眉山泡菜中乳酸菌的分离鉴定

（西南大学食品科学学院，重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆市农产品加工技术重点实验室，重庆 400715）

摘要：目的：分析眉山泡菜的基本数据和乳酸菌的菌种构成。方法：从眉山市采集泡菜12 份，测定pH值、总酸度、盐度、乳酸菌计数，用16S rRNA序列分析法鉴定菌种。结果：样品pH值的范围是3.37～3.89，总酸度的范围是0.65～0.92 g/100 g（以乳酸计），盐度的范围是4.16% ～5.28% （以NaCl计），MRS和M17乳酸菌计数分别是1.71～6.33、1.33～5.78（lg（CFU/g））。总酸度对乳酸菌计数影响最大。共分离鉴定出16 株乳酸菌： Lactobacillus fermentum （2 株）、 Lactobacillus plantarum （3 株）、 Lactobacillus brevis （2 株）、 Lactobacillus acidophilus （1 株）、 Lactobacillus casei （1 株）、 Lactobacillus pentosus （1 株）、 Lactobacillus delbrueckii （1 株）、 Lactococcus lactis （3 株）、 Pediococcus pentosaceus （2 株）。结论：眉山泡菜中乳酸菌存在多样性，实验结果为工业发酵生产泡菜积累了菌株。

眉山市有得天独厚的自然条件，岷江和青衣江纵贯全境，土壤肥沃，是重要的蔬菜生产基地，也是四川泡菜重要的发源地，有近4 000a 制作泡菜的历史，被授予“中国泡菜之乡”的称号 [1-2] 。

泡菜的制作是将新鲜蔬菜洗净，装入泡菜坛密封，浸渍在食盐水中厌氧发酵，食盐水的作用是将蔬菜汁液渗出，自然环境中的乳酸菌利用汁液中的可溶性成分（主要是糖类和含氮物质）代谢产生酸性物质和风味成分，赋予泡菜独特的酸脆鲜香风味 [3-4] 。泡菜中蕴藏着丰富的天然乳酸菌，它们对于泡菜风味品质的形成发挥关键作用，同时乳酸菌也是益生菌，对人体健康有多种保健功效。陈功 [5] 、汪红 [6] 、王柱 [7] 等对四川泡菜中的乳酸菌进行了比较系统的分离鉴定，发现地区、气候环境、制作习惯等都会造成乳酸菌菌种构成的差异，总的来说，还需要开展更多更广泛的分离鉴定工作，以拓展对乳酸菌多样性的认识，积累丰富的菌种资源，为丰富工业菌种和益生菌种奠定基础。

本研究以眉山市的各种泡菜作为样品，对其中的乳酸菌进行分离、纯化和鉴定，分析菌种构成的多样性，为泡菜发酵产业积累菌种。

1 材料与方法

从眉山市各个地区采集泡菜样品12 份，其中泡豇豆样品7 份，编号为D1～D7，泡萝卜样品5 份，编号为L1～L5，样品装入冰盒中迅速带回实验室，具体信息见表1。

MRS培养基 [8] ：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母粉5 g、葡萄糖20 g、K 2 HPO 4 2 g、柠檬酸二铵2 g、乙酸钠5 g、吐温-80 1 mL、MgSO 4 ·7H 2 O 0.58 g、MnSO 4 ·4H 2 O 0.25 g、琼脂粉15 g、蒸馏水1 000 mL，pH 6.6，121 ℃灭菌15 min。

M17固体培养基 [9] ：胰蛋白胨5.0 g、牛肉膏5.0 g、大豆蛋白胨5.0 g、酵母浸膏2.5 g、抗坏血酸0.5 g、硫酸镁0.25 g、磷酸甘油二钠19.0 g、乳糖5 g、琼脂粉15 g、蒸馏水1 000 mL，pH 6.8，121 ℃灭菌15 min。

异硫氰酸胍、溶菌酶、蛋白酶K、乙二胺四乙酸钠（ethylene diamine tetraacetic acid disodium salt，EDTA-Na 2 ）、Tris、SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒生工生物工程（上海）股份有限公司；Taq DNA酶、dNTP、10×PCR Buffer、MgCl 2 日本TaKaRa公司；琼脂糖、Lambda DNA/Hin d Ⅲ Marker、100 bp DNA Ladder Ⅱ、1 kb DNA Marker Ⅰ、6×Loading Buffer（DNA）上海鼎国生物技术有限公司；其余化学试剂均为分析纯。

2.5 L C-1厌氧产气袋、2.5 L C-31厌氧培养罐日本三菱公司；JYD-400拍击式均质器上海之信仪器有限公司；SIM-F140AY65型制冰机上海三洋电机国际贸易有限公司；SW-CJ-1F型单人双面净化工作台苏州净化设备有限公司；1-15PK台式离心机德国Sigma实验室离心机公司；Biospec-mini型岛津DNA/RNA/蛋白质分析装置日本岛津制作所；S1000伯乐高性能聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪、164-5050伯乐基础电源电泳仪美国Bio-Rad公司；Syngene GeneGenius凝胶成像系统美国基因生物科技有限公司。

样品的pH值按照GB/T 10468—1989《水果和蔬菜产品pH值的测定方法》测定；总酸度按照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》中酸碱滴定法测定，结果以乳酸计；盐度按照GB/T 5009.39—2003《酱油卫生标准的分析方法》方法测定，结果以NaCl计。以上实验都做3 次平行测定。

乳酸菌计数：称取10 g泡菜样品放入均质袋内，加入90 mL无菌生理盐水，用均质器处理1 min，使泡菜表面的细菌充分进入到生理盐水中，即得10 -1 的样品稀释液，再用生理盐水稀释成10 -2 、10 -3 、10 -4 、10 -5 倍，分别取每个倍数稀释液1 mL于培养皿中，加入灭菌后保温于45 ℃的MRS或M17培养基，混匀凝固后倒置，37 ℃厌氧培养48 h后进行菌落计数，重复计数3 次。

各泡菜样品基本指标的测定结果用IBM SPSS Statistics 19.0做相关性分析，相关系数的显著性检验用Pearson’ s法。

取1.3.1节乳酸菌计数中制备的各梯度稀释液0.2 mL涂布于MRS和M17培养基，同样条件下培养48 h，观察并记录菌落形态：颜色、形状、大小、边缘、表面、隆起形状、透明度等，用接种环挑取不同形态的菌落，于MRS或M17培养基上划线分离3～4 次直至纯化为单菌落。在超净工作台内，挑取单菌落做过氧化氢酶实验和革兰氏染色实验，过氧化氢酶阴性和革兰氏染色阳性者初步判断为乳酸菌。菌株于-80 ℃冷冻保存于含有体积分数15% 甘油的MRS或者M17培养液中。

将待测菌株用MRS或者M17液体培养基连续活化2 次，再用液体培养基培养至对数生长期，取1 mL菌液按照本实验室建立的异硫氰酸胍法 [10] 提取基因组DNA。配制0.8g/100 mL 琼脂糖凝胶，取10μL 基因组DNA点样，用Lambda DNA/Hin d Ⅲ Marker作为参照，然后在90 V电压下电泳40～50 min，用凝胶成像仪观察拍照，目标片段应在23 000 bp [11] 附近。

对所提取的基因组DNA进行16S rDNA片段扩增，采用细菌16S rDNA基因的通用引物 [12] ，正向引物为27F（5’ -AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’ ），反向引物为1541R（5’ -AAG GAG GTG ATC CAG CC-3’ ）。50μ L PCR反应体系为：10×PCR Buffer 5.0μL 、10 mmol/L dNTP 1μL 、2.5 mmol/L MgCl 2 5.0μL 、10μmol /L引物1.0μL 、Taq 酶2 U、DNA模板2.0μL 。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 45 s， 53 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，共30 次循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物约1 500 bp [10] ，用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒纯化后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司做双向测序。

将测序结果采用DNAMAN软件双向拼接，用比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）软件登录NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）网站与GenBank中已知序列进行同源性分析。一般来讲，在种分类等级上，如果2 个分类单位间的16S rDNA序列同源性大于97.5% ，则认为属于同一个种 [12] 。并在标准菌株网站（http∶//www.straininfo.net/）中寻找合适的标准菌株序列，使用MEGA 5软件包将标准序列与实验序列以Clustal W进行序列比对后，采用Neighbor-Joining法绘制系统发育树。

2 结果与分析

表1 眉山泡菜样品的基本指标
Table1 Chemical indexes and LAB counts of pickled vegetable samples collected from Meishan city

采样地点样品编号pH总酸度（以乳酸计）/（g/100 g）盐度（以NaCl计）/%乳酸菌计数（lg（CFU/g））MRS培养基M17培养基眉象D13.65±0.030.77±0.024.16±0.025.38±0.074.90±0.03新区D23.81±0.010.65±0.034.73±0.056.33±0.585.78±0.04新区D33.59±0.020.75±0.014.87±0.045.58±0.095.06±0.09新街D43.53±0.010.72±0.034.60±0.025.86±0.034.79±0.04通惠D53.43±0.040.75±0.025.15±0.056.25±0.104.90±0.02眉东D63.37±0.030.80±0.015.26±0.065.85±0.045.44±0.07眉东D73.89±0.030.73±0.034.97±0.055.42±0.075.02±0.08新区L13.47±0.030.92±0.025.28±0.041.71±0.031.33±0.07眉东L23.40±0.030.85±0.045.18±0.072.53±0.041.72±0.04眉象L33.52±0.040.82±0.014.54±0.023.81±0.012.56±0.02通惠L43.76±0.010.76±0.014.44±0.053.54±0.032.93±0.04通惠L53.52±0.030.74±0.044.35±0.032.65±0.022.14±0.11范围3.37～3.890.65～0.924.16～5.281.71～6.331.33～5.78平均值3.58±0.160.77±0.074.79±0.384.58±1.633.88±1.61

表2 眉山泡菜样品基本指标之间的相关性
Table2 Correlation among chemical indexes and LAB counts of Meishan pickle samples

注：*. 在0.05水平（双侧）上显著相关，**. 在0.01水平（双侧）上显著相关。

指标pH值总酸度盐度MRS培养基乳酸菌计数M17培养基乳酸菌计数pH值1.000-0.589*-0.4140.2690.348总酸度-0.589*1.0000.427-0.715**-0.716**盐度-0.4140.4271.000-0.033-0.029 MRS培养基乳酸菌计数0.269-0.715**-0.0331.0000.978** M17培养基乳酸菌计数0.348-0.716**-0.0290.978**1.000

表1列出了样品的pH值、总酸度、盐度和乳酸菌计数。表2为5 项基本指标之间的相关性分析，结果表明总酸度与pH值之间显著负相关，样品的pH值越低，总酸度越高，MRS培养基乳酸菌计数和M17培养基乳酸菌计数与总酸度之间均为极显著负相关，即总酸度越高，乳酸菌计数越小，可见总酸度是对乳酸菌计数影响最大的因素，MRS培养基乳酸菌计数和M17培养基乳酸菌计数之间极显著正相关。

由表1可知，7 份泡豇豆样品的MRS培养基乳酸菌计数为10 5 ～10 6 CFU/g，M17培养基乳酸菌计数为10 4 ～10 5 CFU/g，明显高于5 份泡萝卜样品的乳酸菌计数（10～10 3 CFU/g和10～10 2 CFU/g）。可能有以下两个方面的原因：一是泡萝卜样品的可滴定酸的含量相对较高，从上述分析得出总酸度对乳酸菌计数影响最大，所以乳酸菌数量较少；二是生萝卜中含有辣味成分4-甲硫基-3-丁烯异硫氰酸盐，有抑菌活性 [13-15] ，盐腌制后辣味物质的降解产物也有抗菌活性 [16-18] ，抗菌成分有可能使乳酸菌的可培养性降低。

表3 菌株形态及镜检结果
Table3 Colony morphology and micro-morphology of isolated strains

样品编号分离出的菌株编号菌落形态镜检结果D1D1-1白色光滑湿润、扁平、透明、圆形，φ＝1～3 mmG +，杆菌 D2 D2-1白色光滑、边缘整齐、透明、圆形，φ＝1～3 mmG +，杆菌 D2-2灰白色粗糙凸起、边缘整齐、圆形，φ＝1～2 mmG +，杆菌 D3 D3-1白色光滑凸起、边缘整齐、透明、圆形，φ＝1～3 mmG +，杆菌 D3-2乳白色光滑有光泽、边缘整齐、透明、圆形，φ≤1 mmG +，球菌 D4D4-1白色光滑凸起、边缘整齐、透明、椭圆形，φ＝0.5～1 mm G +，球菌 D5 D5-1灰白色光滑凸起、边缘整齐、透明、圆形，φ＝1 mmG +，球菌 D5-2灰白色凸起、边缘整齐、圆形，φ＝1～2 mmG +，杆菌 D5-3乳白色光滑微凸起、有光泽、不规则圆形，φ=1～2 mmG +，杆菌 D6 D6-1白色光滑湿润、扁平、透明、圆形，φ＝1～3 mmG +，杆菌 D6-2黄色光滑凸起、边缘整齐、透明、圆形，φ＝1～2 mmG +，球菌 D7D7-1乳白色光滑、边缘整齐、半球形小菌落，φ＝1～2 mmG +，杆菌

续表3

注：φ. 菌落直径。

样品编号分离出的菌株编号菌落形态镜检结果L3 L3-1灰白色光滑凸起、整齐、透明、不规则圆形，φ＝0.5 mm G +，球菌 L3-2灰白色光滑凸起、边缘整齐、圆形，φ＝1～3 mmG +，杆菌 L4 L4-1乳白色光滑凸起、边缘整齐、圆形，φ＝1～2 mmG +，杆菌 L4-2乳白色光滑凸起、边缘整齐、圆形，φ＝1～3 mmG +，杆菌

从12 份泡菜样品中总共分离出16 株菌，表3列出了镜检结果，可知其中有杆菌11 株，球菌5 株，革兰氏染色均为阳性，过氧化氢酶反应均为阴性，由此初步判断分离得到的16 株菌均为乳酸菌。

将16 株乳酸菌所提基因组DNA经琼脂糖凝胶电泳后，通过凝胶成像仪照相并观察，结果见图1。

如图1所示，在23 130 bp处出现荧光条带而且无明显拖尾现象，说明各菌株有DNA提出且纯度较好。各条带亮度不同，说明各菌株提出的DNA浓度不同，但都能满足后续16S rDNA扩增和测序的需要。

图2为待测菌株16S rDNA PCR扩增产物的凝胶电泳图，在1 500 bp处出现荧光条带，且无明显拖尾现象，说明PCR扩增成功，能满足后续16S rDNA序列测定的需要。

登陆NCBI网站（http∶//www.ncbi.nlm.nih.gov）DNA数据库，将各菌株的序列采用BLAST软件与已知序列比对，同源性结果见表4。

表4 菌株的16S rDNA序列同源性比对结果
Table4 Homologous alignment analysis of 16S rDNA sequences from isolates

菌株编号BLAST结果序列大小/bp覆盖百分率/%同源性/% D1-1Lactobacillus fermentum1 5689598 D2-1Lactobacillus plantarum1 4709899 D2-2Lactobacillus brevis1 4729899 D3-1Lactobacillus plantarum1 4429699 D3-2Pediococcus pentosaceus1 4849898 D4-1Pediococcus pentosaceus1 4709899 D5-1Lactococcus lactis1 5029799 D5-2Lactobacillus brevis1 4999999 D5-3Lactobacillus acidophilus1 4499799 D6-1Lactobacillus fermentum1 4979899 D6-2Lactococcus lactis subsp. lactis1 4619999 D7-1Lactobacillus plantarum1 4749899 L3-1Lactococcus lactis1 4839898 L3-2Lactobacillus casei1 4569899 L4-1Lactobacillus pentosus1 5229699 L4-2Lactobacillus delbrueckii1 4719699

一般来讲，在种分类等级上，如果2 个分类单位间的16S rDNA序列同源性大于97.5% ，则认为属于同一个种 [12] 。由表4可知，16S rDNA序列同源性均大于97.5% ，都鉴定到种的水平。

将上述BLAST结果的乳酸菌的序列下载下来，作为标准序列与实验序列利用MEGA 5软件以Neighbor-Joining法构建系统进化树，标准序列中包括作为发育树外群序列的双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum DSM 20456），对所有序列进行比对后，删除两端未对其的碱基，生成系统进化树。采用“Compute Linearized tree”的方法显示进化树，并通过“Image→Save as Enhanced Metafile（EMF）”功能将其转化为图片文件（图3），使结果更加清晰直观。

实验所鉴定出的乳酸菌菌株按照样品采集地点的分布结果见表5。

表5 眉山市各区域泡菜样品中鉴定出的乳酸菌菌种
Table5 Distribution of identified lactic acid bacteria species in sampling locations

采集地点样品编号样品中鉴定出的菌株种类数眉象D1Lactobacillus fermentum3 L3Lactobacillus casei、Lactococcus lactis新区D2Lactobacillus plantarum、Lactobacillus brevis3 D3Lactobacillus plantarum、Pediococcus pentosaceus新街D4Pediococcus pentosaceus1通惠D5Lactobacillus brevis、Lactobacillus acidophilus、Lactococcus lactis5 L4Lactobacillus pentosus、Lactobacillus delbrueckii眉东D6Lactobacillus fermentum、Lactococcus lactis subsp. lactis3 D7Lactobacillus plantarum

由表5可知，从12 份泡菜样品中共鉴定出9 种乳酸菌，其中通惠的泡菜中鉴定出5 种乳酸菌，多样性最为丰富。不同地区之间、甚至同一地区不同样品之间乳酸菌种类都存在显著差异，直接说明了乳酸菌的多样性。

表6 两种样品中乳酸菌菌株分布情况
Table6 Distribution of identified lactic acid bacteria species in different pickled vegetables

样品种类鉴定出的乳酸菌种类数泡豇豆Lactobacillus fermentum、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus brevis、Lactobacillus acidophilus、Lactococcus lactis、Pediococcus pentosaceus6泡萝卜Lactobacillus casei、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus delbrueckii、Lactococcus lactis4

由表6可知，泡豇豆中的乳酸菌种类比泡萝卜中的乳酸菌种类丰富，菌种构成之间存在较大的差异，由此反映出蔬菜品种对乳酸菌多样性有显著影响。

已有多位学者对四川地区泡菜中的乳酸菌进行了分离鉴定，鉴定出的乳杆菌菌种主要有：植物乳杆菌（L. plantarum ）、戊糖乳杆菌（L. pentosus ）、短乳杆菌（L. brevis ）、干酪乳杆菌（L. casei ）、发酵乳杆菌（L. fermentum ）、嗜酸乳杆菌（L. acidophilus ）、棒状乳杆菌（L. coryniformis ）、唾液乳杆菌（L. salivarius ）、食品乳杆菌（L. alimentarius ）；球菌主要有：肠膜明串珠菌（L. mesenteroides ）、戊糖片球菌（P. pentosaceus ） [7,19-25] 。文献报道最多的菌种是植物乳杆菌和肠膜明串珠菌，所以推测它们代表了四川盆地环境中普遍存在的菌种。本研究中乳杆菌菌种构成与现有的报道基本一致，样品中也较多地检出了植物乳杆菌，球菌中以乳酸乳球菌为主，周光燕 [21] 、张良 [22] 等也从四川泡菜中检出了乳酸乳球菌，此外对此菌种的报道不多。总的来说，眉山泡菜样品中检出的乳酸菌菌种与四川地区泡菜样品比较一致，少数的差别可能与地域、环境、基质条件等因素有关。

3 结论

本研究从眉山市各个地区采集了泡菜样品12 份，其中泡豇豆7 份、泡萝卜5 份，样品pH值的范围是3.37～3.89，总酸度的范围是0.65～0.92 g/100 g（以乳酸计），盐度的范围是4.16% ～5.28% （以NaCl计），MRS和M17培养基的乳酸菌计数分别是1.71～6.33、1.33～5.78 （lg（CFU/g））。总酸度与pH值之间显著负相关，乳酸菌计数与总酸度之间极显著负相关，总酸度对乳酸菌计数影响最大。7 份泡豇豆样品MRS培养基的乳酸菌计数为10 5 ～10 6 CFU/g，M17培养基的乳酸菌计数为10 4 ～10 5 CFU/g，明显高于5 份泡萝卜样品的乳酸菌计数（10～10 3 CFU/g和10～10 2 CFU/g），可能是由于泡萝卜总酸度较高和萝卜含有抗菌成分的影响。

从泡豇豆中共分离鉴定出12 株乳酸菌：Lactobacillus fermentum （D1-1、D6-1）、Lactobacillus plantarum （D2-1、D3-1、D7-1）、Lactobacillus brevis （D2-2、D5-2）、Lactobacillus acidophilus （D5-3）、Lactococcus lactis （D5-1、D6-2）、Pediococcus pentosaceus （D3-2、D4-1），从泡萝卜中共分离鉴定出4 株乳酸菌：Lactobacillus casei （L3-1）、Lactobacillus pentosus （L3-2）、Lactobacillus delbrueckii （L4-1）、Lactococcus lactis （L4-2）。泡豇豆中的乳酸菌种类比泡萝卜的丰富，菌种构成之间存在较大的差异，眉象、新区、新街、通惠、眉东5 个采样地点的样品之间乳酸菌的种类也存在显著差异。本研究探讨了眉山泡菜乳酸菌的多样性，也为泡菜发酵工业生产积累了生产用菌种。

[1] 尹伟. 眉山市泡菜产业发展探析[J]. 经济研究导刊, 2014(4)∶ 39-41.

[2] 游磊, 杨胜宏, 伍纹仪. 基于SCP范式的眉山泡菜产业市场结构分析[J].硅谷, 2010(8)∶ 203.

[3] 王金菊, 崔宝宁, 张治洲. 泡菜风味形成的原理[J]. 食品研究与开发, 2008, 29(12)∶ 163-166.

[4] 苏扬, 陈云川. 泡菜的风味化学及呈味机理的探讨[J]. 中国调味品, 2001, 26(4)∶ 28-31.

[5] 陈功, 张其圣, 余文华, 等. 四川泡菜乳酸菌多样性及其功能特性[J].食品与发酵工业, 2013, 39(3)∶ 1-4.

[6] 汪红, 曹瑜, 罗时宇, 等. 四川泡菜乳酸菌的分离鉴定及其特性研究[J].四川大学学报∶ 自然科学版, 2008, 45(6)∶ 1509-1512.

[7] 王柱, 张晓娟, 周光燕, 等. 四川地区发酵制泡菜乳酸菌菌种资源的收集与标准化整理[J]. 四川食品与发酵, 2008, 44(3)∶ 5-8.

[8] 李平兰, 贺稚非. 食品微生物学实验原理与技术[M]. 2版. 北京∶ 中国农业出版社, 2011∶ 1-182.

[9] 曹文海, 任国谱. 嗜热链球菌的检验培养基(M17)的改良[J]. 中国乳业, 2006(1)∶ 46-48.

[10] 夏雪娟, 陈芝兰, 陈宗道, 等. 16S rDNA序列分析法快速鉴定西藏地区传统乳制品中的乳酸菌[J]. 食品科学, 2013, 34(14)∶ 245-249. doi∶10.7506/spkx1002-6630-201314050.

[11] 张洁, 徐桂花, 尤丽琴. 16S rDNA序列分析法鉴定乳酸菌[J]. 农产品加工∶ 创新版, 2009(4)∶ 47-49.

[12] WIJTZES T, BRUGGEMAN M R, NOUT M J, et al. A computerised system for the identification of lactic acid bacteria[J]. International Journal of Food Microbiology, 1997, 38(1)∶ 65-70.

[13] 刘春香, 李洪涛, 赵光强. 萝卜辣味与黑芥子酶[J]. 潍坊学院学报, 2011, 11(6)∶ 77-81.

[14] 沈奇, 汪隆植. 萝卜肉质根的辣味物质研究[J]. 中国蔬菜, 1996(5)∶52-54.

[15] NAKAMURA Y, IWAHASHI T, TANAKA A, et al. 4-(Methylthio)-3-butenyl isothiocyanate, a principal antimutagen in Daikon (Raphanus sativus; Japanese White Radish)[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49(12)∶ 5755-5760.

[16] 王雅娟, 李健, 周常义, 等. 盐渍萝卜色差值测定及其提取物抑菌活性研究[J]. 中国酿造, 2014, 33(6)∶ 36-41.

[17] TAKAHASHI A, MATSUOKA H, WATANABE E, et al. Quantitative analysis of yellow pigment in Takuan-zuke and their ABTS radical cation scavenging activity[J]. Food Science and Technology Research, 2009, 15(3)∶ 337-342.

[18] UDA Y, OZAWA Y, YONEYAMA K. Occurrence of biologically active 2-thioxopyrrolidines and 3,5-disubstituted 2-thiohydantoins from the pungent principle of radish (Raphanus sativus L.)[J]. Studies in Natural Products Chemistry, 2002, 26∶ 1073-1111.

[19] 鄯晋晓. 四川泡菜菌系分离、筛选及发酵剂的研究[D]. 重庆∶ 西南大学, 2008∶ 11-20.

[20] 史令. 四川地区自然发酵泡菜中乳酸菌的遗传多样性与系统发育研究[D]. 雅安∶ 四川农业大学, 2010∶ 22-35.

[21] 周光燕. 四川地区自然发酵泡菜中乳酸菌的生物特性研究[D]. 雅安∶ 四川农业大学, 2006∶ 18-38.

[22] 张良, 曾泽生, 邢雅阁, 等. 四川特色泡菜发酵微生物区系状况调查研究[J]. 中国调味品, 2012, 37(11)∶ 43-47.

[23] 田伟. 四川传统泡菜与工业泡菜发酵过程中微生物群落结构解析[D].成都∶ 西华大学, 2013∶ 19-37.

[24] 高娃. 四川部分地区泡菜中乳酸菌的分离鉴定[D]. 呼和浩特∶ 内蒙古农业大学, 2010∶ 14-26.

[25] 田伟, 张琦, 邓珍珍, 等. 利用16S rRNA分析传统四川发酵泡菜中的细菌多样性[J]. 食品科学, 2013, 34(17)∶ 215-218. doi∶ 10.7506/ spkx1002-6630-201317046.

Isolation and Identification of Lactic Acid Bacteria in Pickled Vegetables from Meishan City

YANG Jixia, ZHANG Liling, JIANG Houyang, HE Zhifei* (Chongqing Key Laboratory of Agricultural Product Processing Technology, Chongqing Special Food Engineering and Technology Research Center, College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Abstract： Objective∶ To investigate chemical properties and lactic acid bacteria (LAB) of pickles from Meishan, Sichuan province. Methods∶ Totally 12 samples were collected from 5 locations of Meishan city. The pH, total acidity and salinity of these samples were determined. MRS and M17 agar plate were used to enumerate LAB, and all isolated strains were identified at the species level by 16S rRNA sequence analysis. Results∶ The ranges of pH, total acidity and salinity were 3.37-3.89, 0.65-0.92 g/100 g and 4.16% -5.28% , respectively. The LAB enumeration by MRS and M17 agar plate was in the range of 1.71-6.33 and 1.33-5.78 (lg(CFU/g)), respectively. Total acidity had a significant impact on LAB enumeration. Totally 16 LAB strains were isolated and identified from Meishan pickles, including Lactobacillus fermentum (2 strains), Lactobacillus plantarum (3 strains), Lactobacillus brevis (2 strains), Lactobacillus acidophilus (1 strain), Lactobacillus casei (1 strain), Lactobacillus pentosus (1 strain), Lactobacillus delbrueckii (1 strain), Lactococcus lactis (3 strains) and Pediococcus pentosaceus (2 strains). Conclusion∶ This study reveals the biodiversity of lactic acid bacteria in Meishan pickles, and the isolated strains can provide starter cultures for the fermentation industry.

Key words： pickled vegetable; lactic acid bacteria; 16S rDNA sequence analysis

基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金项目（XDJK2009C039；XDJK2015C135；2362014xk11）；

作者简介：杨吉霞（1978—），女，讲师，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：yangjx@188.com

*通信作者：贺稚非（1960—），女，教授，博士，研究方向为食品微生物学。E-mail：zfhe2003@yahoo.com.cn

眉山泡菜中乳酸菌的分离鉴定

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

3 结论