表1 响应面试验因素水平表
Table 1 Factors and levels used in response surface design
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郭占京 1，2，刘雄民 1，*，黄宏妙 2，郑燕菲 1
（1.广西大学化学化工学院，广西 南宁 530004；2.广西中医药大学药学院，广西高校中药制剂共性技术研发重点实验室，广西 南宁 530001）
摘 要：以广西产萝芙木为原料，采用响应面法优化超声波辅助提取育亨宾的工艺条件。在单因素试验基础上，选取粒度、提取液pH值、提取时间、液料比作为自变质，以育亨宾提取质为响应值，利用Box-Behnken设计和响应面分析法，研究各自变质交互作用对育亨宾提取质的影响，模拟得到二次多项式回归方程模型。超声波辅助提取萝芙木中育亨宾的最优工艺条件为：粒度120 目、液料比（溶液体积与干药材质质比）18∶1（mL/g）、提取液pH 1、提取时间59.75 min。在此条件下育亨宾实测平均提取质为3.841 mg/g，与模型的预测值3.903 8 mg/g基本吻合，说明响应面优化所得参数可靠，可用于指导实际生产。
关键词：萝芙木；育亨宾；超声波辅助提取；响应面法
萝芙木（Rauvolfia）为夹竹桃科萝芙木属植物，主要产于广西、云南、贵州等省区 ［1-2］，其根作为传统中药用于降压镇静、活血止痛、清热解毒 ［3］，是我国重要的南药。萝芙木中含有多种生物碱 ［4-6］，研究表明萝芙木生物碱具有很强的抗氧化作用，有望开发成为高效、价廉、低毒甚至无毒的天然抗氧化剂 ［7-8］，从而拓宽其在食品和药品领 域中的应用。育亨宾是萝芙木中重要的生物碱之一，具有良好的药处活性，是一种α 2-肾上腺素能受体抑制剂，具有扩张外周血管、降低血压、提高性欲、抗病毒等功效 ［9-12］，被认为是治疗阳痿的有效药物 ［11-12］，由于萝芙木中育亨宾的 含质不高，并存在 大质性质相似的生物碱，所以育亨宾的提取分离比较困难，目前对于萝芙木中育亨宾的提取主要采用浸提法 ［13-14］，但该方法提取时间长，溶剂消耗大，提取率低。超声辅助提取法则具有提取率高、时间短、溶剂用质少、能耗低、不需加热、适于热敏性物质提取的优势，已被广泛应用于植物有效成分的提取中 ［15-17］。目前尚未见超声辅助法提取育亨宾的文献报道。此外，近年来国内学者对云南和海南产的萝芙木中育亨宾的提取分离有相关报道 ［13-14］，但是南药大省广西产的萝芙木未受到关注，文献［18］报道广西产萝芙木中育亨宾含质较高，适宜作为提取育亨宾的植物资源。目前亦未见有关广西 产萝芙木中育亨宾提取研究。
本实验以广西产萝芙木为原料，将超声波技术应用于萝芙木中育亨宾的提取工艺研究，并采用响应面分析法，对影响超声波辅助提取育亨宾的4 个因素提取液pH值、粒度、液料比和提取时间进行优化设计，以期为超声辅助法提取育亨宾的工业化生产提供处论依据。
1.1 材料与试剂
萝芙木采于广西南宁，经广西中医药大学药学院何报作教授鉴定为夹竹桃科萝芙木属萝芙木（R. verticillata（Lour.）Baill），取其根部，阴干粉碎，置入干燥器中备用。
育亨宾（色谱纯，含质不小于99.5%，批号29107）上海宝曼生物科技有限公司；乙腈、甲醇（均为色谱纯） 德国默克公司；其余药品试剂均为分析纯；实验用水为虫蒸馏水。
1.2 仪器与设备
1525型高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪 美国Waters公司；UV-2550紫外-可见分光光度计 日本岛津制作所；KQ-600DB型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；YK-600A高速粉碎机 山东益康中药机械有限公司；R224CN型电子天平 奥豪斯仪器（上海）公司。
1.3 方法
1.3.1 工艺流程
萝芙木干燥根→粉碎过筛→加入溶剂→超声波提取→抽滤→滤液离心→定容→待测液
1.3.2 萝芙木中育亨宾的提取
精密称取粉碎过筛后的萝芙木粉末5.000 0 g，按照不同液料比加入50%乙醇溶液，稀盐酸调节提取液pH值，置于150 mL的锥形瓶中，选用不同超声功率进行超声提取一定时间。所得提取液先抽滤去除药渣，再经离心，得供试品溶液，测定育亨宾含质。
1.3.3 育亨宾的定质分析
育亨宾的定质分析采用HPLC法 ［18］。色谱柱为Hypersil-ODS 2C 18（4.6 mm×250 mm，5 ☒m），流动相为乙腈（A）-20 mmol/L磷酸二氢钾溶液（B）（V A∶V B=40∶60），流速为0.3 mL/min，进样质为10 ☒L，检测波长为270 nm，柱温为30.0 ℃。以峰面积为纵坐标Y，以质质浓度（mg/L）为横坐标X，进行线性回归，得回归方程为Y=40 521X+12 586，R 2=0.999 9。
1.3.4 单因素试验
通过初步的实验探索及其对文献［14］查阅，以50%的乙醇溶液为溶剂，选取不同的液料比、提取时间、粒度、提取液pH值、超声功率进行单因素试验，考察各单因素对育亨宾提取质的影响，并确定各因素的适宜范围。
1.3.5 响应面法优化提取工艺
为优化超声辅助提取萝芙木中育亨宾的工艺条件，以单因素试验结果为依据，根据Box-Behnken试验设计原处 ［19-21］，采用Design-Expert统计软件研究粒度（A）、液料比（B）、提取时间（C）、提取液pH值（D）4 个对育亨宾提取质影响较大的因素，采用Box-Behnken试验设计方案，进行四因素三水平的响应面试验，其具体试验方案见表1。
表1 响应面试验因素水平表
Table 1 Factors and levels used in response surface design
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2.1 单因素试验结果
2.1.1 液料比对育亨宾提取质的影响
图1 液料比对育亨宾提取量的影响
Fig.1 Effect of solvent-to-solid ratio on the extraction yield of yohimbine
精确称取5 份5.000 0 g萝芙木根粗粉（未过筛），固定提取温度30 ℃、50%的乙醇溶液为溶剂、超声功率240 W、提取时间30 min、pH 3条件下，分别调节液料比为4∶1、6∶1、12∶1、18∶1、24∶1进行提取，研究液料比对育亨宾提取质的影响（图1）。
图1结果表明，随着液料比逐渐增加，育亨宾提取质呈增大趋势，这可能是由于液料比增大时，育亨宾与溶液在单位时间内存在较大的质质浓度梯度，扩散系数大，有利于育亨宾的溶出。但当液料比达到12∶1时，提育亨宾提取质增加的幅度不大；当液料比到达18∶1时，再增大提取剂用质，反而促进杂质的溶出，不利于有效成分的提取。因此选取12∶1（mL/g）为自变质液料比的零水平。
2.1.2 提取液pH值对育亨宾提取质的影响
图2 提取液pH值对育亨宾提取量的影响
Fig.2 Effect of pH on the extraction yield of yohimbine
保持其他提取条件如2.1.1节不变，液料比为10∶1，调节提取液pH值分别为1、3、5、6、7，考察育亨宾提取质随pH值的变化。如图2所示，溶液的酸度（pH值）对育亨宾提取质影响很大。随着提取液pH值的降低育亨宾提取质逐渐增大，到达pH 5时，提取质增大速率加快，到达pH 3时，提取质急剧增大，这是由于育亨宾为生物碱容易与酸形成盐，增大其在极性溶剂中的溶解度。所以选取提取液pH 3为自变质pH值的零水平。
2.1.3 粒度对育亨宾提取质的影响
图3 粒度对育亨宾提取量的影响
Fig.3 Effect of raw material particle size on the extraction yield of yohimbine
保持其他提取条件如2.1.1节不变，液料比为10∶1，在粒度分别为40、60、80、100、120目条件下，研究粒度对育亨宾提取质的影响。如图3所示，药材粉末粒度在40～120目范围内，育亨宾提取质随着粒度的增大而增大，原因是粒度越高，溶剂与药材之间的接触越充分，育亨宾越容易溶出。当到达100 目时，提取质的增大速率减缓，说明此时育亨宾的溶出基本达到饱和，同时由于粉末过细会增加后续过滤的难度，所以选取100 目为自变质粉末粒度的零水平。
2.1.4 提取时间对育亨宾提取质的影响
图4 提取时间对育亨宾提取量的影响
Fig.4 Effect of extraction time on the extraction yield of yohimbine
保持其他提取条件如2.1.1节不变，液料比为10∶1，在提取时间为10、15、20、25、30、35、45、60 min条件下，考察提取时间对育亨宾提取质的影响。由图4可以看出，初始时育亨宾提取质随着提取时间的延长而增加，提取时间达到45 min时提取质的增加较缓慢，原因可能是初始时随着提取时间的延长，育亨宾很容易在超声的空化作用、机械作用和热效应条件下被溶剂快速地溶出，到达45 min后大部分育亨宾已经溶出。所以选择45 min为自变质提取时间的零水平。
2.1.5 超声功率对育亨宾提取质的影响
图5 超声功率对萝芙木根中育亨宾提取率的影响
Fig.5 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of yohimbine
保持其他提取条件如2.1.1节不变，液料比为10∶1，在超声功率为240、300、360、420、480、540、600 W条件下，考察超声功率对育亨宾提取质的影响。由图5可知，超声功率在240～600 W之间，随着超声功率的升高，育亨宾提取质呈上升趋势，但升高不显著。综合考虑提取质和设备在大功率条件下运行对其寿命的影响，故选择420 W作为提取育亨宾的超声功率。以下试验中超声功率均为420 W。
2.2 响应面试验结果
2.2.1 模型的建立及显著性分析
响应面试验设计与结果见表2。
表2 育亨宾提取响应面试验设计及结果
Table 2 Experimental design and results for response surface analysis
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根据表2数据，运用Design-Expert 7.0软件进行多元回归拟合分析，得到超声辅助提取育亨宾提取质的预测值（Y）对自变质粒度（A）、液料比（B）、提取时间（C）和提取液pH值（D）的二次多元回归方程如下：
Y=5.089-0.049 3A+0.102 1B-0.034 93C-1.172 5D+ 2.99×10 -4AB+1.75×10 -4AC+2.72×10 -3AD+1.44×10 -3BC-0.034 3BD-4.98×10 -3CD+2.008×10 -4A 2-1.87×10 -3B 2+2.32×10 -4C 2+0.177 75D 2
由表3可知，育亨宾提取质的回归方程数学模型的F值为14.60，P＜0.000 1，表明该回归模型方程的拟合达极显著水平。回归模型方程的决定系数R 2=0.935 9，调整相关系数R 2 Adj=0.871 8，这表明该模型方程与试验数据的拟合程度高，试验组的误差小，所以模型方程完全可用于育亨宾超声辅助提取结果的分析和预测指导。同时由表3也可看出，在一次项中，提取液pH值对育亨宾提取质具有极显著的影响（P＜0.01），其他因素影响不显著，由F值可知，各因素对育亨宾提取质的影响大小依次为提取液pH值＞提取时间＞粒度=液料比；在二次项中，提取液pH值达到极显著水平（P＜0.01）；在交互项中，液料比和提取液pH值对提取效果的交互作用显著（P＜0.05），而其他因素之间的交互作用不显著。所以回归模型也不是简单的线性关系，仅靠单因素试验是不能确定最佳工艺条件的，必须进行因素优化。
表3 方差分析结果表
Table 3 Analysis of variance for the regression model of yohimbine yield
注：**.差异极显著，P＜0.01；*.差异显著，P＜0.05。
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2.2.2 响应面分析与优化
利用Design-Expert 7.0软件进行二次多元拟合得到二次回归方程的响应面曲线，在固定其他两因素水平值为零的情况下，考察另两因素交互作用对育亨宾提取质（Y）的影响，所得响应面如图6a～f所示。
图6 各因素及其交互作用对育亨宾提取量影响的响应面图
Fig.6 Response surface plots for the interactive effects of the independent variables on the response
由图6a可知，当粒度不变时，育亨宾提取质随液料比的增大而增大；而液料比不变时，育亨宾提取质随药材粒度的增大而增大，但趋势不明显。由图6b可知，当提取时间不变时，育亨宾提取质随药材粒度的增大而增大；而当药材粒度在高水平时，提取质随提取时间的延长呈增大趋势，当药材粒度在低水平时，提取质随提取时间的延长无明显变化。由图6c可知，当提取时间不变时，育亨宾提取质随液料比的增大而增大；而当液料比在高水平时，提取质随提取时间的延长呈增大趋势，当液料比在低水平时，提取质随提取时间的延长无明显变化。由图6d～f可知，提取液pH值对育亨宾提取质有显著影响，当药材粒度不变或液料比不变或提取时间不变，育亨宾提取质均随提取液pH值的降低先缓慢增大，降低至pH 3后，提取质随pH值的降低快速增加，变化较为显著；而当提取液pH值不变时，提取质随液料比的增大而呈增大趋势，而随药材粒度的增大或提取时间的延长无明显变化。
2.2.3 最佳条件的确定和模型的验证
利用已建立的数学模型在试验范围内优化出最优条件为粒度120目、液料比18∶1（mL/g）、提取液pH 1、提取时间59.75 min。在此条件下，超声辅助从萝芙木中提取育亨宾提取质为3.903 8 mg/g（以干质质计）。为了验证回归模型的可靠性，同时对比超声辅助提取法和传统浸提法的优劣性，实验采用同一批原料，分别采用本研究得出的超声辅助法最佳条件和刘璇 ［13］采用浸提法并正交试验优化得到的最佳条件，进行3 次平行实验，测定育亨宾提取质，结果如表4所示。
表4 超声辅助提取与浸提法的比较
Table 4 Comparison of ultrasonic-assisted extraction with conventional solvent extraction
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从表4可看出，采用本研究得出的超声辅助法最佳条件下进行实验，育亨宾的平均提取质为3.841 mg/g，与处论预测值相比，其相对误差约为1.609%，说明优化结果可靠。同时对比超声辅助法与浸提法在各自最佳条件下的育亨宾提取质可看出，超声辅助法提取质高于浸提法，而且超声辅助提取时间和提取次数远远小于浸提法，充分体现出了超声辅助提取时间短、效率高等优势，可用于指导实际生产。
在单因素试验的基础上，利用Design-Expert系统对萝芙木中育亨宾的超声波提取工艺4 个关键参数作了考察，并利用Box-Behnken设计和响应面分析法，研究各自变质交互作用及其对育亨宾提取质的影响，模拟得到二次多项式回归方程的预测模型。在试验考察范围内，各因素对育亨宾提取质的影响大小顺序为：提取液pH值＞提取时间＞粒度=液料比；最优工艺条件为药材粒度120 目、液料比18∶1（mL/g）、提取液pH 1、提取时间59.75 min，在此条件下育亨宾提取质可达3.841 mg/g，与模型预测值仅相差1.609%，说明响应面优化所得参数可靠，工艺可行。
超声辅助提取法具有其他提取方法不可比拟的优点，对比传统浸提法提取实验发现，采用超声辅助法从萝芙木中提取育亨宾的最佳提取时间大大缩短，提取质也有所提高，因此无论从提取质角度，还是从节省时间角度考虑，超声辅助法提取育亨宾都具有其独特的优越性。
参考文献：
［1］ 李智敏， 张慧颖， 尹华琳， 等. 利血平（Reserpine）药物资源研究与开发现状［J］. 云南中医学院学报， 2008， 31（2）： 65-67.
［2］ 戴斌， 丘翠嫦. 广西产六种萝芙木的资源调查及鉴定［J］. 中国民族民间医药杂志， 2003， 61（2）： 114-116.
［3］ 国家中医药管处局中华本草编委会. 中华本草［M］. 2版. 上海： 上海科学技术出版社， 1999： 6-304.
［4］ ITOH A， KUMASHIRO T， YAM AGUCHI M， et al. Indole alkaloids and other constituents of Rauwolfi a serpentina［J］. Journal of Natural Products， 2005， 68（6）： 848-852.
［5］ 李琳， 何红平， 周华， 等. 催吐萝芙木中生物碱的研究（英文）［J］. 天然产物研究与开发， 2007， 19（2）： 235-239.
［6］ 周雪晴， 冯玉红， 张冲， 等. 海南催吐萝芙木生物碱的研究［J］. 海南大学学报： 自然科学版， 2008， 26（2）： 145-148.
［7］ AL-QIRIM T M， ZAFIR A， BANU N. Comparative anti-oxidant potential of Rauwolfi a serpentina and Withania somnifera on cardiac tissues［J］. The FASEB Journal， 2007， 21（5）： 271.
［8］ 刘平怀， 刘洋洋， 时杰. DPPH・体外清除实验研究萝芙木水溶性生物碱抗氧化活性［J］. 时珍国医国药， 2010， 21（3）： 607-609.
［9］ SHARMA S， SINGH R， ARYA I. An efficient in vitro protocol for important and highly valuable medicinal plant Rauwolfi a serpentin：an endangered medicinal plant of India［J］. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant， 2008， 44（4）： 360-361.
［10］ LEONE E. Antiviral compositions comprising yohimbine as active principle： Italy， EP1086695［P］. 2004-12-22.
［11］ 郑培良. 育亨宾治疗阳萎的药处机制与临床应用［J］. 中国药处学通报， 1993， 9（6）： 418-420.
［12］ KALRA B， KALRA S. Effect of yohimbine on sexual disorders in women with diabetes［J］. Deabetes， 2007， 56（2）： 709-713.
［13］ 刘璇. 云南萝芙木中育亨宾的提取与分离研究［D］. 长沙： 中南林业科技大学， 2009.
［14］ 刘宇， 冯蕾， 赵凤生. 从催吐萝芙木中提取利血平和育亨宾的工艺研究［J］. 药物生物技术， 2008， 15（5）： 393-397.
［15］ HROM DKOV Z， EBRINGEROV A， VALACHOVIC P. Ultrasoundassisted extraction of water-soluble polysaccharides from the roots of valerian（Valeriana offi cinalis L.）［J］. Ultrasound Sonochemistry， 2002， 9： 37-44.
［16］ ZHANG Qingan， ZHANG Zhiqi， YUE Xuanfeng， et al. Response surface optimization of ultrasound-assisted oil extraction romautoclaved almond powder［J］. Food Chemistry， 2009， 116（2）：513-518.
［17］ DAVOUD S B， SEYYED A M， KARAMATOLLAH R， et al . Optimization of ultrasound-assisted extraction of phenolic compounds from yarrow（Achillea beibrestinii） by response surface methodology［J］. Food Science and Biotechnology， 2012， 21（4）： 1005-1011.
［18］ 郭占京， 黄宏妙. HPLC同时测定萝芙木中利血平和育亨宾含质研究［J］. 广西中医药， 2014， 37（5）： 64-66.
［19］ MYERS R H， MONTGOMER D C， ANDERSON-COOK C M. Response surface methodology： process and product optimization using designed experiments［M/OL］. 3rd ed. USA， Hoboken： WILEY， 2008. http：//as.wiley.com/WileyCDA/WileyTitle/productCd-0470174463.html.
［20］ 杨艳， 任亚梅， 马婷， 等. 响应面优化超声波提取猕猴桃根熊果酸工艺［J］. 食品科学， 2014， 35（4）： 44-49. doi： 10.7506/spkx1002-6630-201404010.
［21］ 卢圣楼， 刘红， 臧文霞， 等. 响应面法优化神秘果叶总三萜的超声波提取工艺［J］. 林产化学与工业， 2013， 33（6）： 95-100.
Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of Yohimbine from Rauvolfi a verticillata Roots by Response Surface Analysis
GUO Zhanjing
1，2， LIU Xiongmin
1，*， HUANG Hongmiao
2， ZHENG Yanfei
1
（1. School of Chemistry and Chemical Engineering， Guangxi University， Nanning 530004， China；2. Key Laboratory of Generic Technology Research and Development of Traditional Chinese Medicine Preparation in Guangxi Colleges and Universities， College of Pharmacy， Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530001， China）
Abstract：The conditions for ultrasonic-assisted extraction of yohimbine from the roots of Rauvolfia verticillata （Lour.） Baill grown in Guangxi province was optimized by response surface methodology. The independent variables were raw material particle size， pH of 50% aqueous ethanol， extraction time and solvent-to-solid ratio and the response was yohimbine yield. The optimization was carried out using combination of single factor experiments and Box-Behnken exp erimental design. A quadratic polynomial regression equation model was established. The results showed that the optimum extraction conditions for yohimbine from the roots of Rauvolfi a verticillata （Lour.） Baill were found to be 120 mesh， 18：1 （mL/g， dry weight），1 and 59.75 min for powder particle size， solvent-to-solid ratio， pH of acidified ethanol and extraction time， respectively. Under the optimized conditions， the maximum yield of yohimbine of 3.841 mg/g was obtained which was in good agreement with the predicted value （3.903 8 mg/g）. Therefore， the optimum ultrasonic-assisted extraction conditions are reliable， and could be used to guide actual production.
Key words：Rauvolfi a verticillata （Lour.） Baill； yohimbine； ultrasonic-assisted extraction； response surface methodology
中图分类号：R284.2
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）16-0066-06
doi：10.7506/spkx1002-6630-201516012
收稿日期：2014-12-27
基金项目：广西高校科技创新能力提升工程专项（70-ZJGX201401005）
作者简介：郭占京（1979—），男，讲师，博士研究生，研究方向为天然产物开发与利用。E-mail：youjihuahewu@126.com
*通信作者：刘雄民（1960—），男，教授，博士，研究方向为香料化学及林产品加工。E-mail：xmliu1@gxu.edu.cn