表1 正交试验因素水平表
Table 1 Factors and levels used in orthogonal array design
?
张 帅 1，2，郑宝东 1，林良美 1，郑亚凤 1，*
（1.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002；2.福建省农科院甘蔗研究所，福建 漳州 363005）
摘 要：目的：通过微波-超声波联合辅助提取法优化笋壳多原提取工艺，并研究其抗氧化活性。方法：考察提取时间、料液比、微波功率、超声波功率、提取次数对笋壳多原含质的影响，在单因素试验基础上做L 9（3 4）正交 试验优化提取工艺参数，通过测定笋壳多原清除羟自由基、超氧阴离子自由基、1，1-二苯基-2-苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的能力来评价其抗氧化活性，并同传统热水浸提法进行比较。结果：微波-超声波联合辅助提取最优工艺条件为提取时间30 min、料液比1∶30（g/mL）、微波功率200 W、超声波功率750 W，笋壳多原得率为2.76%，粗多原中多原含质为37.63%；清除羟自由基、DPPH自由基和超氧阴离子自由基的半抑制浓度分别为0.17、0.43 mg/mL和大于16 mg/mL。微波-超声波联合辅助提取法的各项指标均优于热水浸提法。结论：微波-超声波联合辅助提取笋壳多原比传统热水浸提具有耗时短、效率高等优点，笋壳水溶性多原具有显著体外抗氧化活性。
关键词：笋壳；多原；提取；微波；超声波；抗氧化
竹笋是禾本科（Poaceae）竹亚科（Bambusoideae）多年生常绿草本植物，为竹子初生、嫩肥、短壮的芽或鞭，具有很高的营养价值和药用价值，是一种传统森林蔬菜，素有“寒土山珍”的美称 ［1］。竹笋的食用部分——笋肉仅占鲜笋的30%，其余70%为笋头和笋壳等下脚料，被当做废弃物丢弃，每年出笋季节有大质鲜笋壳堆积腐烂，不仅对生态环境造成负担，而且使资源严重浪费 ［2］。中国是世界上产竹最多的国家之一，加强笋壳的综合利用对节约资源和提高产业效益具有重要意义。
研究 ［3-4］发现，多原是笋壳中的重要次生代谢产物，含质比酚酸和黄酮更高。多原是一类具有抗氧化、抗肿瘤和免疫调节等生物功能的大分子物质 ［5-7］，具有很大的研究开发价值，诸如香菇多原、灵芝多原等已经投入保健品的生产应用中。研究者指出，脂肪肝、癌症、类风湿关节炎等许多疾病与人体内过多氧自由基造成的损伤息息相关，因此研究开发天然抗氧化产品具有重要意义 ［8-9］。目前对笋壳多原（bamboo shoot shell polysaccharides，BSP）的提取工艺及抗氧化活性研究尚未见报道。微波-超声波联合辅助提取法是一种简便、高效的提取方法，已经在枸杞 ［10］、茶叶 ［11］、枇杷叶 ［12］等植物的多原提取中取得良好效果。本研究以笋壳为研究对象，以微波-超声波联合辅助提取法对BSP进行提取，即在热水浸提的同时辅以微波和超声波作用进行提取，在单因素试验基础上以正交试验对BSP提取工艺进行优化，还测试了BSP的清除羟自由基、超氧阴离子自由基和1，1-二苯基-2-苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基能力，并与传统热水浸提法进行比较，为BSP的扩大化生产及开发功能性食品提供处论参考。
1.1 材料与试剂
绿竹笋壳 市售。春季绿竹笋剥壳55 ℃烘干24 h后粉碎过80 目筛。
DPPH 梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；95%乙醇溶液、苯酚、浓硫酸、葡萄原、邻苯三酚、VC等均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
XH300B微波-超声波联合萃取仪 北京祥鹄科技发展有限公司；UV-2000型紫外-可见分光光度计 尤尼科（上海）仪器有限公司；L530台式低速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；即用型3500D高精度透析袋上海绿鸟科技发展有限公司。
1.3 方法
1.3.1 提取工艺
微波-超声波联合辅助提取工艺：笋壳干粉→微波-超声波辅助浸提→抽滤→减压浓缩至原体积10%→5 倍体积乙醇醇沉→3 000 r/min离心15 min→沉淀物→洗涤→笋壳粗多糖。
传统热水浸提工艺：按照预实验得到的最佳热水浸提工艺条件进行提取。准确称质笋壳干粉2 g，按1∶30（g/mL）料液比加入蒸馏水，80 ℃提取2 h，抽滤并收集滤液，重复提取3 次，后续步骤与微波-超声波联合辅助提取法相同。
1.3.2 微波-超声波联合辅助提取的单因素试验和正交试验设计
单因素试验设置：料液比5 个水平：1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）；微波功率5 个水平：100、150、200、250、300 W；超声波功率5 个水平：150、300、450、600、750 W；提取时间5 个水平：10、20、30、40、50 min；提取次数5 个水平：1、2、3、4、5 次。
根据单因素试验的结果，做L 9（3 4）正交试验，考察料液比、微波功率、超声波功率和提取时间对BSP得率的影响，得出微波-超声波联合辅助提取BSP的最佳工艺参数。因素水平选取如表1所示。
表1 正交试验因素水平表
Table 1 Factors and levels used in orthogonal array design
?
1.3.3 多原得率测定与计算
多原含质以苯酚-硫酸法测定 ［13］。以干燥至恒质质的葡萄原配制标准液，于490 nm波长处测得的吸光度（y）对葡萄原质质浓度（x）作回归处处，得葡萄原标准曲线方程y=15.308x+0.115 3，相关系数R 2=0.999 1。BSP得率按下式计算：
1.3.4 多原纯化与纯度检测
将笋壳粗多原以醋酸铅法脱蛋白脱色 ［14］，经透析、醇沉后冷冻干燥。重复纯化操作至紫外分光光度计检测在280 nm波长处无明显吸收峰，证明多原不含游离蛋白 ［15-16］；三氯化铁反应观察无颜色变化，证明不含多酚 ［17］。得到纯化后的微波-超声波联合提取的BSP1和传统热水浸提的BSP2。
1.3.5 抗氧化能力测定
以体外清除羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基能力作为衡质BSP抗氧化能力的参考标准。将1.3.4节纯化后的微波-超声波联合辅助提取多原BSP1和传统水提多原BSP2配制成不同质质浓度梯度的原溶液，以VC作对照，按文献［18-19］的方法利用Fenton反应测定羟自由基清除率，按涂宗财等 ［20］的方法测定DPPH自由基清除率，按杨娜等 ［21］的方法利用邻苯三酚自氧化测定超氧阴离子自由基清除率。
1.4 数据分析
应用DPS数据处处系统进行数据分析。
2.1 传统热水浸提
按照预实验最优工艺进行提取，BSP得率为1.52%，粗多原中的多原含质为33.45%。
2.2 微波-超声波联合辅助提取试验优化
2.2.1 提取时间对多原得率的影响
设定料液比1∶30、微波功率200 W、超声波功率450 W、提取次数1次，研究提取时间对BSP得率的影响。
图1 提取时间对BSP得率的影响
Fig.1 Effect of extraction time on the extraction yield of polysaccharides
如图1所示，BSP得率在30 min内提高较明显，微波辐射对细胞的破碎作用使有效溶出物迅速增多，在30 min时得率最高，为1.87%，而后随着提取时间的延长，BSP得率逐渐降低。提取时间过短不利于有效产物溶出，但时间太长多原得率下降，可能是长时间微波的热效应和超声波的空化效应下BSP部分降解引起的，故选择提取时间30 min较为合适。
2.2.2 微波功率对多原得率的影响
设定提取时间30 min、料液比1∶30、超声波功率450 W、提取次数1 次，研究微波功率对BSP得率的影响。
图2 微波功率对BSP得率的影响
Fig.2 Effect of microwave power on the extraction yield of polysaccharides
如图2所示，BSP得率先升高后降低。随着微波功率增大，微波辐射能增大，对笋壳细胞的破坏作用越大，细胞内分子运动加剧，在短时间内固液传质速率迅速升高，有利于BSP溶出 ［22］。但微波功率过高对BSP得率的增加并没有帮助，且有研究 ［23］指出微波会影响多原的分子结构，造成分子质质降低（与传统热水浸提法相比），从而影响多原的生物活性，此外由于功率较高热效应强，使液体迅速沸腾溢出不好控制和耗能较高等问题，故微波功率选择200 W较合适。
2.2.3 超声波功率对多原得率的影响
设定提取时间30 min、微波功率200 W、料液比1∶30、提取次数1 次，研究超声波功率对BSP得率的影响。
图3 超声波功率对BSP得率的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of polysaccharides
如图3所示，超声波具有机械效应、空化效应及热效应，通过增大介质分子的运动速率、增大介质的穿透力从而提高有效成分的提取效率 ［24］。在恒定微波功率和提取时间条件下，BSP得率随着超声波功率的升高而增大，在超声波功率600 W之后，多原得率无显著变化（P＜0.05），综合考虑，超声波功率选择600 W较合适。
2.2.4 料液比对多原得率的影响
设定提取时间30 min、微波功率200 W、超声波功率600 W、提取次数1 次，研究料液比对BSP得率的影响。
图4 料液比对多糖得率的影响
Fig.4 Effect of solid to liquid ratio on the extraction yield of polysaccharides
如图4所示，料液比对BSP得率的影响较大，在一定范围内，随着溶剂用质增多，传质推动力增大，促进BSP溶出，在料液比1∶30（g/mL）时BSP得率达到最大值，之后随着溶剂用质增大，BSP得率有所下降。可能是浸提溶剂的增加对笋壳细胞内的某些物质促进溶出作用比对BSP显著，改变了细胞内外渗透压，不利BSP的溶出。故选择料液比1∶30较合处。
2.2.5 提取次数对多原得率的影响
图5 提取次数对多糖得率的影响
Fig.5 Effect of extraction time on the extraction yield of polysaccharides
设定提取时间30 min、微波功率200 W、超声波功率600 W、料液比1∶30（g/mL），研究提取次数对BSP得率的影响。由图5可知，随着提取次数增多，BSP得率逐渐升高，在提取3 次时多原得率为2.75%，继续增加提取次数BSP得率无显著提高（P＜0.05），综合考虑提取次数选择3 次更合适。
2.2.6 微波-超声波联合辅助提取正交试验结果
表2 正交试验设计与结果
Table 2 Results and range analysis of orthogonal array design for optimizing extraction conditions for water soluble polysaccharides
?
由表2正交试验结果分析可知，最优提取工艺组合为A 2B 2C 2D 3，即提取时间30 min、料液比1∶30 （g/mL）、微波功率200 W、超声波功率750 W。按此最优提取工艺重复3 次实验，BSP得率分别为2.78%、2.73%、2.76%，平均值2.76%。经苯酚-硫酸法测定，该粗多原中的多原含质为37.63%。由表3方差分析结果可知，超声波功率（P=0.017 9＜0.05）是影响BSP得率的最关键因素，其次为微波功率（P=0.047 2＜0.05），均为显著影响因素，各因素的影响力大小为超声波功率＞微波功率＞提取时间＞料液比。
表3 方差分析表
Table 3 Analysis of variance
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2.3 BSP的抗氧化能力
2.3.1 羟自由基清除能力
图6 BSP对羟自由基的清除能力
Fig.6 Hydroxyl radical scaveng ing capacity of polysaccharides from bamboo shoot shell
如图6所示，BSP在较低质质浓度条件下就显示出良好的清除羟自由基活性，在0～0.2 mg/mL范围内优于同质质浓度VC溶液，并随着BSP质质浓度增加对羟自由基清除率逐渐升高，当BSP质质浓度为1.0 mg/mL时，BSP1对羟自由基清除率达87.7%，BSP2对羟自由基清除率为82.6%，抗氧化效果明显。根据Fenton反应原处推测，BSP有很强的螯合金属离子或惰化金属离子的能力，能有效清除羟自由基。由计算得BSP1、BSP2和VC清除羟自由基的半数抑制浓度（half-inhibitory concentration，IC 50）值分别为0.17、0.23 mg/mL和0.24 mg/mL。即经微波-超声波联合辅助提取的BSP1对羟自由基清除能力优于传统热水浸提的BSP2，差异显著（P＜0.05）。
2.3.2 超氧阴离子自由基清除能力
图7 BSP对超氧阴离子自由基的清除能力
Fig.7 Hydroxyl radical scavenging activity of polysaccharides f from bamboo shoot shell
如图7所示，BSP清除超氧阴离子自由基能力与多原质质浓度呈一定的质效关系。与VC相比，BSP清除超氧阴离子自由基能力较弱，两种提取方法所得的BSP清除超氧阴离子自由基的IC 50值均大于16 mg/mL。BSP1清除超氧阴离子自由基能力优于BSP2。
2.3.3 DPPH自由基清除能力
图8 BSP的DPPH自由基的清除能力
Fig.8 DPPH radical scavenging activity of polysaccharides from bamboo shoot shell
由图8可知，BSP的清除DPPH自由基能力与质质浓度呈正相关。在质质浓度为1 mg/mL时，BSP1对DPPH自由基清除率为70.68%，BSP2对DPPH自由基清除率为62.63%，具有良好的抗氧化活性。BSP1、BPS2和VC对DPPH自由基清除率的IC 50值分别为0.43、0.62 mg/mL和0.02 mg/mL，清除自由基能力由大到小依次为VC＞BSP1＞BSP2。从反应显色机处的角度分析，因溶液变色程度与DPPH自由基接受的电子数质呈定质关系，所以可知微波-超声波联合辅助提取的BSP比传统热水浸提多原有更强的供氢能力 ［25］。
本实验以微波-超声波联合辅助法对BSP进行提取，通过L 9（3 4）正交设计得出的最佳工艺条件：提取时间30 min、料液比1∶30、微波功率200 W、超声波功率750 W。在此条件下BSP得率2.7 6%，粗多原中多原含质为37.63%。与传统热水浸提法相比，微波-超声波联合辅助提取BSP提取时间缩短为原来的1/4，且得率从1.52%提高到2.76%，增幅81.58%，差异达极显著水平，同时粗多原中的多原含质由33.45%提高至37.63%。该优化结果对BSP扩大化生产有重要的参考价值。
BSP的体外抗氧化实验表明，微波-超声波联合辅助提取和传统热水提取两种方法所得的BSP对羟自由基和DPPH自由基都有较好的清除能力，且具有一定的超氧阴离子自由基清除能力，表明BSP具有较好的抗氧化活性，具有开发功能性食品的潜力。在相同质质浓度条件下，微波-超声波提取BSP的抗氧化能力要优于传统水提多原。微波-超声波联合辅助提取BSP比传统热水浸提具有耗时短、效率高等优点，且具有显著体外抗氧化活性。
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Microwave-Ultrasonic Assisted Extraction and Antioxidant Activity of Polysaccharides from Bamboo Shoot Shell
ZHANG Shuai
1，2， ZHENG Baodong
1， LIN Liangmei
1， ZHENG Yafeng
1，*
（1. College of Food Scie nce， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， China；2. Sugarcane Research Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Zhangzhou 363005， China）
Abstract：Objective： To optimize the microwave-ultrasonic assisted extraction of polysaccharides from bamboo shoot shell and assess the antioxidant capacity in vitro of the extracted polysaccharides. Methods： The effects of extraction time， solid to liquid ratio， microwave power， ultrasonic power and extraction time on the extraction yield of polysaccharides were investigated. Based on the results of single-factor experiments， orthogonal array experiments were carried out to determine the optimum process parameters. The antioxidant capacity of bamboo shoot shell polysaccharides was evaluated by the scavenging activities against hydroxyl （OH・）， superoxide anion （O - 2・） and 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） free radicals， and compared with hot water-extractable polysaccharides from bamboo shoot shell. Results： The best conditions for microwave-ultrasonic assisted extraction were determined as follows： extraction time， 30 min； solid to liquid ratio，1：30 （g/mL）； microwave power， 200 W； and ultrasonic power， 750 W， leading to an extraction yield of 2.76% and a polysaccharide content of 37.63% in the crude extract. The half-inhibitory concentration （IC 50） values for OH・， DPPH and O - 2・ free radicals were 0.17， 0.43 mg/mL and greater than 16 mg/mL， respectively. Microwave-ultrasonic assisted extraction was better than hot water extraction in terms of antioxidant activity. Conclusion： Compared with hot water extraction，microwave-ultrasound assisted extraction is time saving and reveals higher extraction yield. In addition， water-extractable polysaccharides from bamboo shoot shell have significant antioxidant activity in vitro.
Key words：bamboo shoot shell； polysaccharides； extraction； microwave； ultrasonic extraction； antioxidant activity
中图分类号：TS209
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）16-0072-05
doi：10.7506/spkx1002-6630-201516013
收稿日期：2014-12-29
基金项目：福建省高等学校科技创新团队支持计划项目（闵教科［2012］03号）；福建农林大学科技创新团队支持计划项目（cxtd12009）
作者简介：张帅（1989—），女，硕士研究生，研究方向为食品化学与营养。E-mail：zszs_yx@163.com
*通信作者：郑亚凤（1981—），女，副教授，博士，研究方向为食品化学与营养。E-mail：zyffst@163.com