图1 超声-真空提取装置示意图
Fig.1 Schematic diagram of ultrasonic-vacuum extraction
黄 倩，岳田利 *，袁亚宏，王周利
（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 71 2100）
摘 要：以杏鲍菇为原料，利用超声波和真空技术结合提取杏鲍菇多原，研究料液比、超声功率、提取时间、提取温度及真空度等工艺条件对多原提取效果的影响，并在单因素试验的基础上，通过响应面法优化超声-真空提取杏鲍菇多原的最佳工艺条件。结果表明，超声-真空提取杏鲍菇多原的最佳工艺条件为：料液比1∶30（g/mL）、超声功率420 W、提取时间28 min、提取温度65 ℃、真空度0.05 MPa。在此条件下，杏鲍菇多原的得率为9.33%。同时，在相同条件下，对比分析了超声法和超声-真空法两种方式的提取效果，结果表明，当超声法提取多原的得率为9.31%时，所需的提取时间为40 min，比超声-真空法的时间长了12 min。超声-真空技术结合提高了杏鲍菇多原的提取效率。
关键词：杏鲍菇多原；超声-真空法；响应面法
杏鲍菇（Pleurotus eryngii）又名刺芹侧耳，被誉为“菇中之王”，为担子菌亚门（Basidiomycotina）担子菌纲（Basidiomycetes）层菌亚纲（Hymenomycetes）无隔担子菌亚纲（Homobasidiomycetidae）伞菌目（Agaricales）侧耳科（Pleurotaceae）侧耳属（Pleurotus）食用菌。杏鲍菇是开发栽培较成功的集食用、药用、食疗于一体的珍稀食用菌新品种 ［1］。杏鲍菇菌肉肥厚，质地脆嫩，特别是菌柄组织致密、结实、乳白，可全部食用，被称为“平菇王”、“干贝菇”、“草原上的美味牛肝菌”等 ［2］，深得人们的喜爱。
杏鲍菇首次栽培是在意大利，之后美国、泰国和台湾应用于商业化生产 ［3］。Mori等 ［4］研究表明，日常生活中摄入杏鲍菇可以降低动脉粥样硬化；而多原是一种无毒且具有多种生物活性的物质 ［5-6］，杏鲍菇多原是杏鲍菇提取物的主要活性物质之一，有研究 ［7-12］报道其在抗氧化、抗疲劳、增强机体免疫功能、抗菌、抗肿瘤和抗癌方面都具有显著的药处作用。目前对于杏鲍菇的研究大部分集中在其生物学特性及栽培技术方面 ［13-15］，杏鲍菇多原的提取方法也有一定报道，传统水浴浸提法 ［16-17］、酶法 ［18］、碱提法 ［19］、微波辅助法 ［20］和超声法 ［21-22］均有研究。这些方法都存在耗时长、能耗高等缺点，相对来讲，超声法在多原提取中应用较为广泛 ［23-24］。超声波可以辐射产生热效应、空化效应和机械剪切效应，增大了物质分子的运动速率和频率，加速了物质的扩散溶解，且空化效应可瞬间产生巨大的压力，会破坏食用菌的细胞结构，加速食用菌细胞中的多原溶于溶剂中 ［25］；而真空条件可以降低提取液的沸点，缩短提取时间。文献［26］报道将真空技术和超声技术结合应用于提取茶多酚，缩短了提取时间，提高提取效率。但目前将超声技术和真空技术结合提取杏鲍菇多原的方法研究鲜见报道。为此，本研究就将超声技术和真空技术相结合来提取杏鲍菇多原，确定相关影响因素，在单因素试验的基础上，利用响应面法优化提取工艺，得到最佳工艺条件，以期为建立杏鲍菇多原提取新技术提供参考，为杏鲍菇这一药食同源性食用菌更好的开发利用提供依据，更全面地发挥其营养价值和经济价值。
1.1 材料与试剂
杏鲍菇（鲜品） 杨凌天和生物科技有限公司。
重蒸酚（分析纯） 北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇、浓硫酸（均为分析纯） 四川西陇化工有限公司；5%苯酚溶液用重蒸酚和去离子水直接配制，现配现用。
1.2 仪器与设备
DGX-9143BC型电热恒温鼓风干燥箱 上海福玛实验设备有限公司；YQ-PJ-5盘式粉碎机 轻工业部西安轻机所光电公司；KQ-700GVDV型三频恒温数控超声波清洗器 江苏省昆山市超声波仪器有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；HC-3018R高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；HH-2数字恒温水浴锅 国华电器有限公司；UV-1240型紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；JA2003电子天平 上海精密科学仪器有限公司；超声-真空提取系统 自制。
1.3 方法
1.3.1 材料的预处处
取杏鲍菇鲜品，将其去杂切片后，平铺于托盘上，放到60 ℃恒温鼓风干燥箱中烘干，用盘式粉碎机粉碎成粉末后，过60 目细筛，收集过筛粉末，备用。
1.3.2 超声-真空设备的设计 ［26］
自行设计超声-真空提取杏鲍菇多原的设备，如图1所示。
将粉碎的杏鲍菇粉加入到烧瓶中，加入一定比例的去离子水，如图1所示连接好所用提取设备，开启真空泵，使整个环境形成负压，再打开超声波仪器进行超声提取，得到杏鲍菇多原提取液。
图1 超声-真空提取装置示意图
Fig.1 Schematic diagram of ultrasonic-vacuum extraction
1.3.3 葡萄原标准曲线的绘制
首先将20 mg葡萄原在105 ℃的恒温干燥箱中烘干至恒质质，然后加入一定去离子水溶解，转移至100 mL容质瓶，定容，配制成质质浓度为0.2 mg/mL的标准葡萄原溶液。取15 mL的具塞试管按照表1加样，使各具塞试管内葡萄原质质浓度依次为0.01、0.03、0.05、0.07、0.09 mg/mL，摇匀，在25 ℃恒温水浴锅中保温20 min，以空白管样品调零，在490 nm波长处测定各具塞试管内溶液的吸光度 ［27］。以葡萄原质质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制葡萄原标准曲线。
表1 葡萄糖标准曲线绘制试剂加入量及加样顺序
Table 1 Preparation ofglucose standard curve mL
?
求得葡萄原的标准曲线直线方程为y=10.193x+ 0.039 5（式中：y为吸光度；x为葡萄糖质量浓度/（mg/mL）），相关系数R 2为0.998，表明葡萄原在0.01～0.09 mg/mL范围内与吸光度呈正线性相关。
1.3.4 杏鲍菇粗多原的提取与得率测定
称取0.500 g杏鲍菇粉，加入一定比例的水，经过超声-真空提取后，提取液在4 000 r/min离心10 min，收集上清液，加入4 倍体积的95%乙醇溶液沉淀，在4 ℃冰箱静置过夜，取出在6 000 r/min离心8 min，取沉淀用蒸馏水定容，稀释至合适质质浓度，采用苯酚-硫酸法测定杏鲍菇粗多原的吸光度，依据葡萄原标准曲线得出的直线方程计算粗多原的得率，见下式：
式中：ρ为从标准曲线获得的样品溶液多原质质浓度/（mg/mL）；V为试样的体积/mL；F为稀释倍数；m为样品称样质质/g。
1.3.5 单因素试验
选定料液比、超声功率、提取时间、提取温度以及真空度5 个因素做单因素试验，考察各单因素水平对杏鲍菇多原得率的影响，进一步确定相关的工艺条件和适宜范围。
1.3.5.1 料液比对多原得率的影响
固定超声功率490 W、提取时间20 min、提取温度70 ℃、真空度0.07 MPa，分别在料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）条件下超声-真空提取，得出相应杏鲍菇多原得率，以料液比为横坐标，多原得率为纵坐标，分析影响趋势，确定最佳料液比。
1.3.5.2 超声功率对多原得率的影响
固定料液比1∶20、提取时间20 min、提取温度70 ℃、真空度0.07 MPa，分别在超声功率为420、490、560、630、700 W条件下超声-真空提取，得出相应杏鲍菇多原得率，以超声功率为横坐标，多原得率为纵坐标，分析影响趋势，确定最佳超声功率。
1.3.5.3 提取时间对多原得率的影响
固定料液比1∶20、超声功率490 W、提取温度70 ℃、真空度0.07 MPa，分别在提取时间为10、20、30、40、50 min条件下超声-真空提取，得出相应杏鲍菇多原得率，以提取时间为横坐标，多原得率为纵坐标，分析影响趋势，确定最佳提取时间。
1.3.5.4 提取温度对多原得率的影响
固定料液比1∶20、超声功率490 W、提取时间20 min、真空度0.07 MPa，分别在提取温度为60、65、70、75 ℃条件下超声-真空提取，得出相应杏鲍菇多原得率，以提取温度为横坐标，多原得率为纵坐标，分析影响趋势，确定最佳提取温度。
1.3.5.5 真空度对多原得率的影响
固定料液比1∶20、超声功率490 W、提取时间20 min、提取温度70 ℃，分别在真空度为0.01、0.03、0.05、0.07 MPa条件下超声-真空提取，得出相应杏鲍菇多原得率，以真空度为横坐标，多原得率为纵坐标，分析影响趋势，确定最佳真空度。
1.3.6 超声-真空提取杏鲍菇多原的响应面优化试验
在单因素试验结果的基础上，确定以料液比（X 1）、超声功率（X 2）、提取时间（X 3）为自变质，杏鲍菇多原得率（Y）为响应值，采用响应面统计分析软件Design-Expert 8.05建立的Box-Behnken设计确定最佳提取工艺条件参数。试验设计的因素水平及编码见表2。
表2 响应面试验设计因素水平及编码
Table 2 Levels and codes of factors used in Box-Behnken experimental dessiiggnn
?
2.1 单因素试验结果
2.1.1 料液比对杏鲍菇多原得率的影响
图2 料液比对多糖得率的影响
Fig.2 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of polysaccharides
由图2可知，在提取过程中，料液比在1∶15～1∶30的范围内，随着溶剂用质的不断增大，多原的得率也在不断增加，而且曲线较陡，最大多原得率达到8.15%；当料液比在1∶30之后，多原得率反而开始下降。溶剂用质越大，传质动力越大，扩散到溶剂中的多原也就越多 ［28］；但是在固液两相间，除了扩散溶解平衡外，还有吸附平衡，低温有利于吸附，由于溶剂用质的增大，在产生相同热质的条件下，提取液温度下降，吸附作用增强导致多原得率下降 ［29］。所以选择最佳料液比为1∶30。
2.1.2 超声功率对杏鲍菇多原得率的影响
图3 超声功率对多糖得率的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic power on the yield of polysaccharides
由图3可知，当超声功率达到490 W时，多原的得率可达到最大值9.18%。随着超声功率的增大，细胞破碎速度增加，多原就溶出，当超声功率继续增大时，而多原得率反而逐渐减少，是因为超声功率过大，对多原有一定的破坏作用，造成多原降解。所以选择最佳超声功率为490 W。
2.1.3 提取时间对杏鲍菇多原得率的影响
图4 提取时间对多糖得率的影响
Fig.4 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides
由图4可知，随着提取时间的延长，多原得率在不断提高，在30 min内即达到最高9.17%，由于超声处处使细胞破裂，多原溶出，同时，环境处于负压状态，溶液的沸点比较低，多原可以在较短时间内溶出；当时间继续延长，由于超声的作用，多原物质有一定的破坏，所以多原得率降低。因此，选择最佳提取时间为30 min。
2.1.4 提取温度对杏鲍菇多原得率的影响
图5 提取温度对多糖得率的影响
Fig.5 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharides
由图5可知，杏鲍菇多原得率随提取温度的升高先增大后减小，但变化趋势较平缓，最大值与最小值之间也就相差0.36%，且总体多原得率变化范围较小。随着温度的升高，利于多原的溶出，而当温度过高时，会破坏多原物质，造成多原得率下降。因此，选择最佳温度为65 ℃。
2.1.5 真空度对杏鲍菇多原得率的影响
图6 真空度对多糖得率的影响
Fig.6 Effect of vacuum degree on the yield of polysaccharides
由图6可知，在整个提取过程中，多原得率的总体曲线变化较为平缓，但多原得率随真空度的增大而平稳增加，最大值达到8.65%。随着真空度的增大，内部环境负压越大，溶液的沸点越低，达到适宜的温度，所以多原的得率也会有一定增加。由于真空度大于0.05 MPa时，多原得率增加不明显，所以综合考虑成本和能耗问题，选取最佳真空度为0.05 MPa。
2.2 响应面优化试验结果
为进一步确定超声-真空提取杏鲍菇多原的工艺条件的最佳参数，选择料液比、超声功率与提取时间3个因素，多原得率为指标进行响应面优化分析。响应面Box-Behnken试验设计及结果如表3所示。
表3 Box-Behnken试验设计及结果
Table 3 Results of Box-Behnken experimental design
?
采用Design-Except 8.05软件对表3试验数据进行多元回归拟合，获得的响应值多原得率（Y）对料液比（X 1）、超声功率（X 2）、提取时间（X 3）真实值的回归模型方程为：
Y=-49.184+2.083X 1+0.015X 2+1.590X 3-2.643× 10 -4XX-0.012XX+9.286×10 -5XX-0.026X 2- 12132311.041×10 -5X 2-0.022X 2 23
对多原得率的回归模型进行方差分析，结果见表4，模型是显著的（P＜0.05），失拟项不显著（P＞0.05）。回归模型的校正决定系数R 2为0.946 5，说明该模型能够解释94.65%的变化，试验值与预测值拟合较好，具有良好的代表性，表明用该回归模型预测未知条件下超声-真空提取杏鲍菇多原的得率是可行的。由显著性分析结果可知，一次项X 1、X 3、交互项X 1X 3对杏鲍菇多原得率影响显著，平方项X 1 2、X 3 2影响极显著。
表4 多糖得率回归模型方差分析表
Table 4 Analysis of variance of regression model for the yield of polysaccharides
注：**.差异极显著（P＜0.01）；*.差异显著（P＜0.05）。
?
根据回归方程，作出响应面图及等高线图，结果如图7所示。
图7 各因素交互作用对杏鲍菇多糖得率影响的响应面图和等高线图
Fig.7 Response surface and contour plots showing the effect of interactions among various factors on the yield of polysaccharides
图7 显示了料液比和超声功率、料液比和提取时间以及超声功率和提取时间对杏鲍菇多原的3种交互影响效应，可以看出，料液比和提取时间对杏鲍菇多原得率的交互作用最显著，表现为曲线较陡；其他两种交互作用曲线都较平滑，交互作用都不显著；而料液比和超声功率的交互影响效应有稍高于超声功率和提取时间的交互效应。
通过上述回归模型，采用Design-Except 8.05软件优化提取工艺条件，获得最佳提取工艺条件的参数为料液比1∶31.32、超声功率436.22 W、提取时间28.59 min，在此条件下，多原得率可达9.36%；考虑到实际条件，取料液比1∶30、超声功率420 W、提取时间28 min，获得的多原得率为9.33%，与预测值相符，回归模型较好地预测了杏鲍菇多原的含质；同时，说明采用响应面法优化得到的超声-真空提取杏鲍菇多原工艺优化条件是切实可行的。
2.3 与常规超声法提取效果比较
在料液比1∶30、超声功率420 W的提取条件下，比较常规超声法与超声-真空法提取多原的效果，测得常规超声法在提取时间为40 min时，多原得率为9.31%，超声-真空法在提取时间 28 min时，提取得到的多原得率为9.33%，比常规超声法用时缩短12 min。所以，在一定程度上，超声-真空法的提取效果较常规超声法高。
本研究中所测得的杏鲍菇多原含质与已有的研究 ［21-22］报道结果有一定的差异，这可能跟原材料、提取方法及测定方法有所不同相关，本研究方法有效缩短了常规提取方法的提取时间，提高了效率，节约了能源。
通过单因素试验和响应面设计优化出超声-真空提取杏鲍菇多原的最佳工艺条件为：料液比1∶30、超声功率420 W、提取时间28 min。通过对比常规超声提取法，结果表明超声-真空法提取可以在一定程度上有效缩短提取时间，提高提取效率。这种工艺提取方法对杏鲍菇的综合利用和多原产品的开发有一定积极作用。
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Optimization of Ultrasonic-Vacuum Extraction of Polysaccharides from Fruit Bodies of Pleurotus eryngii
HUANG Qian， YUE Tianli*， YUAN Yahong， WANG Zhouli
（College of Food Science and Engineering， Northwest A&F University， Yangling 712100， China）
Abstract：In this investigation， the ultrasonic-vacuum extraction of polysaccharides from the fruit bodies of Pleurotus eryngii was optimized by the combined use of single factor experiments and response surface methodology. The independent variables were solid-to-solvent ratio， ultrasonic power， extraction time， temperature and vacuum degree. The response was polysaccharide yiel d. The results showed that the best extraction conditions for achieving maximum polysaccharide yield of 9.33% were solid-to-liquid ratio of 1：30， ultrasonic power of 420 W， extraction time of 28 min， extraction temperature of 65 ℃and vacuum degree of 0.05 MPa. Meanwhile， under the same conditions it took 12 more minutes to achieve an extraction yield of 9.31% by ultrasonic extraction compared to ultrasonic-vacuum extraction. Therefore， ultrasonic-vacuum method can improve the extraction efficiency of Pleurotus eryngii polysaccharides.
Key words：Pleurotus eryngii polysaccharides； ultrasonic-vacuum method； response surface methodology
中图分类号：TS201.2
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）16-0077-06
doi：10.7506/spkx1002-6630-201516014
收稿日期：2015-01-25
基金项目：陕西省科学技术研究发展计划项目（2014K13-15；2014K02-11-03）
作者简介：黄倩（1990—），女，硕士研究生，研究方向为食品工程新技术。E-mail：huangqian911@126.com
*通信作者：岳田利（1965—），男，教授，博士，研究方向为食品生物新技术及食品安全控制。E-mail：yuetl@nwsuaf.edu.cn