杨丽君 1，梁君妮 2，曹 鹏 2，关丽丽 2
（1.威海出入境检验检疫局，山东 威海 264200；2.烟台出入境检验检疫局，山东 烟台 264000）
摘 要：研究鲤鱼鱼肉基质中氟苯尼考的标准样品制备方法。通过添加氟苯尼考养殖鲤鱼获得样品基质，用液相色谱串联质谱法对样品的均匀性和稳定性进行检测，通过8 家实验室协作定值的方式对标准样品进行定值和不确定度评估，结果表明样品的均匀性良好，稳定性可达36 个月，可以用于水产品中氟苯尼考残留检测质量控制和相关的科研需要。
关键词：标准样品；氟苯尼考；均匀性；稳定性；不确定度
氟苯尼考是一种新型的酰胺醇类动物专用抗生素，具有抗菌谱广、毒副作用小、不易产生耐药性等特点，被畜牧和水产养殖业广泛应用 ［1］。氟苯尼考在体内分布较广，半衰期长，具有胚胎毒性和耐药性，在动物组织中残留会严重危害消费者的健康与安全。随着氟苯尼考在养殖中大量、不规范应用，它在畜禽、水产品等动物性食品中的残留问题也日益被重视 ［2］。我国农业部公告规定，氟苯尼考在水产品的肌肉和皮脂最高残留限量不得超过1 000 μg/kg；日本规定，氟苯尼考在鱼类中的残留限量不得超过200 μg/kg；美国食品药品监督管理局规定水产品中氟苯尼考的残留限量不得超过100 μg/kg。本研究从养殖到定值进行探讨，研制了性质稳定、可长期保存的氟苯尼考冻干基体标准样品。
目前氟苯尼考的检测方法有高效液相色谱法、薄层色谱法、液相色谱-质谱联用法等，在食品兽药残留检测过程中，通常采用加标回收实验作为质量控制的手段。但与实物标准样品相比，加标回收实验是一种模拟阳性样品，难以反映出真正阳性样品的提取效率，如欧盟明确要求动物源食品兽药残留检测必须采用基体标准样品进行过程质量控制。
虽然我国食品相关的标准样品不少，但目前标准样品主要集中于无机元素方面，含兽药残留标准样品的研究较少。本研究以鲤鱼为养殖对象，模拟用药得到天然污染的原料，经制备得到氟苯尼考实物标样，该样品均匀、稳定，有助于对氯霉素类的药品进行监测或作为实验室质控样品。
1.1 材料与试剂
实验用鲤鱼购于市场。
氟苯尼考标准物（纯度＞99.0%） 德国Dr. Ehrenstorfer公司；乙酸乙酯、甲醇、正己烷（均为色谱纯） 德国Merk公司；乙酸、甲酸（均为色谱纯）天津市科密欧化学试剂有限公司；水为超纯水。
1.2 仪器与设备
1290B型高效液相色谱、G6490A三重四极杆质谱仪美国Agilent公司；CF16RXⅡ型高速冷冻离心机 日本Hitachi公司；Milli-Q超纯水制备机 美国Millipore公司；氮吹浓缩仪 美国Organomation Associates公司。
1.3 方法
1.3.1 标准样品的制备
由市场上直接购买活鲤鱼，从中随机取样，检测确认为阴性样品后进行饲养。在室温环境下养殖2 d 后，根据预先设定的药物含量，向鱼池中添加氟苯尼考，实时监控检测水体中和鱼体内的氟苯尼考含量，氟苯尼考在鱼体内的含量不断富集增高，当鱼肉中的氟苯尼考含量达到预设含量时，将鲤鱼捕捞至不含药物的池中继续养殖1 d 后捕捞。
将鲤鱼宰杀，洗去血水取肌肉部分，混合搅碎制成鱼糜，－70 ℃真空冷冻干燥。将冷冻干燥的鱼糜粉碎后研磨过筛，用聚乙烯瓶分装，加贴唯一性标识，常温保存，每个瓶内样品质量约4.0 g，共768 瓶。以备进一步做均匀性和稳定性检测 ［3］。
1.3.2 样品前处理
依据GB/T 22959—2008《河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定：液相色谱-串联质谱法》，称取（1.00±0.01）g鱼粉样品，置于50 mL聚四氟乙烯离心管中，加入4.0 mL纯水浸泡过夜。加入25 mL乙酸乙酯和0.75 mL氨水，超声波混合5 min，5 000 r/min离心5 min，移取上层乙酸乙酯至25.0 mL鸡心瓶中，向残渣中再加20 mL乙酸乙酯和0.60 mL氨水，振荡混合5 min，5 000 r/min离心5 min，合并上层乙酸乙酯相，40 ℃旋转浓缩至近干，氮气吹干。加入1 mL流动相（V（甲醇）∶V（水）=60∶40）定容，振荡混合30 s，加入2 mL正己烷，振荡1 min，除去上层正己烷，再加入2 mL正己烷，振荡1 min，取下层水相5 000 r/min离心5 min，溶液过滤膜后供液相色谱-串联质谱仪测定。
1.3.3 液相色谱及质谱条件
色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C 18柱（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）；柱温：30 ℃；进样体积：2.0 μL；流动相A为水，流动相B为甲醇；流速：0.4 mL/min；梯度洗脱程序：0～0.1 min，10% B；0.1～4.0 min，10%～95% B；4.0～5.0 min，10% B；离子源：电喷雾离子源；扫描方式：多反应监测，电子倍增管电压：350 V；雾化气压力：20 psi；干燥气温度：200 ℃；干燥气流速：12 L/min；毛细管电压：3 000 V；定量离子对m/z 356/185；定性离子对m/z 356/336。
1.3.4 均匀性检验
从制备的标准样品中随机抽取15 个独立包装，每个样品重复测试3 次，分析样品中氟苯尼考的含量。所有的样品以随机次序在重复性条件下测试，按照上述检测方法对样品进行均匀性检测，检测数据用单因素方差分析法来判断标准样品是否均匀 ［4］。
1.3.5 稳定性检验
稳定性是标准样品研制的关键，本实验同时考察了鱼肉冻干粉氟苯尼考标准样品的短期稳定性和长期稳定性 ［5-8］。
标准样品稳定性研究的基本模型是Y=β 0+β 1X+ε，用线性拟合模型评估标准样品的稳定性，以x代表时间，y代表标准样品中氟苯尼考的含量，斜率b 1用式（1）计算 ［17］：
截距b 0用式（2）计算 ［17］：
与斜率相关的不确定度S b1用式（3）计算 ［17］：
在95%的置信水平，t临界值用t 0.95（n－2）表示，当|b 1|＜t 0.95（n－2）·S b1，表明标准样品是稳定的。
1.3.5.1 短期稳定性检验
短期稳定性实验进行30 d，按先密后疏选0、2、5、9、14、30 d 6 个时间点，随机取18 瓶放于（40±2） ℃保存，模拟运输中遇到的极端温度，每次测量随机选择3 瓶，平行测定2 次，进行样品的短期稳定性分析。
1.3.5.2 长期稳定性检验
将样品的存放温度设定为（－20±2） ℃，长期稳定性实验时间为24 个月，选6 个时间点0、3、6、12、18、24 月，每次测量随机选择3 瓶，平行测定2 次，进行样品的长期稳定性分析。
1.3.6 定值分析
参照CNAS—CL04：2007《标准物质标准样品生产者能力认可准则》 ［9］第二部分标准物质标准样品的定值-通用原则和统计原理，标准样品由多个实验室采用多种方法进行定值，本研究选择8 家氟苯尼考检测能力得到中国国家合格评定委员会认可的实验室进行协作定值，每个实验室发3 个样品，每个样品独立测定2 次，定值方法为实验室认可的检测方法 ［10-12］。
2.1 样品谱图
按前述分析方法处理样品后，得到的选择离子监测色谱图（10 μg/kg）如图1所示。由图1可见，氟苯尼考的响应值良好，标准鱼肉样品中氟苯尼考的残留量是适当的。
图1 鱼肉中氟苯尼考的总离子图
Fig.1 Total iron chromatograms of florfenicol in fish
2.2 均匀性检测结果
标准样品的特性应当均匀，即在规定的细分范围内保证其特性不变。在均匀性检验过程中，一般需同时考察组间均匀性及组内均匀性 ［13-16］，用方差分析法通过对两者的比较来判断各组测量值之间有无系统性差异，如果两者的比小于统计检验的临界值，则认为样品是均匀的。均匀性检验结果如表1、2所示。
表1 氟本尼考标准样品均匀性检验（n=3）
Table1 Homogeneity test of florfenicol reference material （n= 3）
μg/kg试验号氟苯尼考含量平均值1 2 3 9.759.809.53 9.69 2 10.7010.5910.3610.55 3 9.959.5510.02 9.84 4 10.2210.8810.46 10.52 5 10.149.8110.55 10.17 6 10.6810.439.73 10.28 7 10.1810.0910.30 10.19 8 10.5910.7110.09 10.46 9 10.2210.2610.24 10.24 1010.1710.2210.82 10.41 1110.379.7210.27 10.12 1210.359.889.77 10.00 1310.129.619.86 9.86 1410.7310.009.53 10.09 1510.639.839.79 10.08 1
表2 氟本尼考样品均匀性检验的单因素方差分析结果
Table2 Results of one-way analysis of variance for florfenicol homogeneityneity
方差来源平方和自由度均方F值P值F 0.05（14，30）组间2.701 752140.192 9821.671 7320.116 116 62.037 42组内3.463 156300.115 439总计6.164 90944
根据方差分析原理，该统计量是自由度为（v 1，v 2）的F分布变量。由公式v 1=m－1，v 2=N－m，并已知m=15，N=3×15=45；则v 1=14，v 2=30，F=1.672＜F 0.05（14，30）=2.037，故该样品组内及组间无显著性差异，样品均匀性良好，能满足实验要求。
2.3 稳定性检测结果
2.3.1 短期稳定性
表3 氟本尼考标准样品短期稳定性检验（n=6）
Table3 Short-term stability test of florfenicol reference material （ n= 6）
μg/kg时间/d氟苯尼考含量平均值123456 09.759.809.5310.1810.0910.309.94 210.2010.309.9610.4010.4010.1010.23 510.7010.5010.3010.9010.5010.6010.58 99.8910.3010.009.969.8210.3010.05 1410.3010.4010.5010.6010.8010.4010.50 3010.3010.4010.5010.209.6510.6010.28
表3是6 个时间点测得的氟苯尼考含量的数据及平均值，线性拟合模型分析结果见表4，从表4可以看出，
表明氟苯尼考在（40±2）℃极端运输条件下30 d内无明显的降解趋势，未观测到不稳定性。
表4 氟本尼考标准样品短期稳定性数据分析结果
Table4 Linear model for short-term stability of florfenicol reference material
项目数值项目数值时间点个数6直线标准偏差s0.283 6时间平均10斜率的不确定度S b10.010 9含量平均值10.26t 0.05（n－2）2.776斜率b 10.005 6t 0.05（n－2）·S b10.030 28截距b 010.21稳定性结论b 1＜t 0.05（n-2）·S b1，稳定
2.3.2 长期稳定性
表5是6 个时间点测得的氟苯尼考含量的数据及平均值，线性拟合模型分析结果见表6，通过分析可得出
故斜率是不显著的，表明氟苯尼考在（－20±2）℃条件下24 个月内未观测到不稳定性。
表5 氟本尼考标准样品长期稳定性检验数据
Table5 Long-term stability test of florfenicol reference material
μg/kg时间/月氟苯尼考含量平均值123456 09.959.5510.2010.5010.109.8110.02 39.349.559.4210.139.6710.019.69 69.939.9510.009.8410.2010.009.99 1210.3010.4010.2010.3010.3010.5010.33 1810.2010.409.7810.3010.2010.3010.20 249.9810.309.9010.1010.3010.2010.13
表6 氟本尼考样品长期稳定性数据的分析结果
Table6 Linear model for long-term stability of florfenicol reference material
0.009 65含量平均值10.06t 0.95（n-2）2.776斜率b 10.013 9t 0.95（n-2）·S b1项目数值项目数值时间点数6直线标准偏差s0.199 4时间平均10.5斜率的不确定度S b10.026 8截距b 09.91稳定性结论b 1＜t 0.95（n-2）·S b1，稳定
从实验结果可以看出，鱼肉冻干粉氟苯尼考标准样品的短期稳定性和长期稳定性都很良好，完全符合标准样品的要求。
2.4 定值
8 个认可实验室均采用液相色谱-串联质谱法检测，参加协同定值数据及处理结果见表7。
表7 各定值实验室的氟苯尼考测定数据（n=6）
Table7 Analytical data for florfenicol obtained by different accredited laboratories （n= 6）
实验室氟苯尼考含量/（μg/kg）平均值/（μg/kg）相对标准偏差/% 123456标准偏差/（μg/kg）110.5910.7110.0910.2210.2610.2410.350.241 62.334 29.9310.2010.2410.299.8710.1310.110.171 91.701 310.4010.6010.6010.4010.7010.8010.580.160 21.514 410.109.989.6210.5010.1010.3010.100.298 32.953 59.9210.4710.7410.5110.6010.8310.510.320 33.047 610.4610.1910.4810.3110.2110.2210.310.129 51.256 79.199.749.219.329.379.429.380.199 92.132 89.969.9110.0910.089.929.989.990.078 00.781
将每个实验室的数据 先用Grubb's法进行检验，无异常值；汇总各实验室数据，将所有的数据按大小顺序排列，进行夏皮罗-威克尔检验，公式见式（4） ［17］
经计算W=0.959，当n=48时，P=0.947，W＞P，表明在显著性水平α=0.05上符合正态分布。再将每个实验室的平均值组成一组数据，用Grubb's法进行双侧情形检验，确定各实验室数据无异常值；将所有数据进行下一步统计，用Cochran检验以确定8 个实验室中没有随机误差太大的实验室，公式见式（5） ［17］：
式中：s i为各实验室测定结果的标准偏差；s max为s i中的最大值。
显著性水平α=0.05，测定组数为8，每组测定6 次，计算C值，与Cochran检验临界值C
0.05（8，6）比较，经检验，C=0.278 8，C
0.05（8，6）=0.36，C＜C
0.05（8，6），表明各实验室间的测量属于等精度测量，汇总所有数据，计算总平均值为氟苯尼考标准样品含量定值结果：
10.17 μg/kg。
2.5 不确定度评估
本标准样品的不确定度来源主要有以下几个方面 ［18-23］：标准样品的不均匀性引入的不确定度，标准样品的不稳定性引入的不确定度以及标准样品定值过程中引入的不确定度。考虑到氟苯尼考标准样品在室温条件下有较好的稳定性，该保存条件在运输中比较容易实现，因此在合成不确定度中可以不考虑短期稳定性不确定度分量。
由标准样品不均匀性引入的不确定度，见表2，当组间均方MS among＞组内均方MS within，不均匀性不确定度 ［17］u bb=S bb。
由标准样品不稳定性引入的不确定度，设长期稳定性保质期t为24 个月，则由长期不稳定性带来的不确定度贡献为：u lts=S b·t=0.009 65×24=0.231 6 μg/kg。
由定值引入的标准样品不确定度
［17］为：
经计算，u char=0.134 5 μg/kg。
标准样品的合成不确定度 ［17］公式为：
经计算，氟苯尼考标准样品的各项不确定度如表8所示。
表8 氟苯尼考标准样品的不确定度
Table8 Uncertainty of florfenicol reference material
项目数值/（μg/kg）均匀性u bb0.160 8长期稳定性u lts0.231 6总平均值u char0.134 5合成u char0.31扩展不确定度（k=3）0.93
设置信水平为P=99%，包含因子k=3，则标准物质的定值结果为（10.17±0.93）μg/kg。
通过添加氟苯尼考养殖鲤鱼获得样品基质，制备的样品与日常检测样品相一致，在均匀性和稳定性均满足标准样品要求的前提下，通过8 家实验室协作定值的方式对标准样品进行定值和不确定度评估，定值结果通过有证标准物质溯源，同时制备的标准样品稳定性可达到36 个月，满足水产品中氟苯尼考残留检测质量控制和相关的科研需要。本研究样品制备方式和标准样品定值方法的建立，对其他兽药残留标准样品的制备具有参考意义，对于建立食品兽药残留干粉标准样品的国家标准具有重要意义。
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Preparation of Reference Material for the Determination of Florfenicol in Fish
YANG Lijun
1， LIANG Junni
2， CAO Peng
2， GUAN Lili
2
（1. Weihai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Weihai 264200， China；2. Yantai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Yantai 264000， China）
Abstract：A method for preparing florfenicol reference material （RM） from the muscle of common carp fish exposed to aqueous florfenicol when alive was investigated. The homogeneity and stability of the prepared sample were detected by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The certified value for florfenicol was based on analysis of results obtained in 8 accredited laboratories and uncertainty evaluation was conducted. The results showed that the reference material had a good homogeneity and stability within 36 months， and could be used for the determination of florfenicol residue in aquatic products.
Key words：reference material； florfenicol； homogeneity； stability； uncertainty
中图分类号：O657
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）14-0176-05
doi：10.7506/spkx1002-6630-201514034
收稿日期：2014-09-11
基金项目：“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAK08B01）；质检公益性行业科研专项（201310143）；国家质检总局科技计划项目（2013IK178）
作者简介：杨丽君（1969—），女，高级工程师，硕士，研究方向为食品检测。E-mail：18663136117@163.com