王婉冰，徐子恒，王宏军 *，岳茹凤
（辽宁医学院畜牧兽医学院，辽宁 锦州 121001）
摘 要：对海蓬子外种皮多糖提取工艺进行研究，以干枯的海蓬子外种皮为原料，水提醇沉法获得多糖，考察提取时间、提取温度、料液比对多糖提取量的影响，通过单因素试验和响应面法对影响海蓬子外种皮多糖提取量的主要因素进行分析优化，微孔-平板法测定粗多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）。结果表明：影响海蓬子外种皮多糖提取量工艺的因素按主次顺序排列为提取温度＞料液比＞提取时间；确定海蓬子外种皮多糖水提取的最佳工艺条件为提取温度87 ℃、提取时间5 h、料液比1∶57（g/mL），在该条件下，海蓬子外种皮多糖的提取量为（13.03±0.63） mg/g，与预测值12.42 mg/g接近，粗多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的MIC值分别为50、100 mg/mL，由此表明，响应面模型与实际情况拟合良好，能较好地预测海蓬子外种皮多糖的提取量，海蓬子外种皮粗多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌抑制作用。
关键词：海蓬子；外种皮；多糖；提取工艺；响应面法；抗菌活性
海蓬子（Salicornia bigelovii Torr.）属藜科盐角草属植物，该属在全世界分布，在国内分布于华北、西北和辽宁、山东、江苏等地。海蓬子生于盐碱地、盐湖边及海边等潮湿的重盐质土壤上，该植物富含膳食纤维、各种维生素、不饱和脂肪酸、人体所必需的18 种氨基酸及微量元素钙、铁、锌、碘等海洋矿物质 ［1-2］。海蓬子是有益人体的绿色保健食品，也是生物盐、药用化工的原料。现代医学研究表明，盐角草属植物的黄酮类化合物异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷和两个绿原酸衍生物（MDQ、CDCQ）具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、降糖、降血脂等作用 ［3-7］，多糖能够起到调节免疫、抗炎和抗肿瘤作用 ［8-10］。海蓬子可用于治疗癌症、糖尿病、肥胖症和便秘等多种疾病 ［11-12］。关于海蓬子鲜嫩全草研究较多，主要涉及黄酮类、总生物碱、皂苷、食用生物盐方面的提取及活性研究 ［13-16］，亦有报道海蓬子嫩茎中多糖提取工艺及多糖成分 ［17-18］；对海蓬子种子的研究不多，主要涉及脂肪酸及亚油酸活性的研究 ［19-20］；外种皮相关研究较少，外种皮中多糖研究暂未见报道。为此，本实验以辽宁锦州沿海野生海蓬子为研究对象，对其成熟后的外种皮多糖提取及抗菌活性进行初步研究，为其进一步开发研究提供理论依据。
1.1 材料与试剂
海蓬子采自辽宁锦州白沙湾滩涂，采集时间为2013年10—11月，经辽宁医学院水生物专家王宏副教授鉴定。采集海蓬子除杂去沙，取外种皮及种籽，过40 目筛，洗净，50～60 ℃烘箱干燥，密封常温保存，备用。
无水乙醇 天津市风船化学试剂科技有限公司；葡萄糖 天津市南开大学精细化工股份有限公司；木糖、蒽酮 天津市科密欧化学试剂有限公司；半乳糖 上海市惠世生化试剂有限公司；浓硫酸 锦州古城化学试剂厂；营养琼脂 杭州微生物试剂有限公司；营养肉汤 北京奥博星生物技术有限责任公司；金黄色葡萄球菌（CVCC1882）、大肠杆菌（CVCC251） 中国兽药监察所；96孔细胞培养板 美国Costar公司。
1.2 仪器与设备
UV-757CRT分光光度计 上海三精科有限公司；FA2004N型电子天平 上海精密科学仪器有限公司；RE-52型旋转蒸发仪 上海博通经贸有限公司；SHZ-ⅢB型循环水真空泵 上海华琦科学有限公司；电热恒温水浴锅 常州国华仪器有限公司；TDL-5000B型离心机 上海安亭科学仪器厂；DZF6050真空干燥箱、隔水式恒温培养箱 上海一恒科技有限公司；KQ-300B型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 混标糖标准曲线的制作
精密称取105 ℃干燥至恒质量的半乳糖、葡萄糖、木糖各10 mg，混匀后用蒸馏水溶解并定容至100 mL备用。量取混标糖溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL置于具塞试管中，加水至1.0 mL，蒽酮-硫酸比色法测定吸光度（A） ［21］，拟合线性回归方程。
1.3.2 海蓬子外种皮多糖提取的单因素试验
采用水提醇沉法提取粗多糖 ［17，22］。称取等量（10 g）海蓬子外种皮若干份，对其进行提取温度、提取时间、料液比的单因素试验。先固定其中2 个因素水平，考察另外1个因素不同水平对多糖提取量的影响。固定料液比为1∶48，置于90 ℃水浴中，分别浸提2、3、4、5、6 h，考察提取时间对多糖提取量的影响；固定料液比1∶48、提取时间4 h，置于60、70、80、90、100 ℃水浴中，考察提取温度对多糖提取量的影响；固定提取温度90 ℃、提取时间4 h，分别加水150、300、450、600、750 mL，考察料液比对多糖提取量的影响。
1.3.3 多糖提取量的测定
精确称取提取物，用蒽酮-硫酸比色法测定吸光度代入标准曲线方程中，得其多糖含量，多糖提取量按下式计算。
1.3.4 响应面法优化多糖提取条件
在单因素试验基础上用Box-Behnken试验设计方案 ［23］，因素水平见表1，以多糖提取量（Y）为响应值，用Disign-Expert 7.0软件对试验结果进行回归分析建立数学模型，以确定海蓬子外种皮多糖的最佳提取条件。
表1 Box-Behnken试验设计因素水平表
Table1 Factors and coded levels used in Box-Behnken design
因素水平－101 A提取温度/℃859095 B提取时间/h456 C料液比（g/mL）1∶501∶601∶70
1.3.5 最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）的测定
精密称取粗多糖4.0 g，用蒸馏水溶解，于10 mL容量瓶中定容，滤过除菌。活菌计数法测定细菌浓度，用营养肉汤将细菌浓度调至10 4CFU/mL ［24］。取96 孔细胞培养板，每孔加入100 μL营养肉汤，第1孔加入100 μL粗多糖溶液，混匀后进行二倍比稀释至第8孔，然后每孔加入50 μL菌悬液，第9孔做细菌对照，第10孔做粗多糖溶液对照，37 ℃培养18 h，接种环取各孔液体涂于平板上，37 ℃再培养12 h，以平板上无细菌生长或生长菌落数小于3个对应的多糖稀释度定为MIC，该法称为微孔-平板法，每组实验重复3 次。
1.4 数据分析
响应面模型的回归方程式和显著性统计通过Disign-Expert 7.0软件进行计算和分析处理，系数的显著性通过方差分析进行检验，P＜0.05表示显著性差异，P＜0.01表示极显著性差异。
2.1 混标糖标准曲线
对不同质量浓度混标糖标准溶液与对应的吸光度，拟合线性方程为A=0.086C+0.006 6，R²=0.999 7。
2.2 单因素试验结果
2.2.1 提取温度对多糖提取量的影响
图1 提取温度对多糖提取量的影响
Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of crude polysaccharides from Salicornia bigelovii testa
由图1可知，多糖提取量随提取温度的升高而大幅升高，当提取温度达到90 ℃时，提取量为最大值10.53 mg/g，当提取温度达到100 ℃时，提取量略有下降趋势，这与高温会使多糖分解，导致分离过程中损耗有关，所以适宜提取温度最优水平为90 ℃。
2.2.2 提取时间对多糖提取量的影响
图2 提取时间对多糖提取量的影响
Fig.2 Effect of extraction time on the yield of crude polysaccharides from Salicornia bigelovii testa
由图2可知，随着提取时间的延长多糖提取量大幅上升，提取时间达到5 h时，提取量达到最大值11.14 mg/g，提取时间超过5 h，提取量明显下降，故提取时间最优水平为5 h。
2.2.3 料液比对多糖提取量的影响
由图3可知，随着溶剂用量的增加多糖提取量逐渐增多，在1∶60时达到最大值11.16 mg/g，当溶剂用量继续加大后提取量显示下降的趋势，所以料液比最优水平为1∶60。
图3 料液比对多糖提取量的影响
Fig.3 Effect of solid to liquid radio on the yield of crude polysaccharides from Salicornia bigelovii testa
2.3 响应面法优化确定最佳提取条件
2.3.1 模型建立及显著性检验
通过对提取时间、料液比、提取温度进行优化试验获得海蓬子外种皮多糖提取量试验值（表2），试验数据经Disign-Expert 7.0软件进行多元线性回归分析得到相应的二次方程模型：Y=14.68+2.42A－0.071B－0.74C－0.39AB－0.9AC+0.055BC－3.39A 2－1.69B 2－1.47C 2。
表2 Box-Behnken试验设计及结果
Table2 Box-Behnken experimental design with experimental and predicted values of crude polysaccharide yield
试验号A提取温度B提取时间C料液比提取量/（mg/g）试验值预测值1－1106.917.50 2 0 1 111.0010.77 3 0 0 014.414.68 4 1－112.6412.13 5 0 0 014.9314.68 0 6 014.7214.68 7－1017.937.56 8 1 0－113.5113.88 9 1 1 011.4311.56 0 0 100－1－112.1612.39 1110110.5110.60 120－1110.3010.79 131－1013.0912.48 14－1－107.006.86 15－10－17.357.24
表3 回归方程模型方差分析表
Table3 Analysis of variance for the developed regression equation
注：**.差异极显著（P＜0.01）。
来源平方和自由度均方F值P值显著性残差1.850.36回归模型109.59912.1833.850.000 6**失拟1.6630.557.750.116 4纯误差0.1420.071总误差111.3814
响应面分析中对试验结果进行拟和的二次模型方差分析见表3，回归F值为33.85，多元相关系数为R 2=98.39%，预测R 2=75.92%，调整R 2=95.48%，且失拟不显著，回归是显著的，说明模型对试验实际情况拟合较好；P=0.000 6，表明该模型高度显著，可用来进行响应值的预测，试验设计方案正确。
二次模型中回归系数的显著性检验（表4）表明：因素A对提取效果的线性效应极显著（P＜0.01），因素C对提取效果的线性效应显著（P＜0.05），因素B对提取效果的线性效应不显著（P＞0.05）；因素A 2、B 2、C 2对提取效果的曲面效应极显著（P＜0.01）；因素AC对提取效果的交互影响显著（P＜0.05），因素AB、BC对提取效果的交互影响不显著（P＞0.05）。说明3 个因素均不同程度的对响应值产生显著或极显著的影响，本试验设计的因素选择是成功的。
表4 回归方程系数显著性分析
Table4 Significance test for each regression coefficient of the developed regression equatiioonn
注：*.差异显著（P＜0.05）；**.差异极显著（P＜0.01）。
模型项回归系数标准误差F值P值 显著性常数项14.680.35 A提取温度2.420.21130.12＜0.000 1** B提取时间－0.0710.210.110.750 5 C料液比－0.740.2112.180.017 5* AB－0.390.31.710.247 5 AC－0.90.38.910.030 6* BC0.0550.30.030.861 7 A 2－3.390.31117.820.000 1** B 2－1.690.3129.250.002 9** C 2－1.470.3122.190.005 3**
2.3.2 多糖提取量响应面分析与优化
运用Disign-Expert 7.0软件所做的响应面图（图4）可对任何两因素交互影响海蓬子外种皮多糖的提取量进行分析与评价，以确定最佳因素水平范围。
图4 各两因素交互影响海蓬子外种皮多糖提取量的响应面图
Fig.4 Response surface plot showing the effects of extraction time，extraction temperature and solid to liquid ratio on the yield of crude polysaccharides from Salicornia bigelovii testa
图4a显示了料液比在1∶50（g/mL）条件下，提取温度和提取时间对海蓬子外种皮多糖提取量的交互影响。在提取时间不变的条件下，随着提取温度的逐渐升高，提取量呈现迅速上升、达到峰值平缓下降的趋势。当提取温度在低水平条件下，提取量变化较明显；在高水平条件下，提取量逐渐降低。在提取温度不变的条件下，随着提取时间的逐渐延长，提取量变化不明显。所以当提取时间处于高水平时，可以获得很高的提取量，而提取时间处于中间水平时，可以获得较高的提取量。
图4b显示了提取时间为5 h时，提取温度和料液比对多糖提取量的交互影响。在料液比不变的条件下，随着提取温度的逐渐升高，提取量出现明显上升的趋势，超过90 ℃时提取量呈现平缓下降趋势。在提取温度不变的条件下，随着料液比水平的逐渐增加，提取量呈现平缓升高趋势。温度的升高可以加速热运动，使水溶性多糖得到更充分地释放。所以海蓬子外种皮多糖提取关键因素是提取温度，其处于较高水平、料液比适宜即可获得较高的提取量。
图4c显示了提取温度在90 ℃条件下，提取时间和料液比对多糖提取量的交互影响。在提取时间不变的条件下，随着料液比水平的逐渐增加，提取量呈现急速上升之后又迅速下降的趋势；在料液比不变的条件下，随着提取时间的逐渐延长，提取量也呈现急速上升之后又迅速下降的趋势，并且变化较大。由此表明，提取时间和料液比交互作用对多糖提取量影响显著。
经Disign-Expert 7.0软件分析A、B、C的代码值为－0.51、－0.21、－0.34，对应的实际值为87.45 ℃、4.79 h、1∶56.6，考虑到实际操作，最后确定最优提取工艺为提取温度87 ℃、提取时间5 h、料液比1∶57（g/mL），理论计算提取量达到12.42 mg/g。在此条件下进行验证实验，海蓬子外种皮多糖提取量为（13.03±0.63）mg/g，与模型预测值的比较误差为4.91%，说明运用响应面法优化得到的模型参数准确可靠。
2.4 多糖抗菌活性
海蓬子外种皮粗多糖对金黄色葡萄球菌的MIC值为50 mg/mL，对大肠杆菌的MIC值为100 mg/mL。由此表明，海蓬子外种皮粗多糖具有抗菌活性，且抗金黄色葡萄球菌的活性优于大肠杆菌。
本研究采用水提醇沉法从海蓬子外种皮中提取多糖，为进一步优化提取多糖工艺参数，本实验考察了提取时间、提取温度、料液比3 个因素对多糖提取量的影响。通过单因素试验和响应面试验设计，影响海蓬子外种皮多糖提取量的主次顺序排列为提取温度＞料液比＞提取时间，海蓬子外种皮多糖水提取工艺条件为提取温度87 ℃、提取时间5 h、料液比1∶57（g/mL），在该条件下海蓬子外种皮多糖的提取量为（13.03±0.63）mg/g。海蓬子外种皮粗多糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有抗菌活性。
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Optimization of Extraction and Antimicrobial Activity of Water-Soluble Polysaccharides from Salicornia bigelovii Torr. Testa
WANG Wanbing， XU Ziheng， WANG Hongjun*， YUE Rufeng
（College of Animal Husbandry and Veterinary， Liaoning Medical University， Jinzhou 121001， China）
Abstract：A water extraction-alcohol precipitation method to extract water-soluble polysaccharides from the dry testa of Salicornia bigelovii Torr. was developed in this study. The extraction process was optimized by investigating polysaccharide yield as a function of extraction time， extraction temperature and solid to solvent ratio using combination of one-factor-ata-time experiments and response surface methodology. Minimal inhibitory concentrations （MICs） of crude polysaccharides from S. bigelovii Torr. testa against Staphylococcus aureus and Escherichia coli were detected by microwell plate method. The results showed that polysaccharide yield was affected in decreasing order by the three factors： extraction temperature， solid to liquid ratio and extraction time. An extraction temperature of 87 ℃， a solid to liquid ratio of 1：57 （g/mL） and 5 h extraction proved optimal. Experiments carried out under the optimized conditions led to an extraction yield of （13.03 ± 0.63） mg/g， agreeing with the predicted value （12.42 mg/g）， indicating that the response surface model has good prediction ability for the extraction of polysaccharides from the testa of Salicornia bigelovii Torr.. Minimal inhibitory concentrations （MICs） of the crude polysaccharides against S. aureus and E. coli were 50 and 100 mg/mL， respectively， suggesting potent antibacterial activity.
Key words：Salicornia bigelovii Torr.； testa； polysaccharide； extraction； response surface analysis； antimicrobial activity
中图分类号：Q946.3；TS201.2
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）14-0005-05
doi：10.7506/spkx1002-6630-201514002
收稿日期：2014-11-26
基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（31201951）；辽宁省大学生创新创业训练计划项目（201310160035）；辽宁省高等学校优秀人才支持计划项目（LJQ2013087）；辽宁医学院奥鸿大学生科技活动基金项目（2013D035）
作者简介：王婉冰（1993—），女，本科生，研究方向为动物医学。E-mail：393873735@qq.com
*通信作者：王宏军（1977—），男，副教授，博士，研究方向为天然药物化学及药理活性。E-mail：lnwhj2012@163.com