高郡焕 1，李学鹏 1，*，刘 裕 1，仪淑敏 1，励建荣 1，*，李钰金 2，林 洪 3
（1.渤海大学食品科学研究院，辽宁省食品安全重点实验室，辽宁 锦州 121013；2.泰祥集团 山东海洋食品营养研究院，山东 荣成 264303；3.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003）
摘 要：以四角蛤蜊肉为原料，利用酶解技术获得四角蛤蜊调味料风味前体物质。以水解度和感官评价为指标，确定酶的种类与比例。在单因素试验的基础上，使用中性蛋白酶和复合风味蛋白酶，通过Box-Behnken响应面分析法，研究双酶酶解四角蛤蜊的工艺条件。研究结果：当中性蛋白酶和复合风味蛋白酶质量比为2∶1时，其酶解液的水解度和鲜度都最佳；双酶酶解最佳条件为酶添加量2.4‰、时间5.5 h、温度52 ℃、料液比1∶4（g/g）、自然pH值，此时酶解液的水解度较大（44.32%），风味较好。
关键词：四角蛤蜊；酶解；水解度；海鲜调味料
据中国调味品协会的统计，调味品行业整体年增长20%以上，是食品行业中增幅最快的行业之一，其中尤以复合调味品的发展速度为最快，达到30%～40% ［1］。随着生活水平的提高，营养型、天然风味型、功能型的调味品越来越受到消费者的青睐。海鲜调味料因含有氨基酸、多肽等呈味物质和功能性生物活性物质，逐渐成为调味品工业的一个重要门类，研究热度也日趋提高 ［2］。姚芳等 ［3］酶解淡水鱼下脚料酿制了风味调味汁，李琳等 ［4］将低值鱼进行酶解制得海鲜复合调味料，韩晓祥等 ［5］酶解中国对虾下脚料制得调味料风味前体物质，陈超等 ［6］利用贝类加工废弃物研制复合海鲜调味料，赵阳等 ［7］利用双酶同步酶解工艺和自溶工艺制备紫贻贝海鲜风味肽。
四角蛤蜊（Mactra veneriformis）属于软体动物门（Mollusca），瓣鳃纲（Lamellibranchia），蛤蜊科（Mactridae） ［8］，在我国沿海一带分布极广，尤以辽宁、山东产量最多 ［9］。它含有丰富的蛋白质和多糖等营养成分，中医认为四角蛤蜊肉有滋阴、利水、化痰的功效 ［10］。目前，国内外已有许多学者从四角蛤蜊不同季节营养变化 ［11］、多糖 ［12］和抗氧化性肽 ［13］等生物活性物质的提取和特性等方面进行研究。但四角蛤蜊等低值贝类的加工利用率仍然很低，多数加工仍以初级加工为主，产品形式单一，造成了严重的资源浪费 ［14］。腾瑜等 ［15］研究了四角蛤蜊的营养性，指出四角蛤蜊中鲜味氨基酸的含量高达55.4%，可开发为调味料，但利用生物酶解技术制备四角蛤蜊海鲜调味料的研究仍鲜见报道。本研究以四角蛤蜊为原料，采用单因素试验和响应面设计研究其酶解工艺，制备四角蛤蜊调味料风味前体物质，为天然海鲜调味料的开发提供理论依据和方法指导，同时为四角蛤蜊的深加工提供参考途径。
1.1 材料与试剂
鲜活四角蛤蜊于3月上旬购买于锦州市林西街水产市场，平均质量约20 g/个。
中性蛋白酶（0.8 AU/g）、复合蛋白酶（1.5 AU/g）、复合风味蛋白酶（500 LAPU/g）、碱性内切蛋白酶（2.4 AU/g） 诺维信（中国）生物技术有限公司；木瓜蛋白酶（1×10 5U/g） 上海如吉生物科技有限公司；盐酸、硫酸（分析纯） 锦州古城化学试剂厂；氢氧化钠（分析纯） 天津市风船化学试剂科技有限公司；甲醛（分析纯） 天津市天力化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
JY-10型小型粉碎机 济南九阳有限公司；FA1004型精密电子天平 上海恒平科学仪器有限公司；DK-8D型电热恒温水槽 上海一恒科技有限公司；FE20-FiveEasy™ pH计、PL602-L型分析天平 瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；Biofuge ☒Stratos台式高速冷冻离心机赛默飞世尔科技公司。
1.3 方法
1.3.1 工艺流程
四角蛤蜊肉→前处理（加水、绞碎）→调节pH值→保温酶解→灭酶（沸水浴10 min）→冷却→离心（4 000 r/min，10 min，4 ℃）→四角蛤蜊肉酶解液
1.3.2 水解度测定
水解度是指底物蛋白质中被水解肽键数占肽键总数的百分数 ［16］，计算如式（1）所示：
总氮含量采用GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》凯氏定氮法测定；游离氨基酸态氮含量参考侯曼玲 ［17］的方法进行测定，具体步骤如下：
取10 mL定容好的四角蛤蜊肉酶解液于200 mL的烧杯中，并加入60 mL蒸馏水。在磁力搅拌状态下，用0.05 mol/L的NaOH标准溶液滴定至pH 8.2，加入10 mL的甲醛混匀后，继续用上述NaOH标准溶液滴定至pH 9.2，记录消耗NaOH标准液的量，按式（2）计算氨基酸态氮含量。
式中：X为样品中氨基酸态氮的质量分数/%；V 1为样品加入甲醛滴定至终点（pH 9.2）所消耗NaOH标准溶液的体积/mL；V 0为空白加入甲醛滴定至终点所消耗的NaOH标准溶液的体积/mL；V为试样稀释液取用量/mL；c为NaOH标准溶液的浓度/（mol/L）；0.014为N的毫摩尔质量/（g/mmol）；10为四角蛤蜊肉底物质量/g。
1.3.3 四角蛤蜊肉水解工艺优化
1.3.3.1 酶种类对四角蛤蜊肉水解度的影响
选取碱性蛋白酶、复合风味蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶这5 种酶进行水解，水解条件为料液比1∶2，即10 g肉加20 g的蒸馏水匀浆，酶添加量3‰（占底物质量分数），碱性蛋白酶58 ℃、pH 7.2，复合风味蛋白酶50 ℃、pH 6.0，复合蛋白酶40 ℃、pH 6.2，木瓜蛋白酶55 ℃、pH 6.5，中性蛋白酶45 ℃、pH 6.2，酶解1、3、5、8、12 h，比较5 种酶的水解度大小与酶解液的风味。每个水平分别重复3 次，结果表示为
±s的形式。
1.3.3.2 复合酶质量比对四角蛤蜊肉水解度的影响
酶解条件为料液比1∶2、温度45 ℃、时间3 h、自然pH值（即将四角蛤蜊肉与水按一定比例匀浆后不用酸碱调节pH值）、酶添加量3‰，改变中性蛋白酶和复合风味蛋白酶的质量比（2∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶2），以水解度和鲜味为指标，确定最佳复配条件。
1.3.3.3 酶解时间对四角蛤蜊肉水解度的影响
取7 份四角蛤蜊肉（每份10 g），加20 g蒸馏水匀浆，分别加入2‰中性蛋白酶和1‰复合风味蛋白酶，自然pH值，45 ℃分别酶解2、3、4、5、6、7、8 h，沸水浴灭酶10 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液定容到100 mL，测定其水解度。
1.3.3.4 酶解温度对四角蛤蜊肉水解度的影响
取5 份四角蛤蜊肉（每份10 g），加20 g蒸馏水匀浆，分别加入2‰中性蛋白酶和1‰复合风味蛋白酶，不调pH值，分别在30、40、50、60、70 ℃酶解6 h，沸水浴灭酶10 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液定容到100 mL，测定其水解度。
1.3.3.5 初始pH值对四角蛤蜊肉水解度的影响
取5 份四角蛤蜊肉（每份10 g），加20 g蒸馏水匀浆，分别加入2‰中性蛋白酶和1‰复合风味蛋白酶，调pH值分别为4、5、6、7、8，50 ℃酶解6 h，沸水浴灭酶10 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液定容到100 mL，测定其水解度。
1.3.3.6 酶添加量对四角蛤蜊肉水解度的影响
取6 份四角蛤蜊肉（每份10 g），加20 g蒸馏水匀浆，分别加入0.3‰、0.9‰、1.5‰、2.1‰、2.7‰、3‰的混合蛋白酶（中性蛋白酶与复合风味蛋白酶质量比2∶1），调pH 7，50 ℃酶解6 h，沸水浴灭酶10 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液定容到100 mL，测定其水解度。
1.3.3.7 料液比对四角蛤蜊肉水解度的影响
取5 份四角蛤蜊肉（每份10 g），按料液比1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6加入蒸馏水后匀浆，加入1.4‰中性蛋白酶和0.7‰复合风味蛋白酶，调pH 7，50 ℃酶解6 h，沸水浴灭酶10 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液定容到100 mL，测定其水解度。
1.3.3.8 响应面试验优化
在单因素试验的基础上，选择温度、时间、酶添加量和初始pH值这4 个因素，以水解度为响应值，根据Design-Expert V8.0.6软件中Box-Behnken法设计响应面试验方案，其相应的因素水平见表1。
表1 响应面试验设计因素与水平
Tabel Factors and coded levels for response surface design
因素水平－101 A温度/℃455055 B时间/h5.566.5 C初始pH6.577.5 D酶添加量/‰1.82.12.4
1.3.4 感官分析
感官评定小组由8 名食品专业的感官评价人员组成（年龄在20～40 岁之间）。待评定样品NaCl含量为0.5%，温度为（25±1）℃。
5 种酶解液的风味差距较大，采用评分法 ［18］（7分制）对其甜味、苦味、酸味、鲜味、醇厚感和持续感进行评价，以2 g/100 mL麦芽糊精代替样品溶液作为对照组 ［19］。评定标准为：1分（非常弱）、2分（很弱）、3分（对照组）、4分（一般）、5分（稍强）、6分（比较强）、7分（很强）。中性蛋白酶与复合风味蛋白酶添加比例的确定采用排序检验法 ［18］，鲜味越强，秩和数越小。感官评定结果取8 人评定结果的平均值。
2.1 蛋白酶的选择
不同的酶作用位点不同，水解蛋白的产物有所差异，进而呈现出不同的风味特点 ［19］。选取了碱性蛋白酶、复合风味蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶这5 种酶进行水解。
图1 5种蛋白酶水解四角蛤蜊肉过程中水解度的变化
Fig.1 Effect of hydrolysis time on the degree of hydrolysis of M. quadrangularis by five different enzymes
图2 5种酶解液感官得分
Fig.2 Sensory evaluation scores of M. quadrangularis hydrolysates by five different enzymes
由图1可知，这5 种酶的水解度都随时间的延长而增大。8 h后，这几种酶水解度增长的幅度变小。水解前5 h，碱性蛋白酶的水解效果最好，其次为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶、复合风味蛋白酶。水解5～12 h，中性蛋白酶的水解效果最好。由图2可知，复合风味蛋白酶酶解液的鲜味、甜味、持续感和醇厚感的评分都最高，酸味和苦味都最低；复合蛋白酶酶解液的鲜味和醇厚味也较高，甜味和持续感较复合风味蛋白酶低，苦味略高于复合风味蛋白酶酶解液；中性蛋白酶酶解液鲜味比木瓜蛋白酶酶解液的鲜味略低，但比木瓜碱性蛋白酶酶解液的苦味轻，醇厚感强；碱性蛋白酶酶解液的苦味最重，醇厚感与持续感也没有其他4 种酶解液强烈。
结合各个酶的水解度，将中性蛋白酶与复合风味蛋白酶进行复配与复合蛋白酶进一步进行比较，在酶解料液比1∶2、温度45 ℃、时间3 h、自然pH值、酶添加量3‰的基本酶解条件下，所得两种酶复配的酶解液风味略优于复合蛋白酶解液，所以最终选定中性蛋白酶和复合风味蛋白酶复配水解四角蛤蜊肉。
2.2 中性蛋白酶与复合风味蛋白酶质量比对水解度的影响
在2.1节基本酶解条件下，中性蛋白酶和复合风味蛋白酶复配质量比对水解度的影响如图3所示。
图3 中性蛋白酶与复合风味蛋白酶质量比对水解度的影响
Fig.3 Effect of ratio of neutral protease to flavourzyme on the degree of hydrolysis of M. quadrangularis
表2 不同复配质量比酶解液的鲜度感官评分
Table2 Sensory score of M. quadrangularriiss hydrolysates by different ratios of neutral protease to flavourzyme
注：Friedman检验得F=111.46＞13.28，说明样品之间有显著性差异。
样品号1∶12∶13∶21∶22∶3秩和1 5142315 2 4253115 3 3154215 4 3124515 5 4123515 6 2153415每种样品的秩和R21723192090
由图3可知，中性蛋白酶与复合风味蛋白酶质量比为2∶1时，水解度最大。由表2可知，当这两种酶的比例为2∶1时，秩和数最小，即鲜味最强。综合水解度和鲜度感官评分结果，最终确定中性蛋白酶与复合风味蛋白酶质量比为2∶1。
2.3 时间对水解度的影响
图4 时间对水解度的影响
Fig.4 Effect of hydrolysis time on the degree of hydrolysis of M. quadrangularis
酶对底物的作用需要一定的时间，在一定时间范围随着酶解时间的延长水解度增加。由图4可知，在1～6 h内，随着时间的延长，水解度快速增加，随后水解度增加的比较缓慢。一方面可能是随着时间的延长，体系的pH值发生改变，酶活力逐渐下降 ［20］，另一方面可能是游离的小肽和氨基酸增多，产物的抑制作用逐渐增强所致 ［9］。这与文献中报道的中性蛋白酶 ［21］和复合风味蛋白酶 ［22］各自的水解趋势相一致。综合考虑，选择6 h为水解时间。
2.4 温度对水解度的影响
图5 温度对水解度的影响
Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on the degree of hydrolysis of M. quadrangularis
温度高低不仅影响蛋白酶的稳定性，还影响蛋白酶催化反应速率 ［23］。由图5可知，随着温度的升高，水解度逐渐增大，当水解温度为50 ℃时，水解度最大。当温度超过50 ℃，水解度逐渐下降，这可能是因为蛋白酶分子的肽键具有特定的空间结构，温度超过一定限度后引起次级键解离从而致使蛋白酶丧失或部分丧失催化活性 ［9，23］。当温度过低时则可能会大大降低体系内分子运动的激烈程度从而降低蛋白酶分子与底物的碰撞几率 ［24］。因此，选择复配的两种酶的最适温度为50 ℃。
2.5 初始pH值对水解度的影响
图6 初始pH值对水解度的影响
Fig.6 Effect of initial pH value on the degree of hydrolysis of M. quadrangularis
pH值可以影响蛋白分子的折叠情况，从而影响酶活力的大小。由图6可知，在初始pH 4～8范围内，水解度随着pH值的升高呈现先上升后下降的趋势。当pH 7时，水解度达到最大，当初始pH值呈弱碱性时，水解度逐渐降低。由此可知，pH值在趋于中性范围内，水解度较大，因此选择初始pH值为7。
2.6 酶添加量对水解度的影响
由图7可知，在选定的酶添加量范围内，随着酶添加量的增加，水解度也增大。酶添加量在0.3‰～2.1‰范围内，水解度增加幅度比较大，酶添加量超过2.1‰，水解度增加幅度较小，从经济效益方面考虑，选择2.1‰为酶添加量。
图7 酶添加量对水解度的影响
Fig.7 Effect of enzyme dosage on the degree of hydrolysis of M. quadrangularis
2.7 料液比对水解度的影响
图8 料液比对水解度的影响
Fig.8 Effect of material-to-liquid ratio on the degree of hydrolysis of M. quadrangularis
由图8可知，在选定的料液比范围内，随着料液比的减小，水解度呈现先增大后下降的趋势。当料液比1∶4时，水解度达到最大。料液比主要影响底物的质量浓度，当底物质量浓度较大时，溶质的流动性变差，酶与底物不能充分结合，限制了反应的进行，当底物质量浓度逐渐减小时，溶质流动性变大，水解度也逐渐变大 ［23］。当底物浓度减小到一定程度时，酶与底物接触的几率变小，水解度降低 ［25］。同时考虑到液料比较小时，增加了水的成本和后续加工的负担 ［26］，因此选择1∶4为最适料液比。
2.8 Box-Behnken响应面试验结果
响应面试验结果见表3。由表4可知，模型P＜0.000 1，模型达到极显著。失拟项P=0.081 1＞0.05不显著，因此二次模型成立，应用此模型可以预测水解度及优化酶解工艺。影响水解度的主次因素为酶添加量＞时间＞温度＞初始pH值，酶添加量对水解度的影响达到极显著水平，温度和时间对水解度的影响达到显著水平。4 个因素中，温度和时间、酶添加量和初始pH值交互作用极显著，交互作用响应面图及等高线图见图9。模型的回归系数R 2大于0.8时，模型才具有很好的拟合性，用以解释数据变化和各参数间的关系 ［27］。由表5可知，预测二次模型的决定系数为0.911 7，表明模型与实际情况之间具有很好的拟合性。
表3 响应面试验设计与结果
Table3 Program and experimental results of RSM
试验号A温度B时间C初始pHD酶添加量水解度/% 1 0 0 0 043.09 2 1－1039.66 3 1－10039.23 4－100139.66 5 0 0 1 142.74 0 6－101039.66 7 0－10140.52 8 1 0 1 038.80 9－110045.23 100－1－1037.52 11－100－131.27 12－1－10036.24 13－10－1036.41 14010145.65 15010－140.52 16000044.09 1700－1－137.52 180－11038.80 19100138.98 20000041.09 21110034.10 22000042.59 23000043.84 24010040.94 2500－1131.96 2610－1032.98 27100－125.11 280－10－131.53 29001－125.54
表4 响应面二次模型方差分析
Table4 Analysis of variance of response surface quadratic model
注：**.差异极显著（P＜0.01）；*.差异显著（P＜0.05）。
来源平方和自由度均方F值P值显著性模型716.13151.1510.32＜0.000 1** A温度30.92130.926.240.025 6* B时间41.30141.308.340.011 9* C初始pH9.0719.071.830.197 5 D酶添加量192.171192.1738.79＜0.000 1** AB49.83149.8310.060.006 8** AC1.6511.650.330.573 2 AD7.5117.511.520.238 5 BC1.272×10 711.272×10 72.568×10 80.999 9 BD3.7213.720.750.400 9 CD129.501129.5026.140.000 2** A 297.11197.1119.600.000 6** B 20.1810.180.0360.852 9 C 268.97168.9713.920.002 2** D 2143.361143.3628.94＜0.000 1**残差69.36144.95失拟项63.66106.374.470.081 1纯误差5.7041.43总变异785.4928
表5 二次模型的方差分析结果
Table5 Analysis of variance of quadratic model
指标标准差均数离散系数R 2R 2 AdjPRESS结果2.2338.115.840.911 70.823 4375.60
图9 温度和时间、初始pH值和酶添加量交互作用对四角蛤蜊水解度影响的响应面和等高图
Fig.9 Response surface and contour plot for the effect of hydrolysis temperature and times， and enzyme dosage and initial pH value on the degree of hydrolysis of M. quadrangularis
响应面的图形是响应值对各因子所构成的一个三维空间曲面图，从响应面分析图中可以找出最佳参数以及各参数之间的相互作用 ［5］。由图9a可知，在一定范围内，随着时间的延长，水解度逐渐增大。随着温度的升高，水解度呈现先升高后下降的趋势，这说明酶解的温度不可以太高，否则影响酶的活力。这与单因素试验结果相符。由图9b可知，在一定范围内，随着酶添加量的增大，水解度逐渐增大。随着初始pH值的升高，水解度呈现先升高后下降的趋势。这与单因素试验结果相符。
2.9 响应面优化四角蛤蜊肉酶解的最佳工艺条件
利用响应面优化得到四角蛤蜊肉的最佳工艺条件为温度52.10 ℃、时间5.55 h、pH 7.5、酶添加量2.4‰，水解度为45.68%。为便于生产化操作，将酶解条件设为温度52 ℃、时间5.5 h、自然pH值、酶添加量2.4‰，最终由Design-Expert 8.0软件优化分析得水解度为44.58%，与上述酶解条件下得到的水解度差距不大。在此条件下，重复实验3 次，所得酶解液的水解度为44.32%，与软件优化结果差距不显著。因此选用温度52 ℃、时间5.5 h、自然pH值、酶添加量2.4‰为最终的酶解条件。
以水解度和感官评价为指标，从碱性蛋白酶、复合风味蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶这5 种酶选出中性蛋白酶和复合风味蛋白酶进行复配。在单因素试验基础上，以水解度为指标，选取酶解温度、时间、初始pH和酶添加量4 个因素，根据Box-Behnken设计原理，建立了四因素三水平的响应面模型。利用响应面优化并结合生产化操作，当温度52 ℃、时间5.5 h、自然pH值、酶添加量2.4‰时，酶解液水解度理论预测值较高，为44.58%，实际值为44.32%，与预测值相吻合。综上所述，双酶复合酶解最佳工艺条件为中性蛋白酶和复合风味蛋白酶质量比2∶1、酶添加量2.4‰、时间5.5 h、温度52 ℃、料液比1∶4、自然pH值，此时酶解液的水解度较大，风味较好。
采用生物酶解技术将四角蛤蜊肉中的蛋白质分解为氨基酸和肽，制备海鲜调味料风味前体物质，生产工艺简单，便于大规模工厂化生产，且反应条件温和，不存在安全隐患。以此酶解液为基础，可进一步通过调配或再与还原糖类物质发生热反应来制备海鲜调味料，使产品兼具浓郁海鲜风味和营养功能，应用前景广阔，可为四角蛤蜊的深加工提供方法借鉴。
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Optimization of Enzymatic Hydrolysiss of Mactra quadrangularis to Prepare Seasoning Flavor Precursors by Response Surface Methodology
GAO Junhuan
1， LI Xuepeng
1，*， LIU Yu
1， YI Shumin
1， LI Jianrong
1，*， LI Yujin
2， LIN Hong
3
（1. Food Safety Key Laboratory of Liaoning Province， Research Institute of Food Science， Bohai University， Jinzhou 121013， China；2. Taixiang Group， Shandong Institute of Marine Food Nutrition， Rongcheng 264303， China；3. College of Food Science and Engineering， Ocean University of China， Qingdao 266003， China）
Abstract：In this study， the enzymatic hydrolysis of fresh Mactra quadrangularis meat to prepare seasoning flavor precursors was optimized for improved degree of hydrolysis and sensory evaluation of hydrolysates by the combined use of single factor experiments and Box-Behnken response surface methodology. A combination of neutral protease and flavourzyme at a mass ratio of 2：1 was found to be optimal for the hydrolysis of Mactra quadrangularis meat based on degree of hydrolysis and sensory evaluation of hydrolysates. The optimal hydrolysis conditions were further determined as follows： enzyme dosage， 2.4‰； hydrolysis time， 5.5 h； hydrolysis temperature， 52 ℃； material-to-liquid ratio， 1：4； and natural pH. Under these conditions， the enzymatic hydrolysate indicated a higher degree of hydrolysis and a better flavor.
Key words：Mactra quadrangularis； enzymatic hydrolysis； degree of hydrolysis； seafood condiment
中图分类号：TS254.9
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）14-0017-07
doi：10.7506/spkx1002-6630-201514004
收稿日期：2014-12-08
基金项目：“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD29B06）
作者简介：高郡焕（1989—），女，硕士研究生，研究方向为水产品贮藏加工。E-mail：970237847@qq.com
*通信作者：李学鹏（1982—），男，副教授，博士，研究方向为水产品贮藏加工。E-mail：xuepengli8234@163.com励建荣（1964—），男，教授，博士，研究方向为水产品贮藏加工与食品安全。E-mail：lijr6491@163.com