表1 响应面试验因素水平表
Table1 Factors and levers used in RSM design
因素水平－101 A氢氧化钠质量浓度/（g/100 mL）81012 B提取温度/℃708090 C提取时间/min507090
曾小峰 1，白小鸣 1，2，盖智星 1，彭雪娇 1，王 华 1，3，*
（1.西南大学柑桔研究所，重庆 400712；2.西南大学食品科学学院，重庆 400715；3.国家柑桔工程技术研究中心，重庆 400712）
摘 要：以柚皮为原料研究超声辅助提取纤维素的工艺条件，通过单因素试验，分别考察氢氧化钠质量浓度、提取温度、提取时间及过氧化氢体积分数对柚皮纤维素含量的影响。在此基础上，应用响应面分析氢氧化钠质量浓度、提取温度、提取时间及三者两两交互作用对响应值的影响，确定了柚皮纤维素提取的最佳工艺参数。结果表明：各因素对纤维素含量影响的显著性表现为提取温度＞氢氧化钠质量浓度＞提取时间，通过响应面法优化的最佳工艺条件为氢氧化钠质量浓度为9.4 g/100 mL、提取温度为84℃、提取时间为77 min，在此条件下柚皮纤维素含量为63.12%。
关键词：柚皮；纤维素；超声波提取；响应面
我国柚类种植历史悠久，种质资源丰富，其生产面积和产量均居世界第1位 ［1］。中国柚子以鲜食为主，但随产量的增加，柚类加工也不断扩大，并伴随大量副产物——柚皮，约占整个柚子果实质量的30%以上，富含黄酮类、果胶、纤维素等 ［2］，目前对于柚皮的处理除少部分制作糖制品以外，大部分以生活垃圾填埋处理，不仅浪费资源，还造成环境的污染 ［3］。为了减小环境污染及提高柚皮的经济价值，研究者对柚皮进行了开发利用，但研究主要集中在其功能性成分分离提取，如果胶、黄酮类、香精油、膳食纤维等 ［4］，对柚皮中含量丰富的纤维素的提取和应用却极其少见。
纤维素是由葡萄糖残基通过β-1，4-糖苷键联结而成的具有高度结晶区的长链分子 ［5］，周围紧密镶嵌着半纤维、木质素和果胶等，需去除这些物质才能得到含量较高的纤维素。现有的提取纤维素的方法主要有物理法：如机械粉碎 ［6］、蒸汽爆破 ［7-8］、微波超声波辅助 ［9］等；化学法：如碱法 ［10］、亚硫酸盐法 ［11］等。物理法一般用于提取的预处理工艺或是辅助工艺，其目的是去除木质素等对纤维素具有保护作用的成分 ［12］。因此，本实验采用超声波辅助化学法提取柚皮中的纤维素，采用响应面分析法优化提取工艺，以获得柚皮纤维素提取的最佳工艺，以期为更好地开发柚皮纤维素提供参考。
1.1 材料与试剂
梁平柚采购于重庆市梁平县。
盐酸、氢氧化钠、过氧化氢、冰醋酸、乙醇、硫酸、重铬酸钾、硫酸亚铁铵、硝酸、邻二氮菲等均为分析纯。
1.2 仪器与设备
恒温水浴锅 上海双舜实业发展有限公司；KQ5200E型超声波仪器 昆山市超声仪器有限公司；L550台式离心机 长沙湘仪器离心机有限公司；BT224S电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；GZX-9240MBE型电热恒温鼓风干燥器 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；6202型高速粉碎机 北京燕山正德机械设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 柚皮的预处理
柚子清洗干净，用手工除去表皮油胞，切成2 cm×2 cm小块，电热恒温鼓风干燥器65 ℃烘干，粉碎过筛（60 目），得到柚皮粉，4 ℃贮藏备用。
1.3.2 柚皮纤维素提取工艺流程
柚皮→干燥→粉碎→0.1 mol/L的盐酸溶液处理→氢氧化钠溶液去半纤维素→过氧化氢溶液去木质素、脱色→95%酒精脱酯、脱色→洗涤→干燥→柚皮纤维素
1.3.3 柚皮纤维素提取分析
1.3.3.1 去除果胶
将粉碎后的柚皮粉按1∶20（g/mL）的料液比加0.1 mol/L盐酸溶液85 ℃水浴处理2 h，不断搅拌，3 层纱布抽滤，去除果胶，蒸馏水洗涤至中性，60 ℃电热恒温鼓风干燥器干燥，粉碎机粉碎，储存备用。
1.3.3.2 去半纤维素
将去除果胶的柚皮粉按1∶20（g/mL）的料液比加入氢氧化钠溶液，在超声功率为200 W，一定温度条件下超声处理一定时间去除半纤维素，3 层纱布抽滤，蒸馏水洗涤3 次，保留滤渣待用。
1.3.3.3 去木质素
将去半纤维素的滤渣按1∶20（g/mL）料液比加过氧化氢溶液，由于在碱性环境下能促进H 2O 2水解除去木质素，因此用氢氧化钠溶液调节pH值至11左右 ［13-14］，在30 ℃水浴条件下反应30 min，蒸馏水洗涤至中性，95%的酒精洗脱酯类及去除部分色素，60 ℃烘干，得到柚皮纤维素。
1.3.4 纤维素含量测定
采用重铬酸钾-硫酸亚铁铵法 ［15］。
1.3.5 单因素试验设计
称取去除果胶的柚皮粉末5 g，按料液比1∶20，以氢氧化钠质量浓度（4、6、8、10、12 g/100 mL）为变量，在相同超声功率（200 W）、80 ℃条件下于超声仪器中固定位置处理70 min，以纤维素含量为指标确定最佳氢氧化钠质量浓度。
以最佳氢氧化钠质量浓度在不同提取温度（50、60、70、80、90 ℃）条件下反应，确定最佳提取温度。
以最佳氢氧化钠质量浓度、最佳温度条件下，以时间（50、70、90、110、130 min）为变量条件下反应，确定最佳提取时间。
以最佳氢氧化钠质量浓度、最佳温度、最佳时间条件下，以过氧化氢体积分数（4%、6%、8%、10%、12%）为变量条件下反应，确定最佳过氧化氢体积分数。
1.3.6 响应面试验选择最佳提取条件
基于单因素试验结果，根据Box-Behnken试验设计原理，综合单因素影响试验结果，选择氢氧化钠质量浓度、提取温度、提取时间3 个主要因素为自变量，设计三因素三水平响应面试验表，因素与水平设计如表1所示。
表1 响应面试验因素水平表
Table1 Factors and levers used in RSM design
因素水平－101 A氢氧化钠质量浓度/（g/100 mL）81012 B提取温度/℃708090 C提取时间/min507090
2.1 单因素试验结果分析
2.1.1 氢氧化钠质量浓度对柚皮纤维素含量的影响
图1 氢氧化钠对柚皮纤维素含量的影响
Fig.1 Effect of sodium hydroxide concentration on the purity of pomelo peel cellulose
由图1可知，随着氢氧化钠质量浓度的增加，纤维素含量不断增加，原因是随着氢氧化钠质量浓度增加，蛋白质、色素、黄酮类等碱溶性物质不断被溶出 ［16］。同时，纤维素结构变的松散，半纤维素等不断被溶解，因而纤维素含量不断增加；当氢氧化钠质量浓度达到10 g/100 mL时纤维素含量达到最大，继续增大氢氧化钠质量浓度时，纤维素含量下降，其原因可能为纤维素被碱分解掉一部分，另外，部分纤维素可与碱液发生反应生产碱纤维素。
2.1.2 提取温度对柚皮纤维素含量的影响
图2 提取温度对柚皮纤维素含量的影响
Fig.2 Effect of extraction temperature on the purity of pomelo peel cellulose
由图2可知，随着温度的升高，分子运动加剧，碱的反应活力加强，纤维素大分子间的糖苷键断裂，促使半纤维素、木质素等物质溶出，使纤维素含量不断增加，在80 ℃时，含量达到最大。之后再升高温度时，由于过高的温度使得纤维素自身结构遭到破坏而发生降解，因而纤维素含量显著下降。
2.1.3 提取时间对柚皮纤维素含量的影响
图3 提取时间对柚皮纤维素含量的影响
Fig.3 Effect of ultraconication time on the purity of pomelo peel cellulose
由图3可知，在70 min时出现峰值，之前随提取时间延长，纤维素含量急剧增加，之后急剧下降，90 min后下降趋势变得缓慢。时间较短时，反应不完全，提取的纤维素不纯，随着时间的延长，当物料与溶液充分反应时，纤维素含量最高；继续延长时间，物料黏度增加，纤维素含量反而下降 ［17］。
2.1.4 过氧化氢体积分数对柚皮纤维素含量的影响
过氧化氢对提取的纤维素具有漂白作用，同时有研究 ［18］表明，在高温环境下，过氧化氢分解成的氢基自由基可在氧负离子的协调作用下与木质素反应，使木质素链发生断裂，从而使纤维素含量增加；从图4可以看出，过氧化氢体积分数对纤维素含量影响不大，随着过氧化氢体积分数增加，纤维素含量从55%左右增加到最大值57.47%，此后再增加过氧化氢体积分数，含量开始缓慢下降，最后趋于平缓。
图4 过氧化氢体积分数对柚皮纤维素含量的影响
Fig.4 Effect of hydrogen peroxideon concentration on the purity of pomelo peel cellulose
2.2 响应面法优化超声辅助提取柚皮纤维素工艺
2.2.1 响应面模型设计方案及试验结果
在对氢氧化钠质量浓度、提取温度、提取时间、过氧化氢体积分数进行单因素试验的基础上，选择对纤维素含量影响较大的3 个因素，采用Design-Expert 8.0.6软件，以表1的因素水平设计17组试验，分别测定纤维素含量，设计方案及结果见表2。
表2 响应面设计方案及试验结果
Table2 Response surface design scheme and experimental results
试验号A氢氧化钠质量浓度B提取温度C提取时间纤维素含量/% 1 0 0 0 62.30 2－1－148.88 3－10－156.52 4 0 0 0 61.50 0 5－11057.95 6 0 1 1 60.40 64.01 8－10161.43 9－1－1051.20 1001－157.47 1111057.06 121－1047.25 1300064.50 1400059.80 1510153.52 160－1151.61 1710－155.63 7 0 0 0
2.2.2 响应面模型建立与显著性检验
由表3可知，模型达到极显著水平，而失拟项不显著，说明试验设计可靠，所拟合的二次回归方程合适，可用此模型对柚皮纤维素提取进行分析和预测；各因素中一次项B、二次项A 2、C 2对纤维素含量有极显著影响；一次项A、交互项AC、二次项C 2对纤维素含量有显著影响。各因素对纤维素含量的影响大小顺序为提取温度＞氢氧化钠质量浓度＞提取时间。其中，氢氧化钠质量浓度和提取时间对纤维素含量具有交互作用，且达到显著水平。
表3 纤维素含量响应面模型的方差分析
Table3 Analysis of variance for the response surface quadratic model for cellulose puriittyy
注：**.差异极显著（P＜0.01）；*.差异显著（P＜0.05）。
来源平方和自由度均方F值P值显著性模型403.33944.8122.010.000 2** A氢氧化钠质量浓度23.26123.2611.420.011 8* B提取温度143.991143.9970.71＜0.000 1** C提取时间8.9518.954.390.074 3 AB2.3412.341.150.319 2 AC12.32112.326.050.043 5* BC0.0110.014.91×10 －30.946 1 A 246.83146.83230.002** B 2128.31128.363＜0.000 1** C 218.75118.759.210.019*残差14.2572.04失拟项3.0731.020.370.782 7净误差11.1942.8总误差417.5916
根据各项的回归系数，得到模型的回归方程为：
Y=62.22－1.71A+4.24B+1.06C+0.77AB－1.76AC+ 0.05BC－3.33A 2－5.52B 2－2.11C 2
2.2.3 响应面分析与优化
根据回归方程，得到各因素交互作用对纤维素含量影响的响应面图和等高线图，分别为图5。其中，等高线的形状可反映出交互效应的强弱大小，等高线圆形表示两因素交互作用不显著，椭圆表示两交互作用显著 ［19］。响应面图的曲面性状可以看出影响因素的显著水平，曲面较陡说明影响显著，曲面较圆说明影响不显著 ［20］。
图5 各因素交互作用对柚皮纤维素含量影响的响应面图
Fig.5 Response surface and contour plots for the interactive effects of NaOH treatment conditions on the cellulose content of pomelo peel extract
由图5a可知，提取时间一定时，随着氢氧化钠质量浓度增加和提取温度的升高，纤维素含量呈先升高后下降的趋势。当氢氧化钠质量浓度在10 g/100 mL左右，提取温度在80 ℃左右时，含量有最大值。从响应面图中，明显看到温度曲面变化较氢氧化钠质量浓度曲面变化更陡，说明提取温度对纤维素含量影响较氢氧化钠质量浓度更显著。由图5b可知，提取温度一定时，纤维素含量随着氢氧化钠质量浓度增加呈先升高后下降的趋势，随提取时间的延长而一直升高。当氢氧化钠质量浓度在10 g/100 mL左右，提取时间在66～74 min时，含量有最大值。由等高线图可以看出，该等高线为椭圆形图案，可以推出其两因素的交互作用对含量影响显著。由图5c可知，在10 g/100 mL氢氧化钠质量浓度不变条件下，纤维素含量随提取温度的升高先上升后下降，提取时间对纤维素含量的影响则为先上升后趋于平稳趋势。当提取温度在80℃左右，提取时间在66～74 min时，含量有最大值。
2.2.4 验证实验结果
通过响应面法优化后的最佳提取工艺条件为氢氧化钠质量浓度9.38 g/100 mL、提取温度83.61 ℃、提取时间77.54 min，此时预测含量的理论值为63.53%。考虑到实际操作性，选择氢氧化钠质量浓度9.4 g/100 mL、提取温度84 ℃、提取时间77 min。为检测结果的可靠性，采用最佳条件做验证实验，纤维素含量为63.12%，与理论值较为接近，说明拟合程度较好，可以利用该工艺条件制备柚皮纤维素。
在单因素的试验基础上，通过响应面分析法，以纤维素含量为响应值，得到柚皮纤维素提取的最优工艺条件：氢氧化钠质量浓度为9.4 g/100 mL、提取温度84 ℃、提取时间77 min，在此条件下，柚子皮纤维素含量为63.12%。通过实验得到的结果与罗均 ［21］、Ejikeme ［22］等分别采用琯溪蜜柚、橙皮渣得到的纤维素含量相近，分别为67.7%、62.5%。存在 的差别可能是品种不同及提取条件不同引起，但基本保持一致。
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Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of Cellulose from Pomelo Peel by Response Surface Methodology
ZENG Xiaofeng
1， BIAO Xiaoming
1，2， GE Zhixing
1， PENG Xuejiao
1， WANG Hua
1，3，*
（1. Citrus Research Institute， Southwest University， Chongqing 400712， China； 2. College of Food Science， Southwest University，Chongqing 400715， China； 3. National Citrus Engineering Research Center， Chongqing 400712， China）
Abstract：The present study optimized the ultrasonic-assisted extraction of cellulose from pomelo peel by the combined use of single factor method and response surface methodology （RSM）. In the extraction process， pomelo peel was ultrasonically treated with （NaOH） at a certain temperature for the removal of hemicelluloses， followed by further removal of lignin and simultaneous decolorization with hydrogen peroxide. The influences of sodium hydroxide concentration， extraction temperature， ultrasonication time and hydrogen peroxide concentration， as well as interactions among the former three variables on the cellulose content （i.e.， purity） of pomelo peel extract were investigated. The results indicated that the cellulose content of pomelo peel extract was affected in decreasing order by the following factors： extraction temperature ＞sodium hydroxide concentration ＞ ultrasonication time. Through response surface methodology， the process conditions for hemicelluloses removal were optimized as follows： NaOH concentration 9.4 g/100 mL， temperature 84 ℃ and ultrasonication time 77 min. Under these conditions， the purity of cellulose extracted from pomelo peel was 63.12%.
Key words：pomelo peel； cellulose； ultrasonic-assisted extraction； response surface methodology
中图分类号：TS255.3
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）14-0034-05
doi：10.7506/spkx1002-6630-201514007
收稿日期：2015-01-14
基金项目：重庆市应用开发计划项目（cstc2013yykfB00001）；公益性行业（农业）科研专项（201503142）
作者简介：曾小峰（1989—），女，硕士研究生，研究方向为食品化学与营养学。E-mail：zengxiaofeng@sinocitrus.com
*通信作者：王华（1963—），男，研究员，学士，研究方向为食品化学与营养学。E-mail：wanghua40@126.com