涂小珂，林燕奎，金晓蕾，林 黎，罗 洁，陈沛金 *
（深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心，深圳市食品安全检测技术研发重点实验室，广东 深圳 518045）
摘 要：目的：建立空气隔断-连续流动分析仪快速测定葡萄酒中总糖含量的分析方法。方法：用样品校正葡萄糖标准溶液，同时在流路中增设透析器以减少样品溶液带来的基质效应及颜色干扰。经过条件优化，流路温度控制在88～92 ℃，水解反应时间、络合反应时间分别为5 min和12 min。结果：在0.05～3.0 g/L质量浓度范围内，体系吸光度与溶液质量浓度线性关系良好（r 2为0.999 7），方法检出限为0.01 g/L，加标回收率在88.1%～102.3%之间，方法相对标准偏差为2.8%～6.2%；测定结果与GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》相比，相对标准偏差小于5%，测定快速（45 样/h）。结论：方法适用于大批量葡萄酒中总糖含量的检测。
关键词：葡萄酒；总糖；空气隔断-连续流动分析
近年来人们生活水平不断提高，对葡萄酒的需求也不断增长，葡萄酒的进口量呈每年递增趋势，已成为我国国际贸易中交易额最大的酒种。总糖是葡萄酒的一个重要理化指标，是区分葡萄酒种类的指标，其含量是判断葡萄酒是否属干红的重要依据 ［1］，在进出口贸易中起到非常关键的作用。葡萄酒中总糖含量的检测方法主要有直接滴定法 ［2］、间接碘量法 ［3］、电位滴定法 ［4］、3，5-二硝基水杨酸比色法 ［5］和硫酸苯酚-显色法 ［6］等。实验室的常规检测方法为直接滴定法 ［2］，该方法对样品中总糖含量、加热温度、滴定速度等都有一定要求，且存在实验人员操作差异。3，5-二硝基水杨酸比色法和苯酚-硫酸显色法都属分光光度法，苯酚-硫酸法适用含糖量较高的样品 ［7］；3，5-二硝基水杨酸法每批仅能测定少量样品且结果受反应时间影响较大 ［7］。随着葡萄酒贸易的增大，消费者对葡萄酒品质要求越来越高，同时为了有效监督进口葡萄酒质量，有必要建立葡萄酒中总糖的快速、准确测定方法。
空气隔断-连续流动分析技术是一种现代湿化学分析法，通过蠕动泵将样品和试剂定量地吸入特定分析模块中进行混合反应，液体间以空气泡间隔，并经消解、蒸馏、透析、加热等在线前处理步骤，最终形成有色化合物，经检测器比色，由电脑数据处理系统自动计算得出结果 ［8-10］。空气隔断-连续流动分析技术已广泛应用于烟草、环保等领域 ［11-12］，在水质检测领域已发布了一系列分析方法的标准 ［13-16］。目前已有报道应用空气隔断-连续流动分析技术检测葡萄酒中重金属砷 ［17］、铅 ［18］、铁 ［19］、二氧化硫 ［19］和白黎芦醇 ［20］等。应用空气隔断-连续流动分析技术检测葡萄酒中总糖还未见报道。本实验利用连续流动分析仪，建立葡萄酒中总糖快速测定方法。样品在线水解、在线透析后在碱性条件下，通过反标法测定样品的总糖含量。该方法操作简单、分析快速、准确、灵敏度高，适用于大批量样品快速的分析。本研究为食品中常规化学检测的自动化研究提供新的实验依据。
1.1 材料与试剂
葡萄糖（CAS：50-99-7，纯度98%） 美国Sigma公司；盐酸、无水碳酸钠（均为分析纯） 天津科密欧化学试剂公司；盐酸新亚铜（色谱纯） 日本东京化成工业株式会社；润滑剂：聚氧乙烯四十二烷醚（Brij-35） 意大利SYSTEA S.p.A公司；实验用水为超纯水。所有试剂使用时都必须加入0.5～1 mL润滑剂。
1.2 仪器与设备
FUTURAⅡ连续流动分析仪（仪器由总糖反应模块、比色池、多通道蠕动泵、XYZ自动进样器、自动稀释器及数据处理系统组成） 法国Alliance公司。
1.3 方法
1.3.1 标准曲线的制备
称取105 ℃烘干3 h的葡萄糖5.000 0g，用纯水溶解后，配制成50 g/L的储备液，移取0.5、2.0、5.0、10、20、30 mL储备液，用纯水配制成0.05、0.20、0.50、1.0、2.0、3.0 g/L的标准系列。
参照GB 15037—2006《葡萄酒》 ［21］方法对葡萄酒样品定值，将定值后的样品稀释成0.05～3.0 g/L标准系列，以此标准系列测定上述葡萄糖标准溶液的质量浓度，其测定结果作为上机使用的校准葡萄糖标准系列。
1.3.2 样品处理
取25 mL样品于100 mL比色管中，加水稀释后，取5 mL样品上机测定。稀释倍数根据样品中总糖的含量而定，使稀释后的总糖含量在0.05～3.0 g/L范围内。
1.3.3 连续流动分析法的建立
1.3.3.1 测定原理
在碱性条件下，总糖水解生成的还原糖与盐酸新亚铜反应生成黄色偶氮物质，通过测定其吸光度大小计算出总糖的含量。本研究根据这一测定原理设计了分析流路。利用流动注射分析仪的在线水解系统使葡萄酒中的总糖水解为还原糖，在Na 2CO 3缓冲溶液的作用下，还原糖与盐酸新亚铜直接反应生成黄色偶氮物质，其在波长450 nm处有最大吸收，选择波长450 nm为检测波长测定产物的生成，与标准系列进行比较从而得出样品中总糖的含量。标准系列采用已知总糖质量浓度的样品反标，减少葡萄酒酒体颜色较深所带来的系统误差，再采用透析器去除流路中的大分子成色物质，进一步消除色素等对显色反应的干扰。
1.3.3.2 测定流路的建立
图1 连续流动分析仪测定葡萄酒中总糖的流路图
Fig.1 Flow scheme for the determination of total sugar
1.蠕动泵：控制流速，以mL/min计；2.混合圈：10 圈；3.加热池：88 ℃；4.混合圈：20 圈；5.透析器；6.混合圈：5 圈；7.加热池：92 ℃；8.混合圈：20 圈；9.检测池：测量波长450 nm、参比波长620 nm；R1.盐酸溶液；R2.碳酸钠溶液；R3.新亚铜溶液；G.空气；S.样品；W.废液。
检测流路如图1所示。样品、盐酸溶液和空气通过蠕动泵分别、连续地进入反应管道，在混合圈充分混合后，通过加热器总糖水解为还原糖，同时蠕动泵在流路中引入Na 2CO 3溶液，在泵压和载气推动下，Na 2CO 3溶液与水解溶液进入透析系统，净化后，经三通管排除废液；剩余溶液与盐酸新亚铜溶液通过混合、加热、显色进入比色池，通过比较吸光度大小计算样品中总糖含量。
1.3.3.3 仪器分析条件
样品分析速度：45 个/h；进样时间：30 s；清洗时间：50 s；寻峰时段：95～105 s；测定波长450 nm，参比波长620 nm；水解加热池温度：88 ℃；分析加热池温度：92 ℃；以工作曲线最高质量浓度点（3.0 g/L）为识别峰，峰值大于0.6（以吸光度表示）即可分析。
2.1 标准工作溶液的校准
在所有葡萄酒的总糖测定方法中，都以葡萄糖作为标准溶液进行测定。但在测定过程中发现，以葡萄糖做标准溶液时，仪器测定结果与国标测定结果差异较大。这是由于方法依据络合产物在特定波长条件下的吸光度来定量，因此反应体系的颜色较深时会对吸光度有一定的干扰。大部分葡萄酒都含有很高的呈色物质，样品的基质效应对络合物的吸光度有一定影响。为了消除样品的基质效应，本实验采用已知总糖质量浓度的样品来标定葡萄糖标准溶液的质量浓度，以反标后的葡萄糖溶液作为测定用标准工作溶液。由表1可以看出，采用配制的葡萄糖标准溶液测定结果与国家标准方法相对标准偏差为0%～8.79%，采用标定后标准溶液测定结果相对标准偏差为－0.97%～4.12%，结果表明采用反标法可以消除样品基质效应，使测定结果更准确。
表1 连续流动分析法、样品反标法与国标滴定法比对实验（n=3）
Table1 Comparison of continuous flow analysis with two other methods （n=3）
样品类型样品编号国标方法测定结果/（g/L）连续流动分析法反标连续流动分析法测定结果/（g/L）相对标准偏差/%测定结果/（g/L）相对标准偏差/%干红葡萄酒12.62.73.852.60.00 23.03.00.003.13.33 33.63.60.003.60.00 42.42.40.002.54.12 53.94.02.564.02.56半干型葡萄酒68.38.74.828.41.20 710.511. 04.7610.71.90 810.310.95.8310.2－0.97 911.512.15.2111.60.87 107.57.95.337.72.67半甜型葡萄酒1113.414.25.9713.72.24 1220.022.412.020.10.50 1312.813.55.4713.01.56 1424.826.98.4725.11.21 1518.219.88.7918.41.10甜型葡萄酒1688.492.84.9888.80.45 1777.882.35.7878.00.26 18102.5108.65.95104.41.85 1991.897.56.2193.01.31 2068.374.28.6468.0－0.44
2.2 连续流动分析仪流路的选择和优化
2.2.1 加热池温度的选择和优化
加热池的温度对总糖水解反应和还原糖络合反应有较大的影响。加热池温度较低时，总糖水解不完全，加热温度过高时，会引起碳水化合物水解及糖的焦化反应。还原糖与盐酸新亚铜的络合反应需要在高温条件下进行，温度越高反应越完全。2 个反应对温度的要求有一定差异，对于一个封闭的流路来说，太大的温差容易形成压力差，使溶液倒灌。本实验采用3.0 g/L蔗糖溶液，从70 ℃开始逐渐升高水解温度，以单糖的生成率优化水解温度；以3.0 g/L葡萄糖溶液与盐酸新亚铜络合反应络合物的生成率优化络合反应温度。结果表明：温度低于85 ℃时，蔗糖水解不完全，络合温度低于92 ℃，络合反应不完全。加热池温度在88～92 ℃之间，水解反应和络合反应都能完全进行且整个流路不会产生较大压力差。因此本实验选择水解温度为88 ℃，络合反应温度为92 ℃。
2.2.2 加热池中混合圈的选择和优化
加热池中混合圈的大小控制整个流路的化学反应时间及反应体系的pH值。混合圈孔径越大，反应时间越长。本实验以3.0 g/L蔗糖溶液，考察了水解温度在88 ℃时不同反应时间对总糖水解的影响。以3.0 g/L的葡萄糖糖溶液，在92 ℃条件下考察不同反应时间与盐酸新亚铜的络合效果。实验结果表明：反应时间小于5 min，蔗糖水解不完全；反应时间大于5 min，蔗糖水解完全。在92 ℃条件下，12 min以后，络合产物可达90%以上，考虑到在高温条件下水解时间过长容易产生糖醛反应，因此加热池选择混合圈孔径为2 mm，使其水解时间控制在5 min，络合反应时间控制在12 min。
2.2.3 透析器对测定的影响
利用样品校正标准溶液较好的解决了样品反应体系与标准溶液反应体系因颜色不一致所带来的误差，但在实验过程中发现部分样品的仪器测定结果与标准方法测定结果仍存在较大差异。通过研究发现，水解液经碱中和以后，溶液的颜色较水解反应前变深，红葡萄酒的颜色可以从酒红色变为黑色，样品溶液的颜色变化是导致误差的主要原因。为减少误差，在水解反应后的流路上增加一个透析器，通过透析膜的选择性吸收原理，将溶液中大分子的色素和其他杂质过滤出来，与废液一起排出。采用这种方式，不仅可以减少样品颜色变化所带来的测定误差，同时由于去除了溶液中的大分子物质，避免其在检测池中的沉淀，可以延长检测池的使用寿命。
2.3 方法线性范围、定量限、精密度和回收率
在上述实验条件下，将标准工作溶液逐级稀释进样，测定吸光度及基线噪音强度，考察连续流动分析仪测定葡萄酒总糖时样品质量浓度与信号的线性关系。结果表明，溶液中总糖含量在0.05～3.0 g/L范围内，Y=3.723X－0.008，r 2为0.999 7，呈良好的线性关系；检出限为0.01 g/L，以3 倍信噪比计算。对实际样品进行3 个水平加标实验，每个水平重复测定6 次，测定平均回收率及精密度（以相对标准偏差表示）。实验表明，方法回收率为88.1%～102.3%，相对标准偏差为2.8%～6.2%。具体结果见表2。
表2 连续流动分析法测定样品中总糖的回收率、精密度（n=6）
Table2 Recoveries and relative standard deviations （RSDs） of total sugar in samples （n = 6）
初始质量浓度/（g/L）相对标准偏差/% 5 8.8698.43.4 3.941014.17102.32.8 5051.7495.64.5 5 5.43588.16.2 1.031010.9999.63.3 5048.8895.74.0添加水平/（g/L）平均测定值/（g/L）平均回收率/ %
2.4 样品测定
抽取干型、半干、半甜、甜型4 种不同类型的葡萄酒样品分别用国标方法的直接滴定法、连续流动分析法及样品反标-连续流动分析法进行测定。结果对比见表1。从比对数据看出，连续流动分析法测定结果与国标方法差异较大，随着糖度的增加，差异增大，相对标准偏差最大达12%，而样品反标-连续流动分析法的方法差异明显减小，该方法具有良好的精密度，且仪器检测速度快，达45 样/h。
本实验利用空气隔断-连续流动分析技术建立了一种测定葡萄酒中总糖含量的新方法。结果表明，该方法简单、快速、灵敏度高，与国标方法测定结果的相对标准偏差小于5%，满足理化分析方法的质量控制要求 ［22］，本方法适用于各类型葡萄酒中总糖含量的高通量快速测定。
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Determination of Total Sugar in Wine by Air-Segmented Continuous Flow Analysis
TU Xiaoke， LIN Yankui， JIN Xiaolei， LIN Li， LUO Jie， CHEN Peijin*
（Shenzhen Key Laboratory of Detection Technology R & D on Food Safety， Food Inspection Center of CIQ-Shenzhen，Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Shenzhen 518045， China）
Abstract：Objective： To develop a method for the determination of total sugar in wine by air-segmented continuous flow analysis （CFA）. Methods： Glucose standard solution corrected with sample and the addition of dialyser in the flow path were used to reduce the matrix effects and color interference. Stream temperature was controlled at 88-92 ℃， and hydrolytic reaction and complexation reaction were carried out for 5 and 12 min， respectively. Results： In the concentration range of 0.05-3.0 g/L， there was a good linear relationship between absorbance and concentration （r 2= 0.999 7）. The limit of quantification （LOD） was 0.01 g/L. The recoveries were in the range of 88.1%-102.3% with relative standard deviations（RSD） between 2.8% and 6.2%. Compared with the titration method from the national standard of China （GB/T 15038—2006）， the relative error was less than 5% and the sample frequency was 45/h. Conclusion： The presented method can be used to determine total sugar in large quantities of wine.
Key words：wine； total sugar； air-segmented continuous flow analysis （CFA）
中图分类号：TS207.3
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）14-0087-04
doi：10.7506/spkx1002-6630-201514017
收稿日期：2014-11-25
基金项目：国家质检总局科技计划项目（2014IK124）
作者简介：涂小珂（1978—），女，工程师，硕士，研究方向为食品理化检测。E-mail：tuxiaoke@163.com
*通信作者：陈沛金（1979—），女，工程师，学士，研究方向为食品和化妆品理化检测。E-mail：szciqfood@126.com