图1 苏氨酸锌的结构图
［1166］
Fig.1 Structure of zinc threoninate
［16］
王光然，虞俊翔，姜雯雯，冯建萍，胡晓波，谢明勇*
（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）
摘 要：为了探讨母体补充苏氨酸锌对子代生长性能、金属硫蛋白（metallothionein，MT 1）mRNA表达的影响，实验以苏氨酸锌为受试物，将90 只受孕SD大鼠随机分成5 组，并于妊娠期第6～15天进行灌胃补充不同剂量苏氨酸锌。母鼠分娩后将仔鼠进行常规饲养至1 月龄，测量仔鼠的体质量、身长和尾长，将各组仔鼠断颈处死后取肝脏、肾脏、脾脏和胸骨等组织进行RNA的提取并测定MT 1基因相对表达量。结果表明：与空白对照组相比，苏氨酸锌各剂量组仔鼠体质量有显著增加（P＜0.05）。与溶媒对照组和空白对照组相比较，苏氨酸锌各剂量组仔鼠的MT 1mRNA表达量高，且差异显著（P＜0.05），并且1 000 mg/kg苏氨酸锌处理组各组织中MT 1的基因表达量要高于其他组。本结果表明：妊娠期补充苏氨酸锌能显著提高仔鼠MT 1mRNA表达水平，并能在一定程度上增加仔鼠体质量。
关键词：苏氨酸锌；金属硫蛋白mRNA；相对表达量
锌是动物的必需微量元素之一，与体内的多种酶类有关，参与体内的多种生命活动，影响着动物的生长发育、生产性能以及免疫功能等 ［1-4］。锌同样是正常胚胎发育所必需的微量元素。妊娠期母体对锌需求量增加，锌稳态对维持胎儿的正常生长发育十分重要 ［5］。锌缺乏可能造成妊娠不良和胎儿畸形等不利影响，而高锌摄入有可能引起中毒反应 ［6］。
大部分学者认为，机体锌稳恒调控的主要方式是锌的吸收与内源锌的分泌 ［7］。维持细胞内锌稳态平衡的蛋白质主要有金属硫蛋白（metallothionein，MT）和锌转运蛋白 ［8］。进入细胞内的锌可与MT以较低的亲和力相结合，形成不稳定锌池，调节细胞内游离锌含量。研究证实锌可在转录水平调节MT的合成 ［9-10］。有文献报道 ［11-12］，氨基酸锌螯合物能够影响肉鸡小肠MT mRNA表达水平，大鼠妊娠期给予补锌水，能够上调胎盘和母体小肠组织中MT mRNA表达。
苏氨酸锌属于第三代微量元素添加剂，研究表明氨基酸锌与无机锌和有机酸锌相比较在动物饲养方面具有优良的性能，显示了广泛的应用前景 ［13-15］。本实验通过对妊娠期大鼠给予苏氨酸锌探讨妊娠期补锌对仔鼠金属硫蛋白基因表达的影响，以探讨妊娠期补充苏氨酸锌对子代锌营养水平的影响。
1.1 材料与试剂
1.1.1 受试物
苏氨酸锌，由南昌大学食品科学与技术国家重点实验室制备，是由苏氨酸和氧化锌采用水热化学合成法制备的一种氨基酸锌螯合物，其化学式为C 8H 16N 2O 6Zn·2H 2O，锌含量为19.36%，结构见图1 ［16］。
图1 苏氨酸锌的结构图
［1166］
Fig.1 Structure of zinc threoninate
［16］
1.1.2 试剂
Trizol试剂（RNA提取试剂） 美国Invitrogen公司；Revert Aid TMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（cDNA合成试剂盒） 立陶宛Fermentas公司；SYBR Permix Ex Taq TM（实时定量PCR试剂盒）、0.1%焦碳酸二乙酯处理水 日本TaKaRa公司；96孔PCR板 美国Applied Biosystems公司；无DNA/RNA酶的一次性吸液嘴和EP管美国Axygen公司；无水乙醇、氯仿、异丙醇均为分析纯试剂。
1.1.3 实验动物
SD大鼠，成年未经产8 周龄，雌鼠90 只，200～250 g，雄鼠45 只，300～350 g，购自常州卡文斯实验动物有限公司，许可证号：SCXK（苏）2011-0003，合格证号：0017269。
1.2 仪器与设备
3K15-高速冷冻离心机 德国Sigma公司；PCR仪、凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司；7900 HT Fast Real-Time PCR System 美国ABI公司；E-330多功能酶标仪美国Thermo公司；DYY-6C电泳仪 北京市六一仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 动物及处理
选用SPF级SD大鼠，常规喂养，饲料中的锌含量为139 mg/kg。
大鼠适应环境7 d后，选取健康的雌雄大鼠每天晚上8点按2∶1合笼，将每天检出的孕鼠随机分为5 组，即高、中、低剂量组，溶媒对照组（0.5%羧甲基纤维素钠（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na））和空白对照组，每组18 只。各剂量组大鼠于妊娠期第6～15天连续灌胃，分别给予1 000、500、250 mg/kg苏氨酸锌，每天灌胃一次，容积为1.5 mL/100 g，溶媒对照组和空白对照组按容积为1.5 mL/100 g给予0.5% CMC-Na和双蒸水。并在受孕的0、4、8、12、16、20 d称体质量，根据体质量重新调整灌胃的容积。
对孕鼠自然分娩后得到的健康仔鼠进行母乳喂养，断奶后改为常规饲养。
1.3.2 样品采集
将1月龄仔鼠断颈处死，取组仔鼠的肝脏、肾脏、脾脏和胸骨等组织放入1.5 mL的EP管中，于-80 ℃冰箱中保存，以备测定MT 1mRNA表达量。
1.4 测定项目
1.4.1 生长性能
各组随机选取1 月龄仔鼠24 只，测量体质量、身长和尾长。
1.4.2 MT 1mRNA的提取与测定
RNA的提取按照试剂盒说明书要求进行，用紫外分光光度计测定所提RNA在260、280 nm波长处的光密度（OD）值，通过OD 260 nm/OD 280 nm值检测RNA纯度，并用琼脂糖凝胶电泳成像分析系统检测RNA完整性。随后按照试剂盒要求进行反转录与荧光定量（real-time reverse transcription polymerase chain reaction，PCR）。实验所需引物由大连宝生物有限公司合成。采用2 -ΔΔCt法计算相对表达量。
1.5 统计分析
实时荧光定量PCR产物利用7900 HT PCR系统软件分析，可观察扩增曲线和溶解曲线，并对cDNA含量进行定量分析，计算样本的ΔΔCt值。所有数据用
表示，SPSS 13.0软件处理数据，多组间采用单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著性t检验，以α=0.05为检验标准，P＜0.05表明差异具有显著意义。
2.1 妊娠期补充苏氨酸锌对仔鼠生长性能的影响
由表1可知，1 月龄仔鼠的身长和尾长，苏氨酸锌各剂量组和CMC-Na组与空白对照组相比，差异无统计学意义。苏氨酸锌各剂量组和溶媒对照组体质量相比，差异有统计学意义（P＜0.05），空白对照组与溶媒对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），苏氨酸锌各剂量组之间差异无统计学意义。实验结果显示，母体补充苏氨酸锌对其子代可充分满足其生长对锌营养的需求，其子代在生长性能方面表现突出。
表1 妊娠期补充苏氨酸锌对仔鼠生长性能的影响（x
Table1 Effect of maternal Thr-Zn supplementation on growth performance of offspring rats
注：同列小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。
组别体质量/g身长/cm尾长/cm空白对照组69.58±3.93 b11.10±0.437.94±0.32 CMC-Na组69.58±3.57 b11.09±0.437.98±0.55 1 000 mg/（kg·d）苏氨酸锌组74.29±3.94 a11.47±0.257.98±0.28 500 mg/（kg·d）苏氨酸锌组74.64±3.09 a11.37±0.677.76±0.41 250 mg/（kg·d）苏氨酸锌组77.06±2.40 a10.97±0.457.84±0.48
2.2 荧光定量PCR结果
2.2.1 扩增曲线
图2为cDNA样品的扩增曲线。Ct值与起始模板数的对数值成反比的线性关系。图中两个重复的扩增曲线与横轴的交点几乎重合，说明样品的重复性良好。
图2 荧光定量PCR扩增曲线
Fig.2 Real time PCR amplification plot
2.2.2 熔解曲线
图3 荧光定量PCR熔解曲线
Fig.3 Real time PCR melting curve
表2 样品的Ct值（
Table2 Ct values of samples （x
组别肝脏脾脏肾脏胸骨β-肌动蛋白MT 1β-肌动蛋白MT 1β-肌动蛋白MT 1β-肌动蛋白MT 1空白对照组20.61±0.2232.64±0.2715.25±0.24 33.52±0.3414.21±0.1631.63±0.5824.75±0.15 35.25±0.72 CMC-Na组14.48±1.1332.36±0.4419.44±0.09 24.58±0.7916.21±0.1632.02±0.8728.62±0.46 31.08±1.21 1 000 mg/（kg·d）苏氨酸锌组25.33±0.1131.92±1.1314.59±0.27 31.37±0.4814.00±0.4331.21±1.1624.57±0.23 29.44±0.24 500 mg/（kg·d）苏氨酸锌组16.98±0.6230.44±0.8519.76±0.05 33.35±0.8315.92±0.1229.68±0.3725.53±0.29 33.00±1.09 250 mg/（kg·d）苏氨酸锌组16.87±0.2734.05±0.2925.11±0.13 32.72±1.5522.94±0.4632.11±0.3227.34±0.20 33.52±1.00
通过熔解曲线的分析确认PCR反应的特异性。图3为同一cDNA样品3 个重复的熔解曲线的负一次微分曲线，图中熔解曲线只有单一的主峰，说明引物特异性较好。
2.2.3 样品的Ct值
利用实时荧光定量PCR技术对基因mRNA的表达水平进行研究，其结果具有可比性和重复性。实时荧光定量PCR实验时，在整个PCR反应扩增过程中对扩增相关的荧光信号进行了实时监测和连续分析，随反应时间的延长，监测到的荧光信号的变化可以绘成一条曲线。Ct值是指PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。表2为各样品实时荧光定量PCR测定的Ct值。
2.3 高剂量的苏氨酸锌对仔鼠MT 1基因表达水平的影响
本实验采用比较Ct值的相对定量法计算基因的相对表达量 ［17］，将对照样品的表达量作为“1”，计算各个样品的ΔCt、ΔΔCt及2 -ΔΔCt值，并将2 -ΔΔCt进行统计学分析。表3是各个样品中MT 1基因的相对表达量。
表3 各个组织中MMTT
1基因的相对表达量
Table3 Relative expression levels ofMMTT
1ggeennee
组别肝脏脾脏肾脏胸骨空白对照组1.04±0.06 d1.04±0.07 d1.02±0.05 d1.00±0.08 cCMC-Na组1.53±0.25 c1.37±0.33 c1.89±0.26 c0.97±0.10 c1 000 mg/（kg·d）苏氨酸锌组8.35±0.30 a3.26±0.14 a8.43±0.13 a5.20±0.29 a500 mg/（kg·d）苏氨酸锌组7.75±0.46 a2.55±0.34 b7.49±0.40 b3.23±0.79 b250 mg/（kg·d）苏氨酸锌组5.89±0.21 b2.43±0.61 b6.36±0.39 b2.86±0.40 b
由表3可知，苏氨酸锌各剂量组相对于CMC-Na溶媒对照组和空白对照组，在肝脏、脾脏、肾脏和胸骨中金属硫蛋白MT 1的基因表达量都要高，且差异显著（P＜0.05）。1 000 mg/（kg·d）苏氨酸锌处理组，相对于其他各组，在肝脏、脾脏、肾脏和胸骨中MT 1基因表达量都要高。结果显示，MT 1基因表达量与锌的水平表现正相关性，说明苏氨酸锌被有效吸收。
黄连莹 ［18］在饲粮中添加不同锌源应用于生长育肥猪的研究中表明，蛋氨酸锌和甘氨酸锌比富马酸锌更能提高日增质量，并且氨基酸锌的添加能够改善饲粮的转化效率，同时降低生长育肥猪的腹泻率。景翠等 ［19］在断奶仔猪的日粮中添加甘氨酸锌等不同锌源实验，结果显示添加甘氨酸锌可以提高断奶仔猪的采食量、日增质量，提高仔猪免疫力。本实验中，苏氨酸锌各剂量组与溶媒对照组、空白对照组相比，仔鼠体质量明显提高，这可能是因为氨基酸锌具有调节食欲、增加采食量、降低腹泻率、抑制有害细菌生长 ［20］等功能，因而可改善动物的生长性能。
MT基因的表达受锌摄入水平的调控，当机体锌浓度过低时，MT基因表达降低，与锌的结合减少，以维持血浆中锌浓度；而锌浓度过高时，锌诱导MT基因表达增多，使过量的锌与MT结合，从而避免血浆锌浓度过高发生锌中毒 ［21］。郑立鑫等 ［22］对肉仔鸡的实验发现，相对于硫酸锌，3 种氨基酸锌能显著提高肠道MT mRNA的相对表达量。Cui Li等 ［23］利用大鼠进行实验，结果发现饲料缺锌时肝脏、肾脏以及小肠中的MT 1mRNA表达水平明显降低。刘化伟等 ［24］利用肉仔鸡建立临界缺锌模型并饲喂不同锌源的日粮，发现氨基酸锌处理组肉鸡十二指肠肠黏膜MT mRNA相对表达量明显高于无机锌处理组。MT有4 种亚型异构体，其中MT 1和 MT 2在大多数哺乳动物的内脏器官中广泛存在，参加其功能调节，且MT 1和MT 2协同表达；MT 3是该家族中的脑部特异成员，MT 4主要分布于皮肤等器官的角质细胞和复层鳞状上皮细胞中 ［25］。同类型生物的MT在化学组成、结构以及主要功能方面都具有类似性 ［26］。本实验选取MT 1作为研究对象，研究结果也进一步验证了对母体补充苏氨酸锌后，其子代的锌营养水平在一定时期内能得到满足，表现在苏氨酸锌各剂量组的子代与溶媒对照组和空白对照组的子代相比较，其肝脏、肾脏、脾脏及胸骨MT 1基因表达量显著提高。
实验结果分析可知，妊娠期大鼠补充苏氨酸锌，大鼠对苏氨酸锌的吸收效果较好，对其相应的子代在断奶饲养至1 月龄后的生长仍然有比较大的影响。同时，仔鼠肝脏、脾脏、肾脏和胸骨中的MT 1基因可以作为评价其锌营养状况的指标，其中肝脏和肾脏中的MT 1基因可以作为一个敏感指标。
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Effect of Oral Zinc Threoninate in Pregnant Rats on the Expression of Metallothionein Gene in Their Offspring
WANG Guangran， YU Junxiang， JIANG Wenwen， FENG Jianping， HU Xiaobo， XIE Mingyong*
（State Key Laboratory of Food Science and Technology， Nanchang University， Nanchang 330047， China）
Abstract：To observe the effect of zinc threoninate （Thr-Zn） orally supplemented to pregnant rats on the growth performance and metallothionein （MT） mRNA expression in their o ffspring， 90 pregnant SD rats were randomly divided into 5 groups which were administered daily with Thr-Zn at different doses by gavage during days 6 to 15 of pregnancy. After birthing， the newborn rats were routinely fed for a full month. After measuring the body weight， body length and tail length， the liver， kidney， spleen， and sternum of the offspring rats from each group were harvested for extracting RNA and determining the relative expression levels of MT 1gene. Compared with the blank control group， body weights of the offspring of rats treated with Thr-Zn increased significantly （P ＜ 0.05）. Compared with the blank control and solvent control groups， MT 1mRNA expression levels in the offspring of rats treated with Thr-Zn were significantly higher （P ＜ 0.05）. The expression level of MT 1mRNA in offspring rats with maternal Thr-Zn treatment at a dose of 1 000 mg/kg was higher than that in other groups. Therefore， maternal Thr-Zn supplementation can significantly improve the expression level of MT 1mRNA and increase the body weights of offspring rats.
Key words：zinc threoninate； metallothionein mRNA； relative expression level
中图分类号：TS201.6
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）13-0235-04
doi：10.7506/spkx1002-6630-201513043
收稿日期：2014-11-26
基金项目：江西省自然科学基金项目（20132BAB204002）；江西省重大科技创新研究项目（20124ACF00400）；江西省教育厅2011年度产学研合作项目（GJJ11002）；江西省科技支撑计划项目（20151BBF60040）
作者简介：王光然（1988—），女，硕士研究生，研究方向为营养保健与功能食品。E-mail：guangr323@163.com
*通信作者：谢明勇（1957—），男，教授，博士，研究方向为食品营养学、食品安全、功能保健食品。E-mail：myxie@ncu.edu.cn