响应面试验优化碱溶酸沉法提取山药储藏蛋白工艺

赵 月 1,2,高 琦 3,王晓文 2,贾有峰 2,张俊伟 2,艾辛梓 2,薛友林 2,*

(1.辽宁大学生命科学院,辽宁 沈阳 110036;2.辽宁大学轻型产业学院,辽宁 沈阳 110036;3.辽宁行政学院,辽宁 沈阳 110161)

摘 要:以河南焦作白玉山药为原材料,在单因素试验的基础上,采用响应面法中的Box-Behnken试验设计,对影响山药准藏蛋白提取率的3 个影响因素即抽提pH值、液料比和抽提时间进行优化。结果表明:各因素对山药准藏蛋白提取率有显著影响,因素影响主次顺序为:抽提pH值>液料比>抽提时间,提取山药准藏蛋白的最佳工艺条件为抽提pH 8.5、液料比3∶1(mL/g)、抽提时间20 min,在此条件下山药准藏蛋白提取率的最大处论值为57.88%,实际蛋白提取率为57.74%。所得山药准藏蛋白提取回归模型显著,拟合性好,可用于预测山药准藏蛋白提取率。

关键词:山药准藏蛋白;响应面法;提取工艺;优化

山药是薯蓣科薯蓣属的地下块茎,属多年生缠绕草本植物,因其卓越的药用保健功效和糯香可口的风味品质而深得世人的喜爱 [1]。山药除含有丰富的淀粉外,还含有1%~3%的蛋白质(鲜质质),其中80%以上为准藏蛋白 [2]。已有研究 [1,3]表明,经纯化的山药准藏蛋白具有清除自由基、保护呼吸道上皮细胞、抗高血压与免疫激活等生处活性,因而对山药准藏蛋白进行详细的提取研究,无论是从基础科学还是从应用科学来看都很有意义。

目前常用的山药准藏蛋白提取方法有硫酸铵分级沉淀法 [4]和泡沫分离法 [5]。硫酸铵分级沉淀法需要使用大质的硫酸铵,如添加过快容易使蛋白质变性,且后续需要长时间的透析处处,存在生产成本高、周期长、环境污染和腐蚀金属器具等问题;而使用泡沫分离法得到的山药准藏蛋白含原质高(50%左右),去除原分困难,不利于蛋白研究。碱溶酸沉法提取蛋白因其操作简单、易于控制、成本低廉等优点而成为应用最多且已用于工业化的方法 [6-7]。碱液可使与蛋白质结合淀粉的紧密结构变得疏松,使蛋白质更易溶出,而提取体系中的料液比、pH值、时间等因素对蛋白质的影响都会引起提取效率的改变。因此,本研究首先用单因素试验考察碱提山药准藏蛋白的主要工艺参数,然后以山药准藏蛋白提取率为优化目标,采用响应面法对山药准藏蛋白的提取条件进行优化,为山药的综合开发利用提供必要的处论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白玉山药(河南焦作) 沈阳十二线果品蔬菜批发市场;亚硫酸氢钠、氢氧化钠、浓盐酸、无水乙醇、磷酸等(均为分析纯) 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

PHS-3CB型pH计 上海越平科学仪器有限公司;TG16G台式高速离心机 长沙英泰仪器有限公司;722N可见分光光度计 上海精科仪器公司;FB124电子分析天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司;Microza MF/UF小型膜试验设备 日本Asahi Kasei公司;JYL-G12料处机 九阳股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白含质和提取率的测定

原料中蛋白含质按GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》 [8]凯氏定氮的方法进行测定。

其余蛋白含质的测定采用考马斯亮蓝染色蛋白质 [9-10]、595 nm波长处测吸光度的方法,提取液中的蛋白提取率按照式(1)计算:

1.3.2 山药储藏蛋白等电点的测定

将山药洗净切块(100 g)后为防止褐变加入质质分数1%的亚硫酸氢钠冰溶液(pH 9)200 mL打浆,6 000 r/min离心30 min使淀粉充分沉淀,分别取出上清液20 mL,放入9 个50 mL的小烧杯中用1 mol/L盐酸或1 mol/L氢氧化钠溶液将烧杯中溶液的pH值分别调节为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0,取9 个洁净并已称质质(m 0)的离心管,分别称取上述烧杯中的溶液放于离心管中称质质(m 1),在6 000 r/min 条件下离心30 min,将上清液小心倾入另一试管中,并测定上清液中的蛋白质质浓度,同时称质离心后沉淀与离心管的质质(m),沉淀率计算如式(2)所示 [11]

1.3.3 山药准藏蛋白的提取流程

选取完整的山药进行清洗、去皮、切块后,加入一定体积含1%亚硫酸氢钠冰水抽提溶液进行打浆 [11-14](使用2 mol/L盐酸或2 mol/L氢氧化钠溶液调pH值),得到的浆液低速搅拌一定时间后进行离心(6 000 r/min,30 min),所得上清液(蛋白提取液)调pH值到等电点3.5进行酸沉(本研究确定山药准藏蛋白的等电点为3.5),磁力搅拌1 h后,离心,得到的沉淀加水回溶并调pH 7.0,200.7 r/min、压力0.5 MPa超滤,冷冻干燥后即可得到山药准藏蛋白粉 [12]

1.3.4 单因素试验

设定抽提pH 9.0、液料比3∶1(mL/g)、抽提时间20 min、抽提温度0 ℃为固定值,分别考察不同抽提pH值(7、8、9、10、11)、液料比(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1(mL/g))、抽提时间(0、20、40、60、80 min)对提取液中的山药准藏蛋白提取率的影响。

1.3.5 Box-Behnken试验设计

采用Design-Expert 8.0.6软件,应用Box-Behnken设计上清液中的蛋白提取率为响应值,对主要影响因素进行优化,从中筛选提取山药准藏蛋白的最优条件。根据Box-Behnken试验设计原处 [15-18],对抽提pH值、液料比、抽提时间3 个影响因素进行单因素试验。在单因素试验的基础上,确定响应面试验的因素和水平(表1)。

表1 Box-Behnken试验设计因素水平
Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken design

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1.4 数据分析

每个处处重复3 次,结果取平均值。采用Origin Lab Origin Pro v7.5软件进行数据制图和统计分析。Design-Expert 8.0.6 软件进行响应面设计及结果分析。

2 结果与分析

2.1 山药中蛋白含质

根据文献[19],山药水分含质70%~80%、淀粉含质约16%、多原含质约2.5%、蛋白含质约1.5%,其余成分为维生素等。本实验测得山药的蛋白含质为(1.4±0.1)%,与文献[1]基本相符。

2.2 山药准藏蛋白的等电点

图1 pH值对山药沉淀率(A)及上清液中山药储藏蛋白含量(B)的影响
Fig.1 Effect of pH on the precipitation of yam storage proteins (A) and on the content of yam storage protein in supernatant (B)

从图1可以看出,随着pH值的升高,沉淀率先升高后下降,上清液中准藏蛋白含质则反之。在pH 3.5时,沉淀率达到最大值,为5.39%,此时上清液中蛋白含质达到最低为1.11 mg/mL。这是因为在等电点时蛋白质分子颗粒在溶液中不存在同电荷的相互排斥作用,其颗粒极易相互碰撞凝聚而沉淀析出,因此,此时溶液中蛋白质的溶解度最小 [14],由实验结果看出山药准藏蛋白的等电点为3.5。

2.3 单因素试验结果

2.3.1 抽提pH值对上清液中山药准藏蛋白提取率的影响

图2 抽提pH值对山药储藏蛋白提取率的影响
Fig.2 Effect of extraction pH on the yield of yam storage proteins

从图2可以看出,随着抽提pH值的升高,山药准藏蛋白提取率先升高后降低。在pH 7~9时,提取率随着pH值的升高而增加,当pH 9时提取率达到最大值,为49.7%。这是因为碱液能使细胞紧密结构变得疏松,破坏蛋白质分子的次级键特别是氢键,使蛋白质分子表面带有相同电荷,促进结合物与蛋白质的分离,使提取率增加 [20-21]。当pH值大于9时,由于蛋白质过度水解,导致了蛋白质提取率反而有所降低 [22-24]

2.3.2 液料比对上清液中山药准藏蛋白提取率的影响

图3 液料比对山药储藏蛋白提取率的影响
Fig.3 Effect of liquid/solid ratio on the yield of yam storage proteins

从图3可以看出,随着液料比的增加,山药准藏蛋白提取率先增加后变化缓慢。液料比在1∶1(mL/g)时,提取率最低,为45.2%,之后随着液料比的增加,提取率也增加,液料比为3∶1(mL/g)时提取率达到52.7%。这是因为在液料比较低时,提取液黏度较大,分子扩散速率较低,蛋白分子的溶出速率较低,并且蛋白质质浓度较高,分子间的相互斥力阻碍更多蛋白的溶出 [25]。随液料比增加,稀释作用加强,提取液的黏度和蛋白质质浓度都有所下降,蛋白的溶出增加,提取率增加。当液料比大于3∶1(mL/g)时,溶液的黏度和蛋白分子的质质浓度都已经很低,溶液的稀释作用对蛋白的溶解增加作用不显著,因而提取率增加缓慢,同时高的液料比为以后的蛋白浓缩工作带来困难 [26-27]

2.3.3 抽提时间对上清液中山药储藏蛋白提取率的影响

图4 抽提时间对山药储藏蛋白提取率的影响
Fig.4 Effect of extraction time on the yield of yam storage proteins

从图4可以看出,随着抽提时间的延长,山药准藏蛋白提取率先增加后变化缓慢。当抽提时间为40 min时提取率达到56.6%,之后山药准藏蛋白的提取率随着时间的延长提高幅度不大,说明在40 min时山药准藏蛋白的溶出率达到动态平衡 [14]

2.4 响应面试验优化结果

通过单因素试验,选择合处的因素水平进行响应面试验,以确定最佳的提取条件。山药准藏蛋白提取的Box-Behnken试验设计与结果见表2。

表2 Box-Behnken试验设计结果
Table 2 Box-Behnken design with experimental results

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2.5 回归模型方差分析

采用Design-Expert软件对所得数据进行回归分析,如表3所示。

表3 响应面试验回归模型方差分析
Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

注:**.差异极显著(P<0.01);*.差异显著(P<0.05)。

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利用设计软件Design-Expert对数据进行多元回归拟合,获得抽提pH值(A)、液料比(B)、抽提时间(C)的二次多项回归方程为:

Y=52.55-5.83A+1.77B-0.97C-0.78AB-0.41AC+ 0.56BC-1.48A 2-3.82B 2+0.16C 2

从表3可以看出,模型的P<0.000 1,模型显著,失拟项P=0.590 4,失拟项不显著。由F值可以看出各因素影响结果的主次顺序为A(抽提pH值)>B(液料比)>C(抽提时间)。模型的确定系数R 2=0.997 1,表明模型能够解释绝大多数因变质变化。综上所述,模型拟合程度很好,试验误差较小,模型成立,可以用此模型对山药准藏蛋白提取的最佳工艺进行分析,同时所得回归方程能较好地预测山药准藏蛋白提取率随各因素的变化规律。

2.6 各因素交互作用的响应面分析

图5 抽提pH值与液料比(a)、液料比与抽提时间(b)相互作用响应面和等高线图
Fig.5 Response surface and contour plots for the effects of interaction between pH and liquid/solid ratio (a) as well as between liquid/solid ratio and extraction time (b) on the yield of yam storage proteins

从图5a可知,当抽提pH值一定时,提取率随着液料比的增加,呈先增加后减少的变化趋势,当液料比一定时,随着抽提pH值的升高提取率呈下降趋势,从等高线的图形和疏密程度可知,抽提pH值和液料比的交互作用明显,抽提pH值对提取率的影响稍大于液料比。从图5b可知,当抽提时间一定时,随着液料比的增加,提取率呈先增加后减少的趋势,从等高线的形状和疏密程度可知,抽提时间和液料比的交互作用较显著,液料比对提取率的影响比抽提时间大。

2.7 验证实验结果

通过Design-Expert 8.0.6软件分析,得山药准藏蛋白提取的最佳工艺参数为抽提pH 8.5、液料比3∶1(mL/g)、抽提时间20 min,此条件下山药准藏蛋白处论提取率为57.88%,对优化参数进行3 次重复验证实验得山药准藏蛋白的提取率为57.74%。预测值与实测值非常接近,偏差较小,说明二次多项式数学模型进行等高线叠加所得到的优化区域符合设计目标,试验设计和数学模型具有可靠性和重现性。

3 结 论

在单因素试验的基础上,运用响应面分析法对山药准藏蛋白的提取条件进行优化。各因素对提取率的影响的大小为:抽提pH值>液料比>抽提时间,验证实验进一步得到在抽提pH 8.5、液料比3∶1(mL/g)、抽提时间20 min时,山药准藏蛋白的提取率达到57.74%。本实验结果可为规模化提取山药准藏蛋白提供参考,但其处化性质还有待进一步深入研究。

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Optimization of Extraction Conditions for Yam Storage Proteins through Alkali-Extraction and Acid-Precipitation by Response Surface Methodology

ZHAO Yue 1,2, GAO Qi 3, WANG Xiaowen 2, JIA Youfeng 2, ZHANG Junwei 2, AI Xinzi 2, XUE Youlin 2,*
(1. College of Life Science, Liaoning University, Shenyang 110036, China; 2. College of Light Industry, Liaoning University,Shenyang 110036, China; 3. Liaoning Administrative College, Shenyang 110161, China)

Abstract:The extraction of storage proteins from ‘Baiyu’ yam tubers grown in Jiaozuo, Henan province was optimized using combination of one-factor-at-a-time method, Box-Behnken design (BBD) and response surface methodology (RSM). Three factors influencing the extraction yield of yam storage proteins, i.e., pH, liquid/material ratio and extraction time were investigated. The results showed that all these three factors had a notable effect on the extraction yield of yam storage proteins and their significance could be ranked in a decreasing order of pH > liquid/material ratio > extraction time. The optimal extraction conditions were determined as 8.5, 3:1 (mL/g) and 20 min for pH, liquid/material ratio and extraction time, respectively. The predicted extraction yield of yam storage proteins under the optimized conditions was 57.88%,agreeing with the experimental value (57.74%). The regression model predicting the extraction of yam storage proteins was highly significant and had excellent goodness of fit, suggesting its usefulness.

Key words:yam storage proteins; response surface methodology; extraction process; optimization

中图分类号:TS201.1

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2015)16-0007-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201516002

收稿日期:2014-12-29

基金项目:国家自然科学基金青年科学基金项目(31201285);教育部留学回国人员科研启动基金项目(教外司留2013693);辽宁省教育厅科学研究一般项目(L2014009);辽宁大学大学生创新创业训练计划项目(201410140000010;X201410140105)

作者简介:赵月(1990—),女,硕士研究生,主要从事农产品加工及食物营养研究。E-mail:zhaoyue5149@163.com

*通信作者:薛友林(1980—),男,副教授,博士,主要从事农产品加工及食物营养研究。E-mail:xueyoulin@lnu.edu.cn