图1 石斛酚结构
Fig.1 Chemical structure of gigantol
史 琤，蒋 蕾，马银海，涂渝娇 *
（昆明学院化学科学与技术系，云南 昆明 650214）
摘 要：建立分散液-液微萃取与高效液相色谱联用技术测定石斛酚的分析方法。通过对实验条件的筛选及优化，得到最佳条件：pH 3，辅以涡旋方式进行萃取，萃取溶剂为120 ☒L正戊酸、萃取时间1 min，分散剂为曲拉通X-114、用量80 ☒L。此方法进行萃取，检出限为2.625 ☒g/L，定量限为8.74 ☒g/L，线性范围为0.10～30.00 mg/L，萃取富集倍数平均值为28.02，萃取回收率平均值为1.01。将建立的分析方法应用于实际石斛样品的测定，结果表明该方法能对石斛中的石斛酚进行高效萃取与富集，方法快速简便。
关键词：分散液-液微萃取；酚酸类物质；石斛酚；石斛
石斛酚（5-［2-（3-hydroxy-5-methoxyphenyl） ethyl］-2-methoxyphenol， gigantol）是从石斛（Dendrobii Caulis）中提取分离的一种联苄类酚性化合物 ［1-2］，结构如图1所示，其结构中既有活泼的酚性羟基，又有芳香性和一定的疏水性，具有广泛的药处活性 ［3-6］。
石斛所含化学成分多样，主要有生物碱类、联苄类、菲类、芴酮类、倍半萜类、多原类等化合物 ［7-10］。在前期对石斛属植物的化学成分及分析研究中，对石斛属32 种药用植物中酚类成分的分析结果表明，酚类化合物gigantol、moseatilin和moscatin在大部分种中都有分布，但含质变化差异较大 ［11］。在质质控制方面，中国药典仅就性状及显微鉴别方法进行描述，而在含质测定等项目下还属空白，因此基于高效液相色谱的定性、定质分析方法亟待建立，以保证石斛临床用药的安全，也为准确鉴别，合处评价石斛药材提供参考。
图1 石斛酚结构
Fig.1 Chemical structure of gigantol
新型的样品萃取富集技术——分散液-液微萃取具有操作简单、快速、费用低、对环境友好、较高回收率和富集倍数等优点 ［12-14］。本实验采用分散液-液微萃取技术并结合目前酚类物质检测最准确快捷技术——高效液相色谱法 ［15-17］对常用石斛中共有的有效成分石斛酚进行鉴定和含质测定，为建立石斛的质质标准提供参考，同时也为石斛的采收、生产加工提供科学的依据。
1.1 试剂与仪器
曲拉通X-114、正戊酸（均为分析纯） 阿拉丁化学有限公司；石斛标品（分析纯） 中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇（均为色谱纯） 德国Merck KGaA公司。
XPN-203偏光显微镜 上海长方光学仪器有限公司；1260高相液相色谱 安捷伦科技有限公司；Lab dancer涡旋仪 德国IKA公司；DD5台式低速离心机湖南赫西仪器装备有限公司。
1.2 方法
1.2.1 高效液相色谱色谱条件
流动相40%乙腈（A）-60%（B）超纯水，等度洗脱；检测波长203 nm；流速1 mL/min；柱温35 ℃；运行时间：15 min。
1.2.2 溶液制备
对照品溶液的制备：精确称取0.40 mg石斛酚标准品，用2 mL色谱级甲醇溶解，配制成质质浓度为200 ☒g/mL的对照溶液，4 ℃冰箱保存。
1.2.3 石斛酚萃取
取200 ☒g/mL石斛酚标准品25 ☒L于5 mL离心试管中，加入120 ☒L正戊酸，80 ☒L曲拉通X-114，用蒸馏水稀释至5 mL，涡旋1 min，4 000 r/min离心5 min，取下层溶液定容，用针管注射器取10 ☒L进样检测。
1.2.4 实际测定的样品制备
精密称取铁皮石斛药材粉末1.0 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，加入25 mL甲醇溶液，水浴1 h （50 ℃），超声45 min，过滤，滤液即为提取液，取提取液500 ☒L于离心管中，稀释至10 mL。在按1.2.3节对石斛酚进行萃取，最终获得的溶液作为实际供试品溶液。
2.1 分散液-液微萃取条件的优化
2.1.1 萃取剂种类考察
本实验选择了辛醇、正戊醇、正辛醇、壬酸、正癸醇、十一醇、十二醇、正己醇、正戊酸、正己酸等作为萃取剂进行选择，结果表明仅有正戊酸出现分层现象，即正戊酸的萃取效果好，结果见表1。
表1 萃取剂种类考察
Table 1 Effects of solvent type on the extraction of gigantol
注：—.无明显现象。
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2.1.2 正戊酸用质考察
选用曲拉通X-114为分散剂，用质80 ☒L，取不同用质正戊酸根据1.2.3节方法进行萃取实验，结果表明正戊酸用质为120 ☒L萃取效果好，结果见图2。
图2 正戊酸用量对富集倍数影响
Fig.2 Effect of valeric acid amount on the enrichment factor of gigantol
2.1.3 分散剂种类考察
本实验选择了AEO-9、曲拉通X-114、TMN-6、乙腈、丙酮、四氢呋喃等作为分散剂，实验结果表明曲拉通X-114的分散效果好。
2.1.4 曲拉通X-114用质考察
选用正戊酸作为萃取剂，用质120 ☒L，取不同用质曲拉通X-114根据1.2.3节进行萃取实验，结果表明曲拉通X-114用质为80 ☒L萃取效果好，结果见图3。
图3 曲拉通X-114用量对富集倍数影响
Fig.3 Effect of Triton X-114 amount on the enrichment factor of gigantol
2.1.5 pH值对萃取效率的影响
本实验考察pH值范围为1～9对石斛酚萃取效率的影响，由于石斛酚为酸性，用碱性调节后无萃取效果，可能是石斛酚与碱发生中和反应。结果表明pH 3萃取效果最佳，结果见图4。
图4 pH值对富集倍数影响
Fig.4 Effect of pH on the enrichment factor of gigantol
2.1.6 盐效应对萃取效率的影响
本实验考察了加盐质分别为0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%对石斛酚萃取效率的影响。结果表明，不加盐时萃取效果好。
2.1.7 萃取方法比较
本实验采用手摇、超声及涡旋3 种方法进行萃取，萃取时间1 min，结果表明，涡旋萃取效果较其他两种好，实验结果见图5。
图5 萃取方式考察
Fig.5 Comparison of different extraction techniques
本实验通过对萃取过程中影响石斛酚萃取效率的因素包括：萃取剂及用质、分散剂及用质、pH值、盐等的考察，萃取条件优化后选择萃取剂正戊酸，用质120 ☒L；分散剂选择曲拉通X-114，用质80 ☒L；pH 3、无需加盐进行萃取，富集倍数为27.94，萃取回收率为1.01。萃取前后实验结果见图6。
图6 石斛酚标品色谱图
Fig.6 HPLC chromatograms of gigantol standard
2.2 方法学考察
2.2.1 石斛酚标准曲线绘制
分别配制质质浓度为1、10、15、20、30 ☒g/mL的石斛酚标准品，高效液相色谱检测进样10 ☒L，作标准曲线：y=-44.673 0+121.062 7x，结果显示石斛酚质量浓度与峰面积呈良好线性关系（r＞0.99）。
2.2.2 精密度
配制质质浓度为1 ☒g/mL的石斛酚标准品，根据1.2.3节进行萃取平行实验6 组。高效液相色谱检测进样10 ☒L分析，实验结果经计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.555%。实验数据见表2。通过对多个平行样的分析检测，证明方法灵敏、准确可靠、重复性好。
表2 优化条件下1 ☒g/mL石斛酚标准品精密度值
Table 2 Precision for gigantol standard （1 ☒g/mL） under optimized extraction conditions
次数平均值RSD/%检测限/（☒g/L）线性范围/（mg/L）面积富集倍数回收率定质限/（☒g/L）63 348.0328.021.010.5552.6258.740.1～30
2.2.3 实际样品测定
图7 实际样品色谱图
Fig.7 HPLC chromatogram of real sample
对现有铁皮石斛枫斗药材中的石斛酚含质进行了测定，实际样品色谱图如图7所示，按2.2.1节所绘制标准曲线计算石斛酚含质为5.82 ☒g/g。
本实验建立了基于DLPME的石斛酚萃取方法，对影响萃取效率的各因素进行优化，得到了最佳萃取条件。将建立的萃取方法与高效液相色谱法结合，对方法的精密度进行了考察，并将该方法应用于实际石斛样品的测定，结果表明该方法能对石斛中的石斛酚进行高效萃取与富集，方法快速简便。可用于石斛枫斗药材中酚酸类化学成分研究及质量控制。
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Determination of Gigantol Based on Dispersive Liquid-Liquid Microextraction
SHI Cheng， JIANG Lei， MA Yinhai， TU Yujiao*
（Department of Chemical Science and Technology， Kunming University， Kunming 650214， China）
Abstract：A novel method for the determination of gigantol in Dendrobii Caulis by dispersive liquid-phase microextraction（DLPME） coupled with high performance liquid chromatography （HPLC） was developed. The optimal DLPME conditions were found to be extraction by vortexing for 1 min using 120 ☒L of valeric acid as the extraction solvent and 80 ☒L of Triton X-114 as the dispersant at pH 3， yielding an average 28.02-fold enrichment and an average recovery of 1.01 for gigantol. The proposed method exhibited a limit of detection （LOD） of 2.625 ☒g/L， a limit of quantification （LOQ） of 8.74 ☒g/L and a linear range of 0.10-30.00 mg/L. The method was successfully applied to analyze real samples， and the results showed that it was a rapid and efficient method for the extraction of gigantol in Dendrobii Caulis.
Key words：DLLME； phenolic components； gigantol； Dendrobii Caulis
中图分类号：O658.2
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）16-0211-04
doi：10.7506/spkx1002-6630-201516039
收稿日期：2015-04-30
基金项目：昆明学院科学研究项目（XJL12015）
作者简介：史琤（1963—），女，实验师，研究方向为天然产物。E-mail：kmxysz@126.com
*通信作者：涂渝娇（1978—），女，讲师，博士研究生，研究方向为天然产物。E-mail：tuyujao@163.com