SPE-HPLC-ESI-MS-MS测定常见焙烤及油炸食品中丙烯酰胺的含量

李双宜 1,李 蓉 1,*,张朋杰 1,邱 霞 1,李向丽 2

(1.中山出入境检验检疫局,广东 中山 528403;2.中山火炬职业技术学院,广东 中山 528436)

摘 要:目 的:建立一种焙烤和油炸食品中丙烯酰胺的固相萃取-高效液相色谱-电喷雾离子化串联质谱检测方法。方法:样品用水提取,Cleanert SLE固相萃取柱净化,高效液相色谱-电喷雾离子化串联质谱测定,内标法定量。结果:在0.01~3.00 mg/L范围内,线性相关系数大于0.998,方法的检出限为1.0 ☒g/kg。在3 个添加量(10、100、1 000 μg/kg)的 平均回收率为96.8%,相对标准偏差为2.7%。结论:该方法简便、准确、稳定,已实际应用于测定焙烤和油炸食品中丙烯酰胺的含量。

关键词:固相萃取;高效液相色谱-电喷雾离子化串联质谱;焙烤和油炸食品;丙烯酰胺

丙烯酰胺系结构简单的小分子化合物,白色、透明片状晶体,可溶于水、乙醇、乙酸乙酯等,在室温条件下很稳定,但当处于熔点或以上温度、在氧化条件下以及在紫外线的作用下,很容易发生聚合反应,在工业上主要用丙烯腈作为原料合成 [1-3]。研究表明,食品中的丙烯酰胺主要在高碳水化合物、低蛋白质的植物性食物加热烹调过程中形成的,140~180 ℃为其生成的最佳温度。食物在水中烹调时最高温度不 会超过100 ℃,但是,当烘烤或者油炸食品时,水分损失较多,表面温度升高,丙烯酰胺就会大量形成 [4-8]

1994年国际癌症研究机构(international agency for research on cancer,IARC)对丙烯酰胺的致癌性进行了评估,将其列为2A类致癌物 [9-11]。自2002年瑞典科学家首次在烘烤、油炸等食品中检出丙烯酰胺后,其在食品中的污染问题引起了国际社会和各国政府的高度关注 [12-15]。我国居民的饮食文化较为多元化,焙烤、油炸类食品因其种类繁多、味道各异而广受喜爱,人群食用频率较高,摄入量较大 [16-20],但是,目前国内对于丙烯酰胺的监控存在一定的空白。

目前国内外对丙烯酰胺的检测主要有气相色谱法 [21]、高效液相色谱法 [21-22]、气相色谱-质谱联用法 [23-24]和高效液相色谱-串联质谱法 [24-27]。气相色谱法和气相色谱-质谱联用法前处理步骤复杂,需要衍生化;液相色谱法不是确证方法。张琦等 [25]使用液相色谱-质谱对市售的面包、方便面和薯片3 大类样品中丙烯酰胺含量进行了测定;刘红河等 [26]检测了谷类煎炸食品、薯片、膨化食品、月饼、豆制品中丙烯酰胺含量。本实验在总结以上方法的基础上,采用Cleanert SLE固相萃取(solid phase extraction,SPE)柱净化,高效液相色谱-电喷雾离子化串联质谱(high performance liquid chromatographyelectrospray ionization-tandem mass spectrometry,HPLCESI-MS-MS)仪进行测定,内标法定量,针对焙烤和油炸食品建立了一种简便、快捷、准确、稳定的检测方法,适于大批量样品的实时监测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、正己烷、乙酸乙酯(均为色谱纯) 德国Meker公司;硫酸铵(分析纯) 广州化学试剂厂;丙烯酰胺标准品(纯度99.0%)、 13C 3-丙烯酰胺标准品 德国Dr.Ehrenstorfer公司;Cleanert SLE固相萃取柱(14.5 g/60 mL) 博纳艾杰尔公司;0.45 μm水系针筒式微孔滤膜过滤器 上海安谱公司。

1.2 仪器与设备

TSQ Quantum Access高效液相色谱-串联质谱联用仪(ESI源)、Sorvall ST40通用型台式离心机 美国Thermo Fisher Scientific公司;GM200刀式捣磨仪 德国Retsch公司;MMV-1000W分液振荡仪 日本Eyela公司;Laborota 4003旋转蒸发仪 美国Heidolph公司;TruboVapII全自动浓缩仪 美国Caliper公司;Milli-Q超纯水系统 美国Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 前处理样品提取与净化

样品经刀式捣磨仪研磨粉碎,准确称取1.00 g样品置于50 mL离心管中,加入10 μg/mL的 13C 3-丙烯酰胺内标工作溶液10 μL、超纯水10 mL,振摇30 min后,于4 500 r/min离心5 min,转移上清液,并加入硫酸铵15 g,振荡10 min,使其充分溶解,提取液于4 500 r/min离心5 min,取上清液备用。

上清液全部经Cleanert SLE固相萃取柱吸附,用70 mL正己烷淋洗,控制流速为10 mL/min,弃去正己烷淋洗液。用70 mL乙酸乙酯洗脱,控制流速为10 mL/min,收集洗脱溶液,并在45 ℃水浴中减压旋转蒸发至近干,用5 mL乙酸乙酯洗涤蒸发瓶3 次,转移洗涤液至15 mL试管,并加入1.0 mL 0.1%体积分数的甲酸溶液,在45 ℃氮吹浓缩至1.0 mL以下,用0.1%体积分数的甲酸溶液定容至1.0 mL,涡旋振荡,过0.45 μm水相滤膜,待LC-MS-MS测定。

1.3.2 标准曲线的制备

分别称取适量的丙烯酰胺和 13C 3-丙烯酰胺标准品,用甲醇溶解定容于100 mL容量瓶,使丙烯酰胺标准储备液质量浓度为100 μg/mL, 13C 3-丙烯酰胺标准储备液质量浓度为10 μg/mL。将100 μg/mL的丙烯酰胺标准溶液配制为适当质量浓度10、50、100、500、1 000、3 000 ng/mL的标准工作液,标准工作液含内标质量浓度为100 ng/mL。

1.3.3 LC-MS-MS分析条件

色谱柱:Atlantis TMdC 18(150 mm×2.1 mm,5 ☒m);流动相:水(含0.1%体积分数的甲酸):甲醇(9∶1),流速0.2 mL/min;柱温30 ℃;进样量10 μL。

电离方式:ESI(+);喷雾电压:4 000 V;鞘气压力:40 psi;辅助气压力:5 psi;金属毛细管温度:350 ℃;扫描方式:选择反应检测扫描(selected reaction monitoring,SRM)。

分别选取离子对质荷比(m/z)为72.20>55.40和75.20>58.40做为丙烯酰胺及其内标的定量离子,m/z 72.20>44.50做定性离子,以保留时间和各对离子的响应强度比例作为定性标准,内标法定量,计算样品中丙烯酰胺的含量。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的优化

2.1.1 提取溶剂的选择

丙烯酰胺在水中的溶解度很大,可以直接用水作为其提取液。在沉淀蛋白质时,由于Carrez会带入干扰离子,因此选择使用高浓度的硫酸铵溶液做为沉淀试剂。由于焙烤和油炸食品中淀粉含量较高,超声或加热会使样品糊化,所以使用振荡的形式提取。

2.1.2 固相萃取柱的确定

图1 不同的固相萃取柱的萃取效果比较
Fig.1 Comparison of different solid phase extraction columns

在检测方法方面,GC-MS法和LC-MS-MS法两者都可以进行定性定量分析,灵敏度也比较高,但相对来说LC-MS-MS法因不需溴化而显得较简便。不同的LC-MSMS法主要的区别还是在于前处理中的萃取步骤,大部分方法使用的萃取柱填料主要是HLB、C 18和硅藻土,但是通回收验证,HLB、C 18固相萃取柱并不适合丙烯酰胺的净化,而部分硅藻土固相萃取柱,例如Chem Elut柱,对薯片类高含量样品的吸附效果不佳,不能很好的满足回收要求。实验最后选择了大体积的Cleanert SLE固相萃取柱做为替代品,并对比了Oasis HLB、Varian Bond Elut C 18、Cleanert SLE 3 种不同萃取柱的萃取效果,结果见图1。

由图1可见,Varian Bond Elut C 18柱极性偏弱,对丙烯酰胺保留性较差,因此不适用;Oasis HLB柱对极性化合物具有优异的保留能力,但随着丙烯酰胺的含量升高,其回收能力及稳定性下降;Cleanert SLE-SPE柱使用具有极大表面积和极小的表面活性的硅藻土,能够提供一个理想且稳定的液液分配支撑表面,以便使丙烯酰胺被乙酸乙酯从吸附剂中完全萃取出来。

2.2 液相色谱条件优化

丙烯酰胺具有较强的极性,使用水做为流动相时,在普通的反相色谱柱中的保留时间较短, Atlantis TMdC 18色谱柱对极性化合物表现出优异的保留性,且不对疏水性化合物表现出过强的保留性,因此,选择150mm的Atlantis TMdC 18做为色谱柱,并且通过调节流动相比例和流速控制丙烯酰胺的出峰时间(图2)。最终用水-甲醇(9∶1,V/V)做为流动相,并在水相中加入0.1%体积分数的甲酸,提高其电离能力。

图2 丙烯酰胺标准品(A)和 1133C3-丙烯酰胺标准品(BB)色谱图
Fig.2 Chromatograms of acrylamide standard and 13C3-acrylamide standard

2.3 质谱条件优化

通过解析丙烯酰胺的解离方式可以发现,母离子在一定的碰撞能量下可能发生脱氨、脱水、脱乙烯后得到子离子m/z 55、m/z 54、m/z 44。预实验中,子离子m/z 55在碰撞能量为10 eV时子离子m/z 55获得较高的丰度比,而获得子离子m/z 54和m/z 44则需要15 eV和17 eV的碰撞能量,且效果不如m/z 55,故此选择子离子m/z 55作为定量离子,以子离子m/z 44做为定性离子。

2.4 校准曲线和定量限

参考实际测试样品获得的丙烯酰胺含量数值,按1.3.2节配制10~3 000 ng/mL系列质量浓度的校准曲线,按1.3.3节HPLC-MS-MS条件进样,得到丙烯酰胺标准曲线相关系数均大于0.998,表明丙烯酰胺在该范围内的线性关系良好。根据信噪比强度确定丙烯酰胺的检出限(R SN=3)为1.0 ☒g/kg,定量限(R SN>10)为10.0 ☒g/kg。

2.5 方法的回收率与精密度

按照1.3.1节以空白面粉为基质,在0.01、0.1和1.0 mg/kg三个添加水平进行回收率实验,每个水平平行检测6 次,测定后计算加标回收率及相对标准偏差,结果见表1。在3 个添加量(10、100、1 000 μg/kg)的平均回收率为96.8%,相对标准偏差为2.7%。

表1 丙烯酰胺在面粉中的添加回收率
Table1 Recoveries of acrylamide spiked in flour

添加量/(μg/kg)(μg/kg)回收率/%平均回收率/%相对标准偏差/%实测值/ 9.4594.5 10 9.2192.1 9.2792.7 9.3893.8 9.6196.1 9.3593.5 93.781.5 97.3497.3 100 98.5998.6 100.14100.1 97.5797.57 95.5995.59 96.1496.14 97.551.7 997.5499.8 1 000 1 011.87101.9 986.4198.6 990.7899.1 978.6797.9 976.4297.6 99.151.6

2.6 方法的干扰实验

丙烯酰胺作为合成水质净化絮凝剂聚丙烯酰胺的原料单体,聚丙烯酰胺在生产和使用过程中均有微量的游离丙烯酰胺单体释放,因此有必要验证实验用水的干扰性。以实验用水代替样品,加入适量的内标溶液,按1.3.1节进行处理后进样分析,在HPLC-MS-MS色谱图中丙烯酰胺的出峰位置上并未发现杂峰,证明实验用水中并对实验结果造成影响。

2.7 实际样品分析

根据季节特性与超市的销售情况,从超市中购得数批焙烤和油炸食品,按照1.3节建立的分析方法进行检测,结果见表2。

在实际测试的102 个样品中有8 个焙烤类食品测试结果为未检出,油炸类食品中丙烯酰胺的含量远高于焙烤类。此外,即使是同类食品,丙烯酰胺生成与其加工工艺如加工的温度高低、时间长短等有密切关系。长期食用含有大量丙烯酰胺的食品将对人体造成潜在危害,因此,建议有关部门加强对丙烯酰胺进行监控,促使生产企业改善生产工艺,减少加工产品时丙烯酰胺的生成。

表2 常见食品中丙烯酰胺含量的测定结果
Table2 Contents of acrylamide in common foods

注:ND.未检出。

焙烤样品种类油炸饼干月饼面包薯片方便面饼干薯片方便面测试数量2220223641510含量范围/(μg/kg)ND~351.74ND~43.98ND~168.0936.16~1 672.55129.19~614.76375.12~609.24687.21~2 839.53219.78~769.18平均含量/(μg/kg)143.5219.8461.48597.45278.97448.47978.45394.42

3 结 论

本实验建立了焙烤及油炸食品中丙烯酰胺快速、准确、稳定的SPE-HPLC-ESI-MS-MS检测方法。采用水作为提取液,方便简单环保,Cleanert SLE固相萃取柱净化,回收率高,并且有效去除了杂质的干扰,已实际应用于焙烤及油炸食品中丙烯酰胺含量的测定。

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Detection of Acrylamide in Baked and Fried Foods by HPLC-ESI-MS-MS w ith SPE Column Cleanup

LI shuangyi 1, LI Rong 1,*, ZHANG Pengjie 1, QIU Xia 1, LI Xiangli 2
(1. Zhongshan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhongshan 528403, China;2. Zhongshan Torch Polytechnic, Zhongshan 528436, China)

Abs tract:Purpose: To develop a method for the determination of ac rylamide in baked and fried foods using high performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry (HPLC-ESI-MS-MS) with solid phase extraction (SPE) column cleanup. Methods: Acrylamide was extracted from samples with water and the extract was cleaned up by Cleanert SLE-SPE column. The analyte was quantified by an internal standard method. Results: The proposed calibration curve was linear in the range of 0.01-3.00 mg/L with a correlation coefficient greater than 0.998. The limit of detection (LOD) was 1.0 μg/kg. The average recovery at three spiked levels (10, 100 and 1 000 μg/kg) was 96.8% with RSD smaller than 2.7%. Conclusion: The developed method was applied successfully todetermine acrylamide in baked and fried foods samples with the advantages of simplicity, high accuracy and good stability.

Key words:SPE; HPLC-ESI-MS-MS; baked and fried foods; acrylam ide

中图分类号:TS237

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2015)14-0192-04

doi:10.7506/spkx1002-6630-201514037

收稿日期:2015-01-14

基金项目:中山市科技计划项目(2013A 3FC0322);广东省省级科技计划项目(2014A040401011);国家质检总局科技计划项目(2015IK260)

作者简介:李双宜(1984—),男,助理工程师,本科,研究方向为食品添加剂和兽药残留检测技术。E-mail:lishuangyi@zs.gdciq.gov.cn

*通信作者:李蓉(1969—),女,高级工程师,硕士,研究方向为食品安全检测技术。E-mail:lir@zs.gdciq.gov.cn