李雨露 1，刘小如 1，李红艳 1，范亚苇 1，胡蒋宁 1，李 静 1，王红明 2，邓泽元 1,2,*
（1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.南昌大学高等研究院，江西 南昌 330031）
摘 要：采用差示扫描量热仪和 X射线衍射仪对不同水分含量的糊化莲子淀粉的回生特性进行研究。结果表明，水分含量是影响淀粉回生的重要因素，其过高或过低对莲子淀粉的老化都有一定的抑制作用；当水分含量 70%时，莲子淀粉最易重结晶，体系老化程度最高；分子动力学模拟系统探讨了不同水分含量淀粉老化模型的分子构象、水分子扩散系数、非共价键相互作用等参数的变化，发现在水分含量 70%体系中，直链淀粉分子结构更趋于有序化、非共价键相互作用更强，这可在微观层面解释莲子淀粉回生的机理。
关键词：莲子淀粉；水分含量；老化；分子动力学
莲子是睡莲科莲属（Nelumbo nucifera Gaertn）植物的果实或种子，是我国重要的特产经济资源，位于江西的广昌和石城县有着“中国白莲之乡”的美称 [1]。莲子具有丰富的营养成分及生理活性成分 [2-4]，是药食两用的滋补佳品，所以通过加工提高其附加值是产业发展的重要一环。但淀粉类食品易于回生，影响产品的食用品质。卓晓红 [5]的研究结果表明，天然的莲子淀粉中包括直链淀粉和支链淀粉，其中直链淀粉的含量达 42%，高直链淀粉含量使得莲子制品更易回生，其硬度、口感、透明度、黏弹性等功能特性发生显著变化，严重影响到加工后莲子产品的品质。
淀粉的回生是一个淀粉分子从无序到有序的过程。完全糊化的淀粉，当温度降到一定程度之后，由于分子热运动能量的不足，体系处于热力学非平衡状态，分子链间借氢键相互吸引与排列，使体系自由焓降低，最终形成结晶 [6]。影响淀粉回生特性的主要因素有水分含量、温度、分子组成以及糖类和脂类等物质 [7-10]。水作为一种增塑剂，它影响糊化后淀粉分子链的迁移，决定淀粉分子链重新聚合的速率。水分含量较低时，淀粉分子链的迁移困难；水分含量较高时，虽然淀粉分子链迁移速率提高，但由于浓度的降低，淀粉分子交联缠绕和聚合有序的机会减少。周国燕等 [11]的研究表明，水分含量 60%～ 75%时，淀粉最易发生老化。
分子动力学（ molecular dynamics， MD）模拟是在评估和预测材料结构和性质方面模拟原子和分子微观领域的相互作用的重要方法，通过计算机对原子核和电子所构成的多体体系中的微观粒子之间相互作用和运动进行模拟，按照统计物理的方法计算可得出物质的结构和性质等宏观性能 [12]。分子模拟在淀粉研究中已有十分广泛的应用，张革新等 [13]运用分子动力学的方法模拟了直链淀粉分子的结构； Yu Haibo等 [14]运用分子动力学方法研究了甲基效应对直链淀粉和纤维素的稳定性和溶解自由能的影响； Sankri等 [15]模拟了离子液体对直链淀粉的增塑，发现咪唑类离子液体对淀粉有很好的增塑作用； Xie等 [16]运用分子动力学的方法模拟研究了单臂碳纳米管与直链淀粉的非共价键结合作用。
虽然已有许多报道了关于水分对淀粉老化的影响，但对其微观结构变化机理研究较少，本实验拟采用差示扫描量热仪（ differential scanning calorimetry， DSC）和 X射线衍射仪（ X-ray diffractometer， XRD），研究不同水分含量对莲子淀粉老化的影响上，通过分子动力学模拟不同水分含量直链淀粉分子构象参数，以及分子之间的非共价键作用，从分子微观层面探讨淀粉老化机理，以期为莲子淀粉的加工和延缓淀粉制品的回生提供科学数据。
1.1材料
新鲜莲子 江西广昌白莲基地。
1.2仪器与设备
SXT-06索氏提取器 上海洪纪仪器设备有限公司； DF101B数显集热式搅拌器 金坛市大地自动化仪器厂； FD-1真空冷冻干燥机 北京德天佑科技发展有限公司； 200F3-DSC差示扫描量热仪 德国 Netzsch公司； DI SYSTEM X射线衍射仪 英国 Bede科学仪器有限公司。
1.3方法
1.3.1莲子淀粉制备
采用水洗法提取莲子淀粉。取去壳通芯的新鲜莲子，与蒸馏水按体积比 2∶3混合、打浆，过 100目筛，将滤液静置沉降 6 h，去除上清液和底部淀粉杂质，加入蒸馏水搅匀，静置过夜，倒掉上清液，收集沉降物，重复操作 3次后收集沉淀，并于 45℃鼓风干燥箱干燥，得淀粉粗品。
将粗制莲子淀粉粉碎过 40目筛，用乙醚在索氏抽提器中回流 12 h，脱去脂肪。用质量分数为 1% NaCl溶液洗 3次，再用 0.01% NaCl溶液洗一次脱去蛋白质。最后用蒸馏水洗 3次后， 45℃烘干至恒质量。
1.3.2淀粉老化样品（ retrogradated starch， RS）制备
将莲子淀粉样品与去离子水按一定比例，配制成淀粉质量分数分别为 20%、 30%、 40%、 50%的溶液，于室温下在磁力搅拌计上搅拌 2 h，使两者充分混合。然后将混合液在沸水浴上加热糊化 30 min，并不时摇动，然后取出冷却至室温并于 4℃贮存放置 14 d。将老化后的样品真空冷冻干燥，经粉碎机粉碎后过 100目筛备用。
1.3.3热力学分析
用液体坩埚称取 3 mg淀粉老化样品，加入 6μL去离子水，压片密封，室温下平衡 24 h。然后放入差示扫描量热仪中以 5℃ /min扫描速率从 20℃升温到 90℃，观察样品老化峰以及对应温度。以空坩埚作为空白对比，以氮气作为载气，流速为 20 mL/min。结果由 Proteus Analysis 4.8软件进行分析，记录和计算起始糊化温度（T 0）、峰值糊化温度（T p）、终止温度（T c）及热焓值（ ΔH）。
1.3.4 X射线衍射分析
采用 X射线衍射仪测定淀粉老化样品的结晶度。衍射条件 40 kV， 40 mA， XRD扫描范围为 5°～ 35°（ 2θ），扫描速率为 2°/min。
通过软件 Origin 9.0分析 X射线衍射图谱，对晶体峰和非晶峰进行面积积分，以晶体峰面积与衍射峰总面积之比计算淀粉相对结晶度。
1.3.5分子动力学模拟
使用 MD模型来模拟不同水分含量对直链淀粉老化的影响。采用 Materials Studio 4.4软件建立直链淀粉模型，每条直链淀粉的葡萄糖单元数目为 10，整齐排列 9条直链淀粉分子片段，能量最小化获得最合理构型。然后采用 Gromacs 4.0软件建立盒子，通过调节盒子大小来调节体系溶剂分子数目，加入水分子填满整个盒子，此时建立了水分含量为 50%、 60%、 70%和 80%的淀粉溶液模型。建立周期边界条件和能量最小化后，进行平衡，最后进行分子动力学模拟。
模拟参数：采用 GROMOS 53a6力场，积分方法为半步蛙跳法， LJ势能截断， PME算法处理静电相互作用， LINCS算法约束成键相互作用，范德华力截断半径为 14 ☒。先从 293 K（ 20℃）升温 3 ps到 393 K（ 120℃），保持 393 K时长 2 ps，然后降温到 277 K（ 4℃），总模拟时间为 4 ns。
对模拟结果进行分析，包括溶液可及表面积（ solvent accessible surface area， SASA）、直链淀粉回转半径（ radius of gyration，R g）、分子结构密度分布、水分子扩散系数及非共价键相互作用。
溶液可及表面积表示分子表面与溶液接触的面积，用来衡量分子构象变化，此分析主要通过分析指令 g_sas来完成。
分子的回转半径是指分子微分质量假设的集中点到转动轴间的距离，用来度量结构的紧密度，此分析主要通过分析指令 g_ryrate来完成。
分子结构的密度分布是指分子沿着盒子主轴方向的密度分布，用来度量结构的紧密度，此分析主要通过分析指令 g_density来完成。
分子动力学模拟求解扩散系数D主要是通过爱因斯坦关系式求得：
式中：r（t）代表t时刻分子的坐标；r（ 0）代表初始坐标。
均方位移（ mean square displacement， MSD）随模拟时间变化的函数如下：
由式（ 1）和式（ 2）可得到扩散系数D，如下式表示：
式中：m为均方位移曲线对时间t的斜率。即均方位移曲线的斜率m越大，水分子的扩散系数越大。这部分的分析主要通过分析指令 g_sdf来完成。
非共价键作用能主要包括范德华力能（E vdw）、静电力能（E ef）和氢键能（E h-bond），这部分的分析主要通过分析指令 g_energy来完成。
1.4数据分析
所有实验均重复 3次，采用 SPSS 19.0统计分析软件对实验数据进行方差分析和显著性检验，图表绘制用 Excel及 Origin完成。
2.1莲子淀粉的热力学特性
淀粉回生形成的晶体结构重新熔融，则必需外加能量。因此，老化后的淀粉热焓在 DSC分析图谱中为向上的吸热曲线，且吸热峰面积所表示的晶体融化的热焓焓变（ΔH）与淀粉老化程度成正相关，因而 DSC可作为淀粉老化程度的指标 [17]。 DSC测定结果见表 1。当水分含量较低（ 50%）时，老化淀粉的熔融热焓较低，随着水分含量的增加，焓变值增大，在水分含量 70%时达到最大值（ ΔH =8.16 J/g），而当水分含量继续增加达到 80%时，淀粉的老化焓变值反而降低。结晶融化的峰值温度和终止温度均随着水分含量的增高而降低。
表1 水分含量对老化淀粉热力学性质的影响
Table1 Effect of water content on thermal properties of RS
注：T 0.起始温度；T c.峰值温度；T p.终止温度；ΔH.糊化焓；同列小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。
水分含量/%T 0/℃T c/℃T p/℃ΔH/（J/g）5049.33±0.28 a56.74±0.17 a69.90±1.26 a6.24±0.11 c6048.24±0.07 b56.28±0.22 b68.39±0.89 a6.87±0.05 b7047.33±0.08 c55.94±0.21 b66.36±0.77 b8.16±0.39 a8048.63±0.71 ab53.76±0.14 c65.57±0.48 b5.66±0.24 d
2.2莲子淀粉晶体特性
糊化后晶体结构消失，在一定条件下存放，则会产生自组织现象，形成结晶，结晶度与淀粉的老化程度成正相关，因而可作为淀粉老化程度的指标 [18]。莲子淀粉的 X射线衍射图见图 1和图 2。从图 1可以看出，天然的莲子淀粉既具有谷类淀粉的 A型特征峰 15°、 23°，又具有块茎类淀粉的B型特征峰 5.6°、 17°、 22°、 24°，表明莲子淀粉颗粒的结晶结构是C型。天然莲子淀粉结晶度为 37.2%。
图1 天然莲子淀粉的X射线衍射图谱
Fig.1 X-ray diffraction patterns of native lotus seed starch
从不同水分含量的老化莲子淀粉 X射线衍射图（图 2）可以看出，老化的莲子淀粉结晶峰型发生改变，只在 17°处有较明显的特征峰，形成了B型结晶 [17]。结晶峰型的改变主要的原因是体系中支链淀粉的长期回生引起的 [19]。随着水分含量从 50%增加到 70%，老化淀粉的结晶度也随之增大，说明老化程度加深，随后水分含量继续增加（ 80%），淀粉结晶度反之降低。
图2 不同水分含量老化淀粉的X射线衍射图谱
Fig.2 X-ray diffraction patterns of RS with different water contents
2.3分子动力学模拟分析
2.3.1直链淀粉分子模拟参数分析
在分子模拟中，模拟的体系必须处于平衡状态才能够得到体系准确的性质，故要求模拟时间必须足够长。判断分子动力学模拟体系达到平衡的标准有能量平衡，从图 3a可以看出，体系的总能量和总势能在升温过程中先降低再升高，又在降温过程中急剧下降并迅速达到平衡，并且总能比初始状态更低，说明体系已达到平衡，并处于相对稳定状态。图 3b曲线表示直链淀粉周围 SASA随时间的变化， SASA先迅速降低再平缓达到相对稳定值， SASA的减小说明模拟“老化”过程中淀粉链的分子构象趋于有序化 [20]。图 3c曲线表示直链淀粉回转半径随时间的变化，可以看出随着模拟时间的延长，直链淀粉的回转半径减小，说明分子结构更加紧密、更趋于有序化。图 3d曲线表示直链淀粉的密度分布情况，曲线越窄越高，局部最大密度值越大，说明分子密度分布越集中，分子结构越紧密。
图3 水分含量7700%体系分子动力学模拟参数
Fig.3 MD simulation parameters of system with 70% water content
直链淀粉链的溶剂可及表面积变化越大，说明分子的有序化程度越高 [9]，从表 2可以看出，水分含量 70%时Δ SASA达到最大值，说明此模型老化程度最高，这与 DSC和 X衍射获得的淀粉老化规律数据相符。表 2中水分含量 70%的淀粉老化体系回转半径最小、最大局部密度最大，说明分子结构紧密度最高。综上所述，老化体系分子结构紧密度为： 70%＞ 60%＞ 50%＞ 80%。
表2 不同水分含量的老化淀粉结构参数变化
Table2 Changes in structural properties of RS with different water contents
水分含量/%ΔSASA/nm 2R g/nm最大密度/（kg/m 3）50-59.12±0.70 c1.410±0.003 b521.25±7.04 c60-61.80±0.26 b1.412±0.003 b580.26±6.06 b70-64.29±1.64 a1.387±0.002 c645.59±3.83 a80-57.91±0.96 c1.438±0.004 a425.26±2.17 d
2.3.2水分子的扩散系数
图4 不同水分含量直链淀粉模型的水分子均方位移
Fig.4 Mean square displacement of water molecules in amylose models with different water contents
由图 4可知，水分含量 70%的直链淀粉模型的水分子 MSD曲线的斜率最小，水分含量 80%的直链淀粉模型的水分子 MSD曲线的斜率最大，水分含量 50%和 60%的直链淀粉模型的水分子MSD曲线斜率介于两者之间。由方程式（ 3）计算可得水分子的扩散系数D大小为： 80%＞ 50%＞ 60%＞ 70%。
2.3.3非共价键作用
在不同水分含量体系中，直链淀粉分子与分子之间的非共价键作用，即范德华力能、静电力能、氢键个数的变化见表 3。数据表明范德华力能和静电力能在淀粉链回生过程中亦显著增强，并为负值，氢键个数显著增多，这表明这 3组力促进淀粉链有序化过程，并主导维持直链淀粉 -水体系低能态稳定性，且范德华力能变化远远大于静电力能，这与 Xie等 [16]观点一致，他们认为范德华力能是导致高聚物有序化的主导驱动力。在水分含量 70%的体系中，非共价键能变化量最大、分子间形成氢键个数最多，即表明 70%水分子含量更有利于直链淀粉分子有序化构象的保持。
表3 直链淀粉分子间非共价键作用
Table3 Non-covalent interaction between amyloses
注：ΔE vdw.平均每条直链淀粉链范德能变化；ΔE ef.平均每条直链淀粉链静电能变化；N H-bond.平均每条直链淀粉链形成氢键个数。
水分含量/%ΔE vdw/（kcal/mol)ΔE ef/（kcal/mol)N H-bond/对50-197.13±3.25 c-34.03±1.03 c33.85±0.09 bc60-214.46±1.35 b-34.39±0.74 bc34.09±0.15 ab70-226.30±1.69 a-36.10±0.58 a34.37±0.08 a80-189.55±5.72 d-35.60±0.65 ab33.64±0.23 c
3.1热力学性质
由于不同淀粉的组成不同，其老化峰的起始温度、峰值温度及热焓值也不同，糊化的淀粉经贮存后发生不同程度的老化，在 DSC曲线上可以对老化程度进行定量分析。因此 DSC是研究淀粉老化特性的重要手段。当水分含量从 50%增加到 70%时，淀粉分子迁移速率加快，分子间重结晶的机率增加，因而回生程度增大。参与重结晶的水分子数量增多，晶体融化温度降低。当水分含量达到 80%时，虽然淀粉分子的迁移速率增加，但是由于浓度降低，淀粉分子之间的交联机会减少，因而回生程度反而降低。同时由于参与结晶层的水分子数量增多，重结晶的融化温度也降低 [21]。
3.2淀粉老化过程中晶体结构的变化
淀粉老化的结果是糊化后的无序结构缔合形成了结晶，结晶程度和晶体结构的紧密度反映了淀粉的老化程度。在水分含量 70%的老化体系里，结晶程度最高、溶液可及表面积变化量最大、回转半径最小、局部密度最大，这些数据一致表明此时直链淀粉的分子结构最紧密，最趋于有序化，因此当水分含量 70%时淀粉的老化程度最高。产生这种现象的原因还需从微观的分子间的相互作用来阐释。
3.3非共价键作用在淀粉老化中的作用
一般可以认为，水分子的扩散系数越大，越容易渗透到直链淀粉的内部，一方面，可以通过增大直链淀粉链与链之间的物理距离来减小淀粉分子的羟基之间形成氢键；另一方面，渗透到直链淀粉内部的小分子的羟基也可以与淀粉之间形成氢键，这同样减小了淀粉分子之间形成氢键的概率 [22]。由此可知，水分子扩散系数D越小，直链淀粉间更容易形成氢键，则淀粉的老化程度越高。
当水分含量从 50%增加到 70%时，水分子的扩散系数D减小，说明淀粉分子间形成的氢键数增多，因而直链淀粉老化程度加剧。可能的原因是淀粉逐渐由非玻璃态转变为玻璃态，水分子对淀粉分子的束缚作用增强，变得不易扩散，导致水分子的扩散系数显著减小。当水分含量继续增加达到 80%时，水分子的扩散系数D反之增大，说明水分子更易渗透到直链淀粉内部，阻碍直链淀粉分子间氢键的生成，因而淀粉老化程度降低。淀粉的回生是由分子间的非共价键作用引起的，其中 Chung等 [23]认为范德华力是聚合物结晶的主要驱动力，因为范德华力导致结构的有序化。当水分含量 70%时，淀粉分子间的非共价键相互作用最强，淀粉的老化程度最高。
本实验采用差示扫描量热、 X射线衍射和分子动力学模拟方法，从宏观和微观层面研究水分含量对莲子淀粉老化特性的影响。研究表明：随着水分含量的增加，老化淀粉的结晶熔融峰值温度和终止温度均降低。老化淀粉的老化热焓、结晶度、淀粉分子结构的紧密程度和分子间非共价键作用都随水分含量的增加先增大后减小。宏观和微观结果均表明水分含量 70%的老化莲子淀粉体系中，直链淀粉的分子构象更趋于有序化，老化程度更高。这是由于此时水分子的扩散系数减小，不容易渗透到直链淀粉内部，使得淀粉分子间更容易生成氢键，相互缔合而形成结晶。由此可知，调节淀粉制品的水分含量来延缓淀粉老化是可行的方法之一。
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Effect of Water Content on the Retrogradation of Lotus Seed Starch and Molecular Dynamics Simulation Analysis
LI Yulu
1
, LIU Xiaoru
1
, LI Hongyan
1
, FAN Yawei
1
, HU Jiangning
1
, LI Jing
1
, WANG Hongming
2
, DENG Zeyuan
1,2,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China;
2. Institute for Advanced Study, Nanchang University, Nanchang 330031, China)
Abstract： The effect of different water contents on the retrogradation of lotus seed starch was studied by differential scanning calorimetry (DSC) and X-ray diffractometer (XRD). The experimental results indicated that water content was a significant factor affecting the retrogradation of starch.and that the aging of starch was inhibited when the water content was too high or too low. The lotus seed starch was most easily recrystallized with a water content of 70% , and the degree of retrogradation was highest. The changes in molecular conformation parameters, water diffusion coefficient, and noncovalent interaction of aging models with different water contents were analyzed using molecular dynamic (MD) simulation method. It was shown that molecular structure of amylose with water content of 70% tended to be more orderly arranged and had stronger non-covalent interaction. These observations could explain the mechanism of retrogradation of starch at the microcosmic level.
Key words： lotus seed starch; water content; retrogradation; molecular dynamics (MD)
中图分类号： TS231
文献标志码： A 文章编号：1002-6630（2015）17-0083-05
文章编号：1002-6630（2015）17-0083-05
doi：10.7506/spkx1002-6630-201517016
收稿日期：2014-12-02
基金项目：中国博士后科学基金项目（2014T70618）；国家自然科学基金面上项目（31301578）
作者简介：李雨露（1991—），女，硕士研究生，研究方向为天然产物与功能食品。E-mail：sanmu713@163.com
*通信作者：邓泽元（1963—），男，教授，博士，研究方向为天然产物与功能食品。E-mail：dengzy@ncu.edu.cn