连翘叶中连翘苷和连翘酯苷A对食用油脂的抗氧化活性

（1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳 471023；2.三门峡出入境检验检疫局，河南三门峡 472000）

摘要：针对连翘叶中提取、分离和纯化的连翘苷和连翘酯苷 A进行研究，通过油脂抗氧化实验，分别以油脂的酸价值和过氧化值为参考指标，评价连翘苷和连翘酯苷 A的抗氧化活性和 VC、柠檬酸对连翘苷和连翘酯苷 A的协同增效作用。结果表明：制备得到纯度为 93%连翘苷和 92%连翘酯苷 A，连翘苷和连翘酯苷 A对猪油氧化作用均有一定的抑制作用，且随着剂量的增加，抑制效果越明显；其中，连翘酯苷 A对油脂氧化的抑制作用远优于连翘苷，效果与阳性对照 2,6-二叔丁基 -4-甲基苯酚接近； VC和柠檬酸对连翘苷和连翘酯苷 A的抗氧化作用均表现出协调增效作用。

油脂是人体必需的三大营养素之一，油脂以及含油丰富的食品在不适宜的贮藏条件下储存时间过长或使用不当，很容易发生酸败 [1]，导致人体必需脂肪酸和脂溶性维生素的破坏，营养价值降低 [2]，其本质是不饱和脂肪酸与氧之间发生的典型的自由基连锁反应 [3-5]。抗氧化剂能够防止或延缓食品成分发生氧化变质。合成抗氧化剂，如丁基羟基茴香醚、 2,6-二叔丁基 -4-甲基苯酚（ butylated hydroxytoluene， BHT）、没食子酸丙酯、特丁基对苯二酚等，耐热性较差，熔点及沸点都较低，经过加热特别是在油炸等较高温度下很容易分解或挥发，另外其还具有一定的毒性，甚至对人体有致畸、致癌作用 [6-7]。因此，开发利用天然抗氧化剂已成为当今食品科学的发展趋势 [8-13]。连翘是一种具有很高利用价值的药食两用植物，其提取物具有抗氧化、抑菌消炎、抑制病毒等活性作用 [14-19]。研究表明 [20]，连翘叶提取物有明显的抗氧化作用，连翘苷和连翘酯苷 A是其中两种主要的高效抗氧化功能组分。与连翘果实相比，连翘叶中连翘苷含量高于连翘果实约 10倍以上，连翘酯苷 A含量高于连翘果实 5～ 10倍 [21]。连翘作为一种天然食品防腐剂，其具有价格低廉，对食品风味影响小等特点，极具开发价值 [15]。本实验将对连翘苷和连翘酯苷 A在食用油脂中的抗氧化活性进行研究，以期为以后的应用开发提供一定的理论基础。

1 材料与方法

连翘叶： 2013年 7月采自河南豫西伏牛山地区连翘种植基地，经河南科技大学农学院侯小改教授鉴定为木犀科植物连翘（Forsythia suspensa（ Thunb.） Vahl）的干燥叶。

油脂：新鲜猪油为市售板油；连翘酯苷 A（批号： 111810-201405，纯度＞ 91.4%）、连翘苷（批号： 110821-201213，纯度＞ 95.3%）中国食品药品检定研究所； BHT（食品级）上海凯茵化工有限公司。

1260高效液相色谱仪美国安捷伦公司； BS 124S型万分之一天平、 PB-310S型分析天平赛多利斯科学仪器（北京）有限公司； 101-2型电热鼓风干燥箱上海实验仪器厂；恒温水浴锅常州国华电器有限公司； 723型紫外分光光度计上海第三分析仪器厂； TL00-200M蠕动泵无锡市天利流体工业设备厂。

将 40 g粉碎连翘叶用 1 200 mL体积分数 55%的乙醇 74℃浸提 50 min，过滤，提取 2次，合并滤液， 50℃减压浓缩回收乙醇，得浓缩液 665 mL，加入 35 mL无水乙醇，得到含体积分数 5%乙醇的连翘叶提取液。将连翘叶提取液用 2.6 cm× 25 cm的 AB-8树脂柱吸附，分别用 30%和 50%乙醇的洗脱，得到连翘叶提取物Ⅰ和连翘叶提取物Ⅱ。连翘叶提取物Ⅰ浓缩、静置沉淀；用 100%乙醇重新结晶 3次，得到纯的化合物Ⅰ。连翘叶提取物Ⅱ用水饱和正丁醇萃取 3次，回收正丁醇，干燥，得粗品；粗品用 30%的甲醇在 8 cm× 50 cm的 C 18反相硅胶柱层析分离，收集洗脱液，减压浓缩得纯的化合物Ⅱ。样品重复制备 5次。

色谱柱： Agilent Zorbax SB-C 18（ 4.6 mm× 250 mm， 5μm）；流动相：甲醇（ A） -水（含体积分数 0.2%冰醋酸）（ B），梯度洗脱： 0～ 3 min， 32%～ 32% A； 3～ 25 min， 32%～ 55% A； 25～ 30 min， 55%～ 55% A，测定波长 235 nm，流速 1.0 mL/min，柱温 30℃。

将新鲜购买的猪板油切成约 1 cm 3小块，用文火熬制，之后用几层纱布过滤以除去残渣，冷却后密封在- 20℃冰箱中保存。

酸价测定具体方法参照 GB/T 5009.37— 2003《食用植物油卫生标准的分析方法》 [22]。

油脂氧化试验采用 Schaal烘箱法 [23]，连翘苷及连翘酯苷 A按照猪油质量的 0.02%、 0.04%、 0.08%、 0.12%分别加入到 50 g油脂中，空白油样作为对照， 0.02%的 BHT做阳性对照，置于 65℃烘箱中，每隔 12 h搅拌一次并交换它们在烘箱中的位置，定时（ 0、 5、 10、 14、 18、 22 d）检测每份油样中的酸价和 POV。

精确称取 10 mg的 VC、柠檬酸、连翘苷和连翘酯苷 A，将 VC和柠檬酸分别与连翘苷和连翘酯苷 A混合溶解：连翘苷+ VC、连翘苷+柠檬酸、连翘酯苷 A+ VC和连翘酯苷 A+柠檬酸，将抗氧化剂增效组分别溶解到 50 g猪油中，置于 65℃烘箱中，每隔 12 h搅拌一次并交换它们在烘箱中的位置，定时（ 0、 5、 10、 14、 18、 22 d）检测每份油样中的酸价和 POV。

2 结果与分析

制得 0.128 g化合物Ⅰ和 2.55 g化合物Ⅱ，化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的提取率分别为 0.32%和 6.39%。经高效液相方法鉴定，化合物Ⅰ和化合物Ⅱ分别为连翘苷和连翘酯苷 A，结果见图 1，通过外标法检测连翘苷和连翘酯苷的纯度分别为 93%和 92%，此样品作为油脂抗氧化活性使用。

图1 连翘苷和连翘酯苷A混标（a）、连翘酯苷A样品（b）、连翘苷样品（c）的高效液相色谱图
Fig.1 Chromatograms of forsythiaside and forsythin in mixed standard solution (a), purified forsythiaside A (b), and purified forsythin (c)

图2 不同剂量连翘苷（a）和连翘酯苷A（b）对猪油酸价的影响
Fig.2 Effect of different doses of forsythin (a) and forsythiaside A (b) on acid value of lard

连翘苷抑制猪油氧化作用的酸价如图 2a所示，连翘苷对猪油的氧化酸败具有一定的抑制作用，总体趋势为随着时间的延长，猪油体系中酸败越明显；随着连翘苷添加量增强，连翘苷抑制酸败的作用越强。结果表明，氧化实验的前 10 d，除空白组外各组间的变化差异不大； 10 d后各剂量连翘苷表现出抗氧化差异逐渐明显，但其效果不及阳性对照 BHT（P＜ 0.01）。连翘酯苷 A对猪油的抑制效果见图 2b，各组表现趋势与连翘苷相似，抗酸败作用呈现剂量依赖性， 0.12%连翘酯苷 A具有较强的抗氧化功效，效果与 0.02% BHT阳性对照相当（P＞ 0.05）。比较连翘苷和连翘酯苷 A抗酸败作用可以看出，连翘酯苷 A抗酸败活性强于连翘苷活性。

图3 不同剂量连翘苷（a）和连翘酯苷A（b）对猪油POV的影响
Fig.3 Effect of different doses of forsythin (a) and forsythiaside A (b) on POV value of lard

油脂暴露在空气中易氧化形成自由基，自由基继续与氧反应生成自由基和过氧化物，自由基的链式反应再使油脂继续氧化，可以测定油脂的 POV来评价其氧化程度， POV越大，氧化程度就越高。如图 3a所示，连翘苷 POV与酸价的变化趋势相似，随着时间的延长， POV不断增加，最大添加量时对油脂抗氧化活性效果最强；随着添加量连翘苷的增大，抗氧化活性具有剂量效应关系；但与阳性对照 BHT相比，连翘苷所显示的 POV增加速率较快，抗氧化能力远不及 BHT（P＜ 0.01）。

如图 3b所示，连翘酯苷 A的 POV也是随着加热时间的延长而逐渐增加，初期（＜ 10 d）各处理条件样品的过氧化值变化均无明显差异，可能是因为氧化反应处于诱导期，自由基初步生成，过氧化物尚未大量生成，表现为过氧化值变化不明显。 14 d以后过氧化物逐渐增加，呈现链式反应的加速期，尤其是空白对照组过氧化值增加加快；连翘酯苷 A对猪油的氧化具有较强的抑制作用，当添加量为 0.12%时与 0.02% BHT抗氧化能力较为接近。

从图 2、 3的结果比较还能看出，连翘酯苷 A抑制油脂氧化的作用明显相比连翘苷要强很多，即连翘酯苷 A的抗氧化活性具有明显的优势。

某些有机酸与抗氧化剂混合组成复合抗氧化剂在发挥抗氧化作用时，各组分间可能发生一系列复杂的反应，表现协同增效的作用 [24]。本研究选用柠檬酸和 VC为增效剂，结果如图 4a、 4b所示，在选用的剂量水平上，复合抗氧化剂的效果分别优于对应单独组分（P＜ 0.05），在反应前期，增效剂柠檬酸和 VC的加入没有明显抑制油脂酸价和 POV的增大，而在反应后期增效剂的抑制作用则明显加强；两者比较而言， VC对连翘苷和连翘酯苷 A的增效作用较强，而柠檬酸的增效作用较弱。

图4 协同抗氧化作用对猪油酸价（a）和POV（b）的影响
Fig.4 Synergistic effect of forsythiaside A and forsythin with VC or citric acid on acid value(a) and POV value (b) of lard

抗氧化剂的混合使用较单一使用者更为有效，能够起到相互协同促进的作用，可能的原因是： VC本身就是一种重要的自由基清除剂，它通过逐渐供给电子而转变成半脱氢抗环血酸和脱氢 VC以达到清除活性氧自由基。 VC也能溶于油脂中微量氧发生氧化还原反应从而避免油脂的自动氧化。另外， VC作为酸性物质，能够钝化油脂中促自动氧化的金属离子，从而对连翘苷和连翘酯苷 A的抗油脂氧化产生协同增效作用。因此也可以说 VC既是抗氧化剂又是增效剂。柠檬酸本身不具有抗氧化性，但是它也属于酸性物质，它对抗氧化剂的增效作用是因为其能与油脂中的金属离子发生螯合作用，降低了这些离子的有效浓度，而这些金属离子能够缩短链式反应及引发期的时间，加快脂类的氧化，柠檬酸的螯合作用使这些金属离子失去促油脂自动氧化的能力，以表现出对连翘苷和连翘酯苷 A的协同增效作用 [25-26]。

3 结论

从酸价和 POV两个油脂氧化程度的指标来看，连翘苷和连翘酯苷 A对油脂均具有抗氧化作用，但连翘酯苷 A抗氧化能力更强。连翘苷和连翘酯苷 A是从连翘叶中提取制备的天然活性化合物，较人工合成的抗氧化剂（如： BHT）安全性高，毒副作用小；相比较而言，连翘酯苷 A更适合用于开发天然抗氧化剂。

在油脂抗氧化体系中，不同添加量的连翘苷及连翘酯苷 A均对猪油有一定的抗氧化作用，而且表现出剂量依赖性，其中连翘酯苷 A的抗氧化效果更为显著。 VC和柠檬酸对连翘苷和连翘酯苷 A的抗氧化作用都具有明显的协同增效作用，混合使用抗氧化剂对猪油的抗氧化效果明显优于单一抗氧化剂的使用效果。总之，连翘酯苷 A的抗氧化活性明显高于连翘苷，作为天然抗氧化剂，其又具有好的安全特性，在食品、医药领域有开发利用的价值，连翘酯苷 A的体内抗氧化活性有待于进一步探究。

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Antioxidant Activity of Forsythin and Forsythiaside A from Forsythia suspensa Leaves on Edible Oils

QIU Zhijun 1,2 , YUAN Jiangfeng 1 , ZHANG Guoqing 2 , LIU Shengnan 2
(1. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China; 2. Sanmenxia Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Sanmenxia 472000, China)

Abstract： This study was focused on the antioxidant activity of forsythin and forsythiaside A isolated and purified from leaves of Forsythia suspensa . and the synergistic effect of the two compounds with vitamin C and citric acid as evaluated by acid value and peroxide value (POV) of lard. The results showed that forsythin with purity of 93% and forsythiaside A with purity of 92% were obtained and that both of these compounds had concentration-dependent inhibitory effects on lipid oxidation in lard. The inhibitory effect of forsythiaside A was close to that of the positive control 2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) but the inhibitory effect of forsythin on lipid oxidation was far weaker than that of forsythoside A. Both vitamin C and citric acid exhibited remarkable synergistic antioxidant activity with forsythin and forsythiaside A.

基金项目：国家自然科学基金河南人才培养联合基金项目（U1404307）；洛阳市科技攻关项目（1401076A）

作者简介：邱智军（1978—），男，副教授，博士，主要从事活性成分的分析和预测研究。E-mail：qiuzj2003@163.com

连翘叶中连翘苷和连翘酯苷A对食用油脂的抗氧化活性

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

3 结论