郝宝瑞 1,2，张坤生 1,*，张顺亮 2，王守伟 2，成晓瑜 2
（1.天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134；2.中国肉类食品综合研究中心，北京 100068）
摘 要：为探究清酱肉中挥发性风味成分，并分析各个物质对清酱肉整体风味的贡献大小，采用同时蒸馏萃取提取清酱肉的香气成分，利用气相色谱-质谱联用结合嗅闻仪 分析其挥发性风味成分，共鉴定出61 种化合物，结合芳香萃取物稀释分析法检测到的香气化合物共23 种。清酱肉中检测到风味活性较强的挥发性物质主要有壬醛（油脂香、香橙香）、3-甲硫基丙醛（煮土豆味）、辛酸乙酯（水果香、甜味）、反-2-壬烯醛（清香）、癸酸乙酯（水果香）、苯乙醛（玫瑰花香），其对清酱肉整体风味贡献较大。2,4-己二烯酸乙酯（肉香、腊味）是清酱肉 中特有的香气成分。
关键词：清酱肉；挥发性风味成分；同时蒸馏萃取；气相色谱-质谱联用结合嗅闻；芳香萃取物稀释分析法
腌腊肉制品的风味形成是一个复杂的过程，脂质降解、蛋白质降解及碳水化合物发酵是其主要形成途径 [1-2]。风味物质的组成和含质是评价产品整体可接受性的重要指标之一。在目前相关报道中，研究人员大都采用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用对产品风味成分分析，检测到的多种挥发性化合物中，仅一小部分对风味有贡献 [3]，而且有些含质低的有效风味物质对产品的贡献很大，GC-MS无法将其鉴定出来 [4]。因而单纯使用GC-MS无法确定各种风味化合物对总体风味贡献的大小。气相色谱-嗅闻（gas chromatography-olfactometry，GC-O）仪是一种将GC分离能力与人的嗅觉相结合，从复杂的化合物中选择和评价气味的有效方法 [5]，所以将GC-O和MS连接起来，两者优势互补，在挥发性化合物的鉴别和对风味贡献大小的判断中发挥更大作用。 芳香萃取物稀释分析（aroma extract dilution analysis，AEDA）法是GC-O检测技术中比较常用的一种分析方法，通过逐步稀释浓缩液，然后对各稀释梯度的样品进行GC-O分析，并描述气味，直到不能闻到气味为止，计算每种香气化合物的稀释因子（flavor dilution factor，FD）值，根据FD值的大小来确定关键香气活性化合物。
GC-O、AEDA法等技术的出现，不仅开创了现代风味化学的新时代，并越来越多地被应用于食品风味成分的鉴定 [6]。AEDA法可以准确的评价风味活性物质对整体风味的贡献大小，同时蒸馏萃取（simultaneous distillation extraction，SDE）法也是应用较多的挥发性风味物质提取方法。
清酱肉属于我国传统的腌腊肉制品，其制作工艺独特，成品红亮泽润、郁香鲜浓、利口不腻、肥肉 薄片，风味独特为人们所称赞，具有很高的研究价值和开发潜力 [7]。腌腊肉制品中挥发性风味物质的研究已经有很多报道，但有关清酱肉的研究很少，为探究清酱肉中香气活性化合物，本研究选取了SDE法提取清酱肉的挥发性化合物，利用GC-O-MS结合AEDA法对清酱肉挥发性成分进行分析，旨在确定其主体风味成分，为更好地保持和提升清酱肉的品质提供可靠的处论依据。
1.1 材料与试剂
精品五花猪肉 市购；清酱肉加工用辅料 中国肉类食品综合研究中心香辛料部。
无水乙醚、无水硫酸钠（均为分析纯） 北京化学试剂有限公司；C 8～C 25正构烷烃（色谱纯） 美国Sigma公司；氮气（纯度99.9%）、氦气（纯度99.99%）北京氦普北分气体工业有限公司。
1.2 仪器与设备
1310型GC-TSQ8000型三重四极杆MS 美国Thermo公司；ODP2嗅闻检测仪 德国Gerstal公司。
1.3 方法
1.3.1 清酱肉加工工艺流程
原料→解冻→休整→腌制→酱腌→干燥→成熟→包装
1.3.2 SDE法提取清酱肉挥发性风味成分 [8]
将清酱肉绞碎后，准确称取65 g，置于500 mL圆底烧瓶中，加入195 mL去离子水，连接到SDE装置的一侧，用电热套加热，温度控制在（130±2） ℃，装置另一侧连接盛有60 mL重蒸乙醚 [9]的圆底烧瓶，加入少质沸石，用恒温水浴锅加热，温度控制在（45±2） ℃。待两侧都回流时开始计时，连续萃取4 h，萃取液中加入适质经过干燥处处的无水硫酸钠，然后置于冰箱静置冷冻脱水24 h，过滤后将滤液用旋转蒸发仪浓缩至6～8 mL，再用氮气吹扫至1 mL左右，得到芳香、透明的浓缩液，移入2 mL瓶中，密封保存在-18 ℃冰箱中，待GC-MS分析。
1.3.3 挥发性风味成分分析
1.3.3.1 GC-MS分析条件
GC条件：TG-Wax MS极性色谱柱（30 m× 0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度250 ℃；升温程序：初始温度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升温到200 ℃，保持0 min，再以10 ℃/min升温到250 ℃，保持3 min；载气（He）流速1.5 mL/min；自动进样1 μL；分流比30∶1。
MS条件：电子电离源；电子能质70 eV；传输线温度260 ℃；离子源温度280 ℃；质质扫描范围40～400 u。
1.3.3.2 嗅闻检测器
嗅闻检测器的接口温度200 ℃。检测时为了防止评价员鼻腔干燥，通入湿润氮气。用预处处后的样品及标准香气化合物对每位评价员反复培训后再进行样品实验，由3 位评价员在嗅觉检测口处记录闻到香气的时间、香味特性和香气强度，每种化合物的香气描述及时间至少由其中2 名评价员一致才确定。
1.3.4 化合物鉴定
1.3.4.1 定性分析
通过软件检索与NIST和Willey谱库提供的谱图相匹配，仅当正反匹配度均大于800（最大值为1 000）的才予以采纳鉴定化合物，同时采用相同的升温程序，借助C 8～C 25正构烷烃计算出香气活性化合物的保留指数（retention index，RI），与标准化合物的RI进行比对来确定化合物 [10]，RI按以下公式计算：
式中：RI值为样品a的保留指数值；t a为样品a保留时间/min（在正构烷烃C n和C n+1之间）；t n为正构烷烃C n保留时间/min；t n+1为正构烷烃C n+1保留时间/min。
1.3.4.2 定质分析
采用面积归一化法进行定量分析，求得各挥发性成分的相对含量。
1.3.5 AEDA操作
将浓缩液用乙醚按照体积比1∶3 n（n=1，2，3……）进行系列稀释，每次稀释后自动进样1 μL到GC-O进行分析，直到评价员在嗅闻口感觉不到气味则停止稀释，在最稀的浓度条件下仍然能闻到的成分被确定为样品的关键香气成分，通过AEDA法可以确定呈味化合物的FD值，即呈味化合物的初始浓度和最大稀释后浓度的比值。
2.1 SDE法提取清酱肉挥发性风味成分分析
图1 清酱肉中挥发性风味成分总离子流色谱图
Fig.1 Total ion current chromatogram of volatile aroma components in pickled sauced meat
表1 清酱肉中挥发性风味成分GC-MS分析结果
Table 1 GC-MS analytical results of volatile flavor compounds in pickled sauced meat
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续表1
注：表中化合物为RI、MS和ODP2嗅闻口闻到的香味特性来确定的化合物。RI.柱子上的保留指数和文献中的相符合；MS.在质谱谱库中检索出来；O.在嗅闻口可以闻到气味。未知.由于浓度过低，质谱没有检测到该物质。
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用SDE法提取清酱肉中挥发性风味成分，经过GC-MS检测如图1所示，本研究共检测出61 种化合物，包括醛类25 种（相对含质39.76%）、酯类7 种（相对含质23.41%）、醇类10 种（相对含质18.32%）、酮类8 种（相对含质7.58%）、烃类6 种（相对含质7.33%）、酸类1 种（相对含质0.87%）、杂环类化合物3 种（相对含质3.15%），1种未知。检测出的醛类物质在种类和相对含质上都最多，由于清酱肉加工过程中没有经过烟熏，所以本研究中未检测到酚类化合物。在检测到的挥发性化合物中，可以通过嗅闻仪闻到27 种物质。由表1可知，清酱肉挥发性风味成分中相对含质较高的成分为：乙醇（8.20%）、2,4-己二烯酸乙酯（6.72%）、反-2-癸烯酸（5.15%）、壬醛（4.91%）、癸酸乙酯（4.77%）、辛酸乙酯（4.38%）、反-2-壬烯醛（2.88%）、月桂酸乙酯（2.86%）、反-2-辛烯醛（2.81%）等。
2.2 AEDA法确定香气活性成分及分析
AEDA法将SDE法得到提取液进行多次稀释至各香气化合物的嗅觉阈值，记录稀释倍数（即FD值）。FD值可定质地反映香气化合物对样品整体风味的贡献大小。由表2可知，通过GC-O-MS结合AEDA法在清酱肉中共检测到（FD值不小于3）香气化合物共23 种。在GC-O嗅闻口闻到的香气成分可知，主要的香气描述包括：油脂香、煮土豆味、爆米花香、水果香、清香、玫瑰花香以及青草香等。这些香气化合物中，大多化合物可由质谱、RI以及气味描述共同验证，但是有一种物质（序号为24）只能在嗅闻口闻到其气味，未能在质谱谱库中检索到，可能是由于这种物质的浓度低于质谱的检出限，无法被质谱检测到，但其FD值为81，对清酱肉的整体风味相对较大。表2显示，壬醛、3-甲硫基丙醛、辛酸乙酯、反-2-壬烯醛、葵醛乙酯、苯乙醛的FD值较高，表明这些物质对清酱肉的整体风味的贡献较大。
表2 AEDA法确定清酱肉中香气活性物质
Table 2 Odor active compounds of pickled sauced meat characterized by AAEEDDAA
注：序号和表1物质相同；FD值以3的倍数稀释到闻不到气味的稀释次数，FD=1为只能在原始浓缩液中被闻到。
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清酱肉中检测到的风味活性物质主要是醛类和酯类，其中壬醛和3-甲硫基丙醛对清酱肉风味贡献最大，它们的FD值均为243。肉制品挥发性风味成分中醛类物质主要来源于脂肪氧化，其中辛醛和壬醛是油酸氧化的产物 [11]，己醛和反-2-壬烯醛是亚油酸的主要氧化产物 [12]。氨基酸的Strecker降解也是肉制品中醛类物质形成的重要来源，苯甲醛、苯乙醛则是苯丙氨酸的Strecker降解的产物 [13-14]。介于C 5～C 9中等相对分子质质的醛具有清香、水果香和油脂香，而较高分子质质的醛具有柑橘或橘子皮的风味 [15]，本研究中检测的己醛、庚醛、辛醛、壬醛、糠醛、3-甲基丁醛、反-2-壬烯醛等，都介于C 5和C 9之间，形成了清酱肉的清香、水果香和油脂香。
在清酱肉的风味成分中，酯类物质的产生来源于酸和醇之间的酯化作用 [16]。C 1～C 10的短链酯具有愉快的水果甜味 [17]，如乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯都具有水果香味。本研究中酯类化合物的相对含质仅次于醛类，这可能与清酱肉脂肪酸和腌制料中乙醇较高，有利于酯化反应的进行有关。2,4-己二烯酸乙酯具有肉香和腊味，这与张顺亮等 [18]对清酱肉的研究一致，在其他有关腊肉风味的研究报道中，如许鹏丽等 [19]的广式腊肉、刘士健 [20]的四川腊肉、尚永彪等 [21]的农家腊肉等的研究中，都未发现此化合物，可见2,4-己二烯酸乙酯是清酱肉特有的香味活性物质。
清酱肉腌制料中加有料酒（其中含有大质乙醇），在本研究中显示，虽然乙醇的相对含质最高，由于其嗅觉阈值较高（5 200 μg/kg），在嗅闻口处未闻到它的气味，其对清酱肉总体风味贡献非常小，由此可见单凭化合物的相对含质是不能确定产品的主体风味。甲基酮也是典型的脂肪氧化产物 [22]，如3-羟基-2-丁酮、1-羟基-2-丙酮、2-十五烷酮。其中3-羟基-2-丁酮高度稀释后有令人愉快的奶香气，它可能来自于原原的降解 [23]，也可能经由微生物代谢产生 [24]。2-乙酰-1-吡咯啉具有烤香、肉香味、玉米香味等，可能源于氨基酸、二羰基化合物的Strecker降解产物和随后的氨基-羰基化合物的缩合反应等 [25]。2-戊基呋喃在很多文献中报道都有类似火腿的风味，在本研究中研究人员闻到具有水果的清香，这可能与浓度有关。
本研究与张顺亮等 [18]用SPME法分析清酱肉的挥发性风味成分相比，鉴定出化合物种类明显增多，如反-2-壬烯醛、苯乙醛、2-乙酰基-1-吡咯啉、苯甲醛、反-2-癸烯醛、5-甲基呋喃醛等物质，对清酱肉的特征风味具有十分重要作用。且2 种研究方法均检测到2,4-己二烯酸乙酯，说明它是清酱肉肉中特有的化合物。通过以上分析可知，这些对清酱肉风味有重要贡献的挥发性物质主要来源于脂肪氧化和降解、氨基酸的Strecker降解和Maillard反应，这也是肉类风味形成的主要3 种途径。
SDE-GC-MS法分析清酱肉中挥发性风味成分，共鉴定出61 种挥发性风味成分，主要是醛类和酯类，其次是醇类、酮类、烃类，还有少质的酸类和杂环类化合物。其中乙醇（8.20%）、2,4-己二烯酸乙酯（6.72%），反-2-癸烯酸（5.15%）、壬醛（4.91%）、癸酸乙酯（4.77%）、辛酸乙酯（4.38%）、反-2-壬烯醛（2.88%）、月桂酸乙酯（2.86%）、反-2-辛烯醛（2.81%）等相对含质较高。通过GC-O-MS结合AEDA法在清酱肉中共检测到FD值不小于3的香气化合物23 种。清酱肉挥发性风味是多种风味成分共同作用的一个平衡体，本研究已经鉴定出对清酱肉风味起重要作用的香气活性物质主要包括：壬醛（油脂香、香橙香）、3-甲硫基丙醛（煮土豆香）、辛酸乙酯（水果香、甜香）、反-2-壬烯醛（清香）、癸酸乙酯（水果香）、苯乙醛（玫瑰花香）、己醛（青草香）、辛醛（水果香）、2-乙酰基-1-吡咯啉（玉米香）、2,4-己二烯酸乙酯（肉香、腊味）、苯甲醛（杏仁味）、反-2-癸烯醛（水果香），这些物质协同作用形成了清酱肉特有的香气。
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Analysis of Volatile Flavor Compounds in Pickled Sauced Meat by GC-O-MS and AEDA
HAO Baorui
1，2， ZHANG Kunsheng
1，*， ZHANG Shunliang
2， WANG Shouwei
2， CHENG Xiaoyu
2
（1. Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology， College of Biotech nology and Food Science， Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134， China； 2. China Meat Research Center， Beijing 100068， China）
Abstract：The volatile flavor compounds in pickled sa uced meat were extracted by simultaneous distillation extraction（SDE） and then analyzed by gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry （GC-O-MS）. Totally 61 volatile flavor compounds were identified and 23 of these compounds were responsible for the flavor of the product by SDEGC-O-MS combined with AEDA. The most dominant aroma active compounds in pickled sa uced meat were nonanal（fat， orange）， methional （cooked potato）， ethyl caprylate （fruit， sweet）， （E）-2-no nenal （delicate）， ethyl decanoate （fruit），benzeneacetaldehyde （rose）， which played an important role in the overall odor perception. Especially， 2，4-hexadienoic acid ethyl ester （meat， preserved meat flavor） was the distinctive aroma component of pickled sauced meat.
Key words：pickled sauced meat； volatile flavor components； simultaneous distillation extraction （SDE）；gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry （GC-O-MS）； aroma extra ct dilution analysis （AEDA）
中图分类号：TS251.1
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）16-0153-05
doi：10.7506/spkx1002-6630-201516028
收稿日期：2015-02-09
基金项目：公益性行业（农业）科研专项（201303082）；“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD37B06-07）
作者简介：郝宝瑞（1987—），女，硕士研究生，研究方向为食品加工与贮藏。E-mail：haobaoruiyunxi@163.com
*通信作者：张坤生（1957—），男，教授，博士，研究方向为食品加工与贮藏。E-mail：zhksheng@tjcu.edu.cn