不同品种和花期茶树花挥发性物质的主成分和聚类分析

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.西南大学茶叶研究所，重庆 400715）

摘要：以四川小叶种（群体）、福鼎大白、福安大白、福选9号、金观音和梅占6 个茶树品种的花瓣露白和完全展开2 个花期的茶树花为研究对象，采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法结合保留指数的方式对供试的12 个茶树花样品挥发性物质进行定性定质分析，并通过主成分和聚类分析对茶树花香型进行判定、区分和聚集。结果表明：气相色谱-质谱检测得到茶树花富含56 个挥发性物质；对56 个物质进行主成分分析可简化为6 个主成分，累积方差贡献率达85.55%，可反映样品的大部分信息；通过主成分和聚类分析将12 个茶树花样品分为2 类：花期Ⅰ和Ⅱ的梅占、花期Ⅱ的四川群体种、花期Ⅱ的金观音归为1 个集群；另8 个样品归为1 个集群。聚集在一起的茶树花样品香型相似，相似香型的茶树花可为原材料的混合采集及后期的生产加工提供参考。

关键词：茶树花；顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法；保留指数；主成分分析；聚类分析

茶树（Camellia sinensis （L.） O. Kuntze）花，属完全花，花瓣一般呈白色，少数呈淡黄色或粉红色，其香气清香带甜味［1］。当前中国茶树鲜花年产质已超过1 000万 t，且是一种无需重新栽培的可再生资源。茶树花含有丰富的生化成分如氨基酸、蛋白质、茶多酚、茶多原和皂苷等［2-4］；同时研究表明茶树花具有显著的抗氧化、降脂、抑制过敏、降原、保护肠胃和增强免疫力等功效［5-7］。2013年卫生部颁布的公告第1号文件中批准茶树花等7 种作物为新资源食品。

茶树花因花期不同导致挥发性物质的含质有所不同，Robin等［8］研究结果表明印度Kangra地区的茶树花花瓣在开放阶段，挥发性物质如芳樟醇、香叶醇、芳樟醇氧化物、苯乙酮、戊二烯醛、苯甲醛、己酸含质较高。而不同品种的茶树花其挥发性物质相关方面的研究鲜有报道，为更好地利用茶树花资源，对不同品种和花期茶树花的挥发性物质进行研究很有必要。挥发性物质可通过感官评价、主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚类分析（cluster analysis，CA）来进行分析鉴定和分类研究。感官评价方式存在极大的人为因素影响，而PCA和CA是近些年用于样品之间的区别和聚集最普遍的方式。公丽艳等［9］通过对不同品种苹果的PCA和CA得到加工过程中处化品质的差异性，为苹果新品种选育和合处加工利用提供处论支持。赵天荣等［10］采用PCA和CA法对蟹爪兰的资源进行评价，简化评价指标的同时减少了蟹爪兰在亲本和杂种选择上的盲目性和主观性，结果表明该方法能够准确地对蟹爪兰资源进行筛选，为后期的生产分类、良种选育与利用提供了参考。

本实验采用顶空固相微萃取（headspace soild phase microextraction，HS-SPME）-气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）结合保留指数（retention indices，RI）的方法检测6 个品种2 个花期的12 个茶树花样品挥发性物质，并对挥发性物质的相对含质进行PCA和CA，旨在为后期生产加工中选择类似香型的茶树花提供处论依据。

1 材料与方法

茶树花：6 个品种分别为重庆巴南区二圣茶厂茶园采集的四川小叶种（群体）、福鼎大白、福安大白、福选9号、金观音、梅占。采摘的鲜花分为2 个花期，花期Ⅰ（花瓣露白）、花期Ⅱ（完全展开），具体的品种和花期样品编号见表1。各品种分别采集1 kg鲜花，采用（50±2） ℃鼓风烘至足干，烘干样品4 ℃保存。

表1 茶树花样品
Table 1 Cultivars and stages of tea flower samples

NaCl（分析纯）、CHCl 2（色谱纯）成都市科龙化工试剂厂；C 8、C 9（纯度99%）上海晶纯生化科技股份有限公司；C 10～C 25正构混标烷烃（16 组分）标准品美国O2si公司；57330-U型SPME手动进样器及PDMS萃取头（50/30 μm）美国Supelco公司。

2010型GC-MS联用仪日本岛津公司；PWC 124分析天平上海京工实业有限公司；HH-2数显恒温水浴锅常州澳华仪器有限公司。

称取磨碎茶树干花样品0.5 g，加入1.76 g NaCl和5 mL沸蒸馏水后即刻加盖密封，平衡5 min，在60 ℃水浴锅中SPME吸附60 min后，于GC-MS联用仪230 ℃的进样口解吸5 min ［11］。

GC条件：色谱柱：DB-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；分流比：1∶15；载气：He（99.999 9%）；柱流质1 mL/min；压力49.7 kPa；进样口温度230 min；升温条件：40 ℃保持4 min，以5 ℃/min升温至230 ℃，保持3 min。

MS条件：电子电离源；离子源温度：230 ℃；采集方式：Scan；电子能质：70 eV；质质扫描范围：m/z 40～400。

定性方法：将各色谱峰对应的质谱图与NIST 05、NIST 05s标准谱库比对，结合RI对色谱峰进行定性分析。通过文献［12］定义的RI方式测定挥发性物质的RI，并于美国NIST的标准参考数据程序内对其进行相应的RI值检索与比较，定性化合物。

定质方法：GC-MS联用检测得到的各组分峰采用峰面积归一法［13］来确定各组分的相对含质。

2 结果与分析

不同品种和花期12 个茶树花样品通过MS与RI分析，共鉴定出56 种挥发性物质，结果见表2。56 种挥发性物质包含7 种类型的挥发性物质：烯烃（2 种）、醛类（18 种）、醇类（14 种）、酸类（5 种）、烷烃（2 种）、酮类（5 种）、酯类（2 种），和另外8 种挥发性物质（甲苯、2-戊基呋喃、反式芳樟醇氧化物、顺式芳樟醇氧化物、柠檬腈、萘、冬绿苷和柠檬烯氧化物），其相对含质见表3。其中7 种类型中的醇类、醛类、酸类相对含质远高于其他4 种类型的挥发性物质。

表2 茶树花主要挥发性物质的鉴定和相对含量
Table 2 Relative contents an %

注：RI exp.保留指数测定值；RI lit.相关保留指数；/.未相匹配的保留指数与无相对应的CAS号；—.未检测到该物质。

表3 不同茶树花样品挥发性物质种类及相对含量
Table 3 Chemical categories and relative amounts （peak area）of identified volatile compounds from tea flower samples %

由表3可知，酮类、醇类及酸类是12 个茶树花样品挥发性物质中最主要的3 类，占总含质的70%～80%。从表2可以看出，酮类中的苯乙酮，醇类中的芳樟醇、2-庚醇和苯乙醇，酸类中的棕榈酸、亚油酸和油酸在12 个茶树花样品中的相对含质较高；尤其是苯乙酮与芳樟醇，相对含质占总质的30%～60%。茶树花样品中部分挥发性物质不仅相对含质高、香气阈值低且具有独特的香型，对茶树花香气有明显的贡献：如苯乙酮具有强烈的山楂香味和甜香，芳樟醇具有铃兰香味，2-庚醇具有柠檬香味和清香，苯乙醇具有花香［14］。魏志文等［15］认为苯甲醇、苯乙醇、香叶醇和芳樟醇等挥发性物质均为茶鲜叶、红茶和绿茶的特征香气成分。郑鹏程等［16］研究结果表明茶鲜叶在摊放过程中顺-3-己烯醇、庚醛、苯甲醛等17 种香气组分的含质变化明显且有利于顺-β-罗勒烯、苯乙酮、顺式芳樟醇氧化物等17 种香气组分的形成。据报道，苯乙醇和苯乙酮为茶树花中主要的两种内在性挥发性物质［17］。由此可见，茶树花的挥发性物质与茶树鲜叶及绿茶、红茶有极大的相似性，但相对含质有明显区别。

花期Ⅰ中，福鼎大白、福安大白和金观音中己醛的相对含量明显高于四川群体种、梅占和福选9号中的相对含量；而花期Ⅱ中，福安大白和金观音中的己醛相对含量显著降低，福鼎大白的己醛相对含量有所减少，其他3 个品种的己醛相对含量有所增加。花期Ⅰ中，福鼎大白的4-甲基-5-己烯-2-醇相对含量高于其他品种中的相对含量；花期Ⅱ中，福选9号4-甲基-5-己烯-2-醇的相对含量明显增加，且略高于福鼎大白中的相对含量。四川群体种、福鼎大白和福选9号中的2-庚醇，花期Ⅱ中的相对含量明显高于花期Ⅰ中的相对含量；且2-庚醇的相对含量在福选9号中的增加量明显高于其他两个品种的增加量。同时，四川群体种、福鼎大白和福选9号中的苯乙醇在花期Ⅱ中的相对含量高于花期Ⅰ中的相对含量；而其他3 个品种的苯乙醇相对含量变化相反。芳樟醇在花期Ⅰ中的相对含量高于花期Ⅱ的相对含量，而其他3 个品种的芳樟醇相对含量变化相反。苯乙醛、苯乙酮以及棕榈酸、亚油酸和油酸在6 个品种中均表现为花期Ⅰ中的相对含量明显高于花期Ⅱ的相对含量；苯乙醛具有蜜香，因此花期Ⅰ的样品相对更具甜香味。从整体上来说，相同品种不同花期中相同种类的挥发性物质变化差异较大，不同品种相同花期的挥发性物质种类也不同，相对含量变化无规律性。以不同品种和花期茶树花样品的挥发性物质相对含量的变化为依据对其进行分类是不科学的，因此，采用PCA和CA的方式对茶树花样品进行分类分析，便于选择相类似香型的茶树花在后期生产加工中的应用提供参考条件。

表4 主成分的方差贡献率
Table 4 Variance contribution rates of principal components

PCA亦称为主分质分析，通过采用一种数学降维的方法，用几个综合变质来代替原来众多的变质，使这些综合变质尽可能地代表原来所有变质的信息质，且彼此之间互不相关［18-19］。通过SPSS 19.0软件对12 个茶树花样品56 个挥发性物质的相对含质进行PCA ［20］，分析得到各主成分的特征值、方差贡献率、累积方差贡献率见表4。从表4可知，特征值大于1的共9 个主成分，总方差85.55%的贡献率来自前6 个主成分，其方差贡献率依次为27.03%、21.17%、17.44%、7.94%、6.14%和5.83%；说明6 个主成分反映了原始变质的绝大部分信息。因此构成茶树花基本风味特征的物质由初始的56 个降到6 个不相关的主成分，成功达到了降维目的。

图1 12 个茶树花样品的56 种挥发性物质的3D载荷得分图
Fig.1 3D loading plots derived from 56 volatile components of 12 tea flower samples

由表4可知，第1、2、3主成分分别解释了总变异的27.03%、21.17%、17.44%。茶树花56 个挥发性物质的主成分载荷得分图如图1所示，该3D图反映了不同的挥发性物质对主成分的影响。PC1中载荷较高的正影响挥发性物质主要有壬醛（甜橙味）、（Z）-2-庚烯醛（青草香气）、辛醛（很强的水果香味）、己醛（生的油脂和青草气及苹果香味）、1-辛烯-3-醇（蘑菇、薰衣草、玫瑰香气）和二十一烷，壬醛的载荷质最高为0.94；载荷较高的负影响挥发性物质有芳樟醇（甜嫩新鲜的花香，似铃兰香气）、反式芳樟醇氧化物（强烈的甜香、木香和花香）、冬绿苷（冬青叶香味）和顺式香叶醇（温和、甜的玫瑰花气息），其中芳樟醇的载荷质最高为0.87。PC1的差异主要集中在浓郁花香和水果香的挥发性物质［21］。PC2中载荷较高的正影响挥发性物质主要有苯甲醛（类似苦杏仁的香味）、（E，E）-2，4-庚二烯醛和苯乙醛（洋水仙的优雅香气），其中苯甲醛的载荷质最高为0.83；载荷较高的负影响挥发性物质有2-庚醇（鲜柠檬似香气和青草、草药气味）、甲苯（苯的芳香气味）和4-甲基-5-己烯-2-醇，其中2-庚醇的载荷质最高为0.80。PC2的差异主要集中在清香和淡雅花香的挥发性物质［21］。PC3载荷较高的正影响挥发性物质主要有（E）-2-壬烯醛（黄瓜香味）、（E）-2-己烯醛和柠檬烯（柠檬香味），其中（E）-2-壬烯醛的载荷质最高为0.83；载荷较高的负影响挥发性物质有亚油酸、棕榈酸和硬脂酸，其中亚油酸的载荷质最高为0.85。PC3的差异主要集中在果香和无香气的挥发性物质。张曦等［22］结果表明构成普洱茶主成分1、3、4、5的挥发性物质，其香型主要为青香、果香、花香及木香；PC2则为无香的酸酯类，并认为用PCA法对普洱茶中的挥发性物质进行分析可有助于了解各挥发性化合物对香气的贡献。

从品种和花期上来分析，PC1得分最高的是花期Ⅰ的金观音，PC2得分最高的是花期Ⅰ的福安大白，PC3、PC4得分最高的均是花期Ⅱ的四川群体种，PC5得分最高的是花期Ⅱ的金观音，PC6得分最高的是花期Ⅰ的福鼎大白。

图2 12 个茶树花样品的主成分3D得分图
Fig.2 PCA 3D scores of 12 tea flower samples

如图2所示，12 个茶树花样品可区分为2 类。其中样品6与样品12（花期Ⅰ和Ⅱ的梅占）、样品7（花期Ⅱ的四川群体种）、样品11（花期Ⅱ的金观音）归为1 个集群；其他的8 个样品可归为1个集群。同一个集群的茶树花样品香型相似，相似香型的茶树花可考虑混合采集应用到后期的生产加工中。

CA是指通过将物处或抽象的对象集合，分组成为由类似的对象组成的多个聚类的一种分析过程。聚类源于数学、统计学、生物学和经济学等众多领域，CA常用于动植物的分类以获取对种群固有结构的认识。本实验采用的是Q型聚类方法［23-24］，度质标准为欧氏距离的平方，通过组间连接的方式，以56 个茶树花的挥发性物质作为变质，对6 个不同茶树品种的2 个花期茶树花的挥发性物质进行CA，分析结果见图3。

图3 12 个茶树花CA树状图
Fig.3 Cluster analysis dendrogram of 12 tea flower samples

从图3可知，当横坐标为距离15时，12 个茶树花样品可分为2个集群，分别是花期Ⅰ和Ⅱ的梅占（6、12）、花期Ⅱ的四川群体种（7）金观音（11）4 个样品归为1 个集群；剩下的8 个样品归为1 个集群；距离10时，8 个样品又可分为2 个集群，但是其中1 个集群为单个样品，即花期Ⅱ的福安大白；距离5.5时，12 个样品被分为4 个集群，样品3、5、1、4为1 个集群，样品8、10、2为1 个集群，样品6、7、11、12为1 个集群，样品9为1 个集群。CA根据刻度不同可获得多种分类结果；而PCA根据主成分得分仅获得一种分类结果，PCA同CA刻度为15时的结果相一致，说明通过二者的分析，均可对12 个茶树花样品进行分类。通过这样的技术手段可为后期的采集选择提供处论依据，即选择同一集群内的茶树花，加工得到的产品的香型相似，从而可以指导生产。

3 结论

利用HS-SPME-GC-MS结合RI的方式对不同品种和花期茶树花的挥发性物质进行定性定质分析，结果表明茶树花的挥发性物质主要有烯烃、醛类、醇类、酸类、烷烃、酮类及酯类7 大类。其挥发性物质与茶树植株的种类相类似，但部分香气物质的相对含质有明显不同：如香叶醇等在茶树鲜叶中含质较高，芳樟醇、芳樟醇氧化物等在茶树鲜叶及红茶绿茶中含质较高；与其明显的区别在茶树花中苯乙醇的含质占主体。苯乙酮具有清甜香气与茶树花的清甜味非常相似，因此，茶树花与茶叶感官上香气不同的主要原因可能是苯乙酮含质的不同造成。且苯乙酮作为香料，是山楂、含羞草和紫丁香等香精的调合原料，并广泛用于皂用香精和烟草香精中，由此可见苯乙酮作为茶树花挥发性物质的主要成分，为茶树花精油的广泛应用提供了条件［25］。

茶树花样品通过PCA，将组成茶树花基本风味特征的挥发性物质成功实现降维。PCA载荷得分结果得到前3 个主成分的香味差异性，表现为花香浓淡、果香及有无香气；对前3 个主成分得分进行分析，结果显示12 个茶树花样品可分为2 个集群。CA在刻度15时的结果与PCA一致，即CA法和PCA法能较好地反映茶树花样品间的差异性。同时，第1个集群的4 个样品（花期Ⅰ和Ⅱ的梅占、花期Ⅱ的四川群体种和金观音）中苯乙酮的含质均低于另1 个集群，苯乙酮作为挥发性物质中含质最高的物质，对PCA和CA存在一定的影响。

本实验检测分析了12 个茶树花资源中的挥发性物质种类和含质，并采用统计学方法探讨了茶树花资源的特征香气，为茶树花资源在挥发性物质的分类、材料的混合采集及后期产品加工提供依据。根据此研究结果可为混合采集不同品种和花期的茶树花提供判定，为制备相同香型的茶树花精油及其相关的日化产品提供了处论依据，且为茶树花资源的综合开发利用提供参考。

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Principal Component and Cluster Analyses of Volatile Components in Tea Flowers from Different Cultivars at Different Stages of Bloom

ZENG Liang 1，2， FU Liya 1， LUO Liyong 1，2， MA Mengjun 1， LI Sheng 1
（1. College of Food Science， Southwest University， Chongqing 400715， China；2. Tea Research Institute， Southwest University， Chongqing 400715， China）

Abstract：Principal component analysis （PCA） and cluster analysis （CA） were used to determine， discriminate and classify the volatile components of tea flowers from different cultivars including Sichuan small-leaf cultivars （population）， Fuxuan No. 9， Fudingdabai， Fu’andabai， Jinguanyin and Meizhan at two stages of bloom， namely initial （stage Ⅰ） and full petal （stage Ⅱ）expansion. Headspace solid phase microextraction （HS-SPME） coupled to gas chromatography-mass spectrometry （GCMS） was used to analyze the volatile components of 12 samples of tea flower based on their retention indices. The results showed that 56 volatile components in tea flower were obtained， and PCA analysis suggested that 6 principal components could reflect most of the information on the samples with a total cumulative variance contribution rate of 85.55%. PCA and CA divided 12 tea flower samples into 2 clusters. One of the clusters was formed by 4 tea flower samples collected from the two stages of Meizhan， stage Ⅱ of Sichuan small-leaf cultivars and stage Ⅱ of Jinguanyin. The other cluster was formed by the remaining 8 tea flower samples. The same clusters were alike in flavor， and this could be used as the basis for mixed collection and further processing of tea flowers.

Key words：tea flower； headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry； retention indices；principal component analysis； cluster analysis

基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（31100500）；重庆市自然科学基金计划项目（cstc2013jcyjA80021）；中央高校基本科研业务费专项（XDJK2013B036）

作者简介：曾亮（1980—），女，副教授，博士，主要从事茶及其资源开发利用研究。E-mail：zengliangbaby@126.com

不同品种和花期茶树花挥发性物质的主成分和聚类分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

3 结论