的工艺条件进行优化设计，其响应面分析方案及试验结果和方差分析见表1和表2。
表1 响应面试验设计及结果分析
Table1 Experimental design and results for RSM
试验号X 1酶与底物比/%X 2酶解温度/℃X 3酶解时间/h Y抑菌率/% 1-1（2.0）-1（50）0（5）52.54 21（4.0）-1047.46 3 -11（60）033.90 4 1 1 0 42.20 5-10（55）-1（4）35.59 6 1 0 -147.46 7 -101（6）45.76 8 1 0 1 40.68 90（3.0）-1-154.24 1001-137.29 110-1142.37 1201144.07 1300054.24 1400054.24 1500055.93 1600052.54 1700055.93
表2 方差分析结果
Table2 Results of analysis of variance
注：**.P＜0.01，表示差异极显著；*. 0.01＜P＜0.05，表示差异显著。
变异来源平方和自由度均方F值P值显著性模型840.82993.4223.380.000 2** X 112.53112.533.130.12 X 2191.591191.5947.940.000 2** X 30.3610.360.090.77 X 1X 244.76144.7611.20.012* X 1X 371.83171.8317.970.003 8** X 2X 386.96186.9621.760.002 3** X1 2169.004 51169.004 542.290.000 3** X2 144.981144.9836.280.000 5**残差27.9773.4失拟项19.9336.643.310.14不显著纯误差8.03842.009 4合计868.7916 R 2=96.78% R 274.82174.8218.720.003 4** X3 22 Adj=92.64% R 2 Pre=61.84%
由表2可知，回归模型的P值为0.000 2，表明回归模型是显著的。失拟项的P检验值为0.14（P＞0.05），表明该模型可以充分地解释响应中的变异，模型拟合度高，相对于纯误差是不显著的。同时该模型具有较高的回归系数（R 2=96.78%），说明对于加工过程中的数据，有96.78%的抑菌率变异可由该模型解释。因此，这种试验方法是可靠的，可以用该模型对酸性蛋白酶酶解花椒籽蛋白制备抗菌肽的抑菌率进行分析和预测。
在该模型中，回归系数的显著性检验显示，一次项X
2，平方项
，交互项X
1X
3、X
2X
3的影响均达到极显著水平；交互项X
1X
2的影响达到显著水平。由方差分析中的P值可知，在试验范围内对抑菌率影响大小的顺序为：酶解温度＞酶与底物比＞酶解时间。
综合上述分析结果，得到酶与底物比（X 1）、酶解温度（X 2）、酶解时间（X 3）的二次多项回归方程：
2.2.2 响应面分析
采用Design Expert 8.0.5b软件对3 个因素间的交互作用进行全面的模型分析，模型的响应面曲线图见图6～8。
图6 酶与底物比和酶解温度交互作用对抑菌活性的影响
Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of enzyme/ substrate ratio and hydrolysis temperature on the antibacterial activity of hydrolsate
由图6可知，无论酶解温度处于何种水平，随着酶与底物比的增加，酶解产物的抑菌活性均呈现先增加后降低的趋势，原因可能为酶与底物处于低水平时，酶解不充分，生成抗菌肽的量较少，而处于较高水平时，生成的抗菌肽被酶解为更小的分子片段；无论酶与底物比处于何种水平，随着酶解温度的升高，酶解产物的抑菌活性均呈现先增加后降低的趋势，原因可能为高于或低于酶解的最适温度都会破坏酸性蛋白酶的活性，从而影响酶解反应的进行，造成抑菌活性的降低。
由图7可知，无论酶解时间出于何种水平，随着酶与底物比的增加，酶解产物的抑菌活性均呈现先升高后降低的趋势；无论酶与底物比处于何种水平，随着酶解时间的延长，酶解产物的抑菌活性都呈现先增加后降低的趋势，原因可能是酶解时间太短，具有抗菌活性的基团没有完全暴露出来，而酶解时间太长，具有抗菌活性的多肽被水解成了氨基酸等物质。
图7 酶与底物比和酶解时间交互作用对抑菌活性的影响
Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of enzyme/substrate ratio and hydrolysis time on the antibacterial activity of hydrolysate
图8 酶解温度和酶解时间交互作用对抑菌活性的影响
Fig.8 Response surface and contour plots for the effect of hydrolysis temperature and hydrolysis time on the antibacterial activity of hydrolysate
由图8可知，当酶解时间处于低水平时，随着酶解温度的升高，酶解产物对大肠杆菌的抑菌活性逐渐降低，原因可能是温度过高，破坏了酶解产物的稳定性，影响了多肽的抑菌活性；而酶解时间处于高水平时，随着酶解温度的升高，酶解产物的抑菌活性表现出平缓的先增加后降低的趋势。当酶解温度处于低水平时，随着酶解时间的延长，酶解产物的抑菌活性变化平缓，酶解反应进行5.5 h后，抑菌率出现下降趋势，原因可能是时间太长，酶解产物发生了解离，生成了无抑菌活性的物质；酶解温度处于高水平时，随着酶解时间的延长，酶解产物对大肠杆菌的抑菌率呈现先增加后降低的趋势，但在5～6 h这一段时间内，变化趋势较为平缓。
2.2.3 最佳酶解工艺条件的验证
通过Design Expert 8.0.5b软件分析可得，酸性蛋白酶酶解花椒籽蛋白制备抗菌肽的最佳工艺条件为底物质量浓度30 mg/mL、酶与底物比3.01%、酶解pH 4.0、酶解温度51.22 ℃、酶解时间4.68 h，在此优化条件下，酶解产物抑菌率的理论值为56.46%。结合实际条件，最终选择的试验条件为底物质量浓度30 mg/mL、酶与底物比3.0%、酶解pH 4.0、酶解温度51.2 ℃、酶解时间4.7 h，实际测得酶解产物对大肠杆菌的平均抑菌率为56.98%。与理论值相比，相对误差为0.91%。说明采用响应面法优化得到的工艺参数准确可靠，有实际应用的价值。在该优化条件下，酶解产物的水解度为9.05%，由于酶解产物的水解度与抗菌肽的抑菌率没有显著的线性关系 ［24-25］，所以本研究中只对在最佳工艺条件下获得的抗菌肽进行了水解度的测定。
本研究对酸性蛋白酶酶解花椒籽蛋白条件进行了优化以及酶解产物抗菌性的研究，针对酶解过程中对大肠杆菌抑菌活性影响显著的酶与底物比、酶解温度和酶解时间进行了深入研究。最后得出在底物质量浓度30 mg/mL、酶与底物比3.0%、酶解pH 4.0、酶解温度51.2 ℃、酶解时间4.7 h时，测得酶解产物对大肠杆菌的平均抑菌率为56.98%，验证结果显示，该模型可靠，具有很好的预测能力。另外，在该模型条件下，所得酶解产物的水解度为9.05%。
抑菌实验结果表明，酸性蛋白酶制备的花椒籽蛋白酶解产物对大肠杆菌的生长具有一定的抑菌效果，但抑制率较本项目中其他蛋白酶酶解产物而言较低，后续工作应将其作进一步纯化以提高抑菌活性，并进一步研究不同蛋白酶酶解产物的抑菌机理。在某些条件下制备的花椒籽蛋白酶解产物对大肠杆菌的生长有一定促进作用，可能是酶解产生的氨基酸等营养物质促进了大肠杆菌的生长，但具体原因还有待进一步探究。
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Preparation of Antibacterial Peptide Derived from Hydrolysis of Prickly Ash Seed Protein by Acid Protease
JIANG Tailing， WU Hongyang， SHEN Guanghui， DONG Xiaohua， ZHANG Zhiqing*
（College of Food Science， Sichuan Agricultural University， Ya'an 625014， China）
Abstract：This work reports the preparation of antibacterial peptide by enzymatic hydrolysis of prickly ash seed protein with acid protease. Substrate concentration， enzyme/substrate ratio， pH， hydrolysis temperature and hydrolysis time were investigated by single factor method for their effect on the anti-E. coli activity of hydrolysates. Optimization of enzyme/ substrate ratio， hydrolysis temperature and hydrolysis time based on anti-E. coli activity of hydrolysates was carried out using a Box-Behnken experimental design. The degree of hydrolysis of prickly ash seed protein was 9.05% and the inhibitory rate of the produced antibacterial peptide against E. coli was 56.98% when the hydrolysis experiment was carried out for 4.7 h at 51.2 ℃ and an initial pH of 4.0 with a substrate concentration of 30 mg/mL and an enzyme/substrate ratio of 3.0%.
Key words：prickly ash seed protein； antibacterial peptide； acid protease； inhibitory rate
中图分类号：TS201.2
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）13-0148-06
doi：10.7506/spkx1002-6630-201513028
收稿日期：2014-09-03
基金项目：四川农业大学“学科建设双支计划”项目（06070909）
作者简介：姜太玲（1989—），女，硕士研究生，研究方向为功能性食品。E-mail：ynjiangtailing@163.com
*通信作者：张志清（1976—），男，教授，博士，研究方向为粮油副产物开发利用。E-mail：zqzhang721@163.com