图1 3 种菌在基本固态发酵培养基上的生长
Fig.1 Growth status of Bacillus subtilis, Candida utilis and Geotrichum candidum on solid basal medium
焦肖飞，刘建学*，韩四海，李 璇，李佩艳，罗登林，张卫卫，徐宝成
（河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023）
摘 要：以未发酵白酒糟培养基为对照组，探讨不同菌种组合以及发酵条件对固态发酵白酒糟中蛋白含量的影响，旨在提高酒糟中真蛋白的含量。选用枯草芽孢杆菌、白地霉和产朊假丝酵母对白酒糟进行单菌和复合菌发酵实验，结果显示三菌组合发酵效果最好。通过三菌单因素发酵试验及正交试验确定最佳发酵条件为：添加 15%的麸皮和 2%的尿素，先接种 5%的枯草芽孢杆菌和 10%的白地霉 30℃培养 24 h，然后接种 5%的产朊假丝酵母 30℃培养 72 h，此时真蛋白的含量为 24.85%，粗蛋白含量达 32.09%，粗纤维含量降低到 17.66%。
关键词：白酒糟；复合菌发酵；真蛋白；条件优化
酒糟是酿酒制造业所产生的主要废弃物，据报道， 2013年上半年产生了 2 000万余吨的白酒糟 [1]，经过晾晒去除多余水分后，干白酒糟年产量达到 400万 t以上 [2]。目前对酒糟的研究主要包括以下方面：从酒糟中提取纤维素 [3]、植酸 [4]、氨基酸 [5]和蛋白质 [6]等；利用酒糟培养多种食用菌（如灵芝 [7]、鸡腿菇 [8]、秀珍菇 [9]、双孢菇 [10]等）；利用酒糟制取甘油 [11]；利用酒糟酿醋 [12]；利用酒糟厌氧发酵回收沼气 [13]；利用酒糟发酵生产燃料乙醇 [14]；生产酶制剂 [15]；生产饲料 [16-18]。
鲜白酒糟因其产量大、不易贮藏与运输，目前主要是做废弃物处理或经晾晒后用作粗饲料，但由于价格低廉，经济效益不够明显，造成了资源的巨大浪费和对周围环境的严重污染。而酒糟蛋白的提取是酒糟综合利用及深加工的重要途径，提取的蛋白质可以加工成多种高蛋白的食品，作为调味品和保健品基料应用到食品工业中 [19]，具有显著的经济效益和社会效益，且植物蛋白相对于动物蛋白，具有良好的消化率和动物蛋白无法比拟的功能，如降低胆固醇水平、减少癌症的发生、改善心血管疾病的症状等 [20]。
由于单菌种对酒糟蛋白质的提高有限，本实验选用生育周期短、繁殖能力强、生产条件不严，能分泌多种酶系，具有降解淀粉、纤维素和半纤维素能力的枯草芽孢杆菌，能同化多种有机氮源和尿素并可利用木聚糖、纤维素等大分子难降解物质，而且能有效转化残糖、有机酸、脂肪酸 等物质的白地霉 [21]，以及能大量繁殖、蛋白质可利用率高 [22]，且无毒副作用的产朊假丝酵母作为发酵菌种，利用多菌株间的协同作用，对白酒糟进行固态协同发酵转化，更能充分利用酒糟的碳源、氮源，使发酵产物中的蛋白含量明显提高，尤其是真蛋白含量，为白酒糟开发食品蛋白质提供依据。该产品原料来源丰富、生产成本低，具有良好的发展前景。
1.1材料、菌种、培养基与试剂
白酒糟由河南省伊川杜康酒厂提供，含水量为 65%～ 70%，烘干保存备用；麸皮购于当地。
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis， B）由河南科技大学食品与生物工程学院实验室提供；白地霉（Geotrichum candidum， G）购自江南大学；产朊假丝酵母（Candida utilis， C）由河南省科学院生物研究所提供。
LB培养基： 121℃条件下灭菌 20 min； PDA培养基： 115℃条件下灭菌 20 min； YPD培养基： 115℃条件下灭菌 20 min；基本固态发酵培养基：取白酒糟 13.5 g（ 90份，以干质量计）、加蒸馏水 19.5 mL（ 130份）、麸皮 1.5 g（ 10份）、尿素 0.3 g（ 2份）充分混合后，在 121℃条件下灭菌处理 30 min，冷却后备用。所用试剂均为国产分析纯。
1.2仪器与设备
FA1004万分之一天平 上海上平仪器有限公司； 101-2型电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司； YXQ-LS-SⅡ高压蒸汽灭菌锅、 SX2-4-10高温箱电阻炉 上海博迅实业有限公司医疗设备厂； SW-CJ-1D型超净工作台 苏州净化设备有限公司； DH-500电热恒温培养箱 北京中兴伟业仪器有限公司； HQY-C气浴恒温振荡器 金坛市宏科仪器厂； CXC-06粗纤维测定仪 上海新嘉有限公司； 100～ 1 000μL移液枪 上海恒奇仪器仪表有限公司；老本行 150T多功能粉碎机 铂欧五金厂。
1.3方法
1.3.1菌种的活化
无菌操作下挑取枯草芽孢杆菌一环，接种于 LB斜面培养基上， 37℃条件下培养 24 h；挑取白地霉一环，接种于 PDA斜面培养基上， 30℃条件下培养 24 h；挑取产朊假丝酵母一环，接种于 YPD斜面培养基上， 30℃条件下培养 24 h。为保证存活效果， 3种菌种至少各培养 3管。
1.3.2菌种的扩大培养
枯草芽孢杆菌的扩大培养：配制 LB液体培养基，分装 100 mL于 250 mL三角瓶中， 121℃条件下灭菌 20 min后冷却，接种枯草芽孢杆菌活化菌，在 37℃、 150 r/min条件下摇床培养 24 h；白地霉的扩大培养：配制 PDA液体培养基，分装 100 mL于 250 mL三角瓶中， 115℃条件下灭菌 20 min后冷却，接种白地霉活化菌，在 28℃、 150 r/min条件下摇床培养 24 h；产朊假丝酵母的扩大培养：配制 YPD液体培养基，分装 100 mL于 250 mL三角瓶中， 115℃条件下灭菌 20 min后冷却，接种产朊假丝酵母活化菌，在 28℃、 150 r/min条件下摇床培养 24 h。
1.3.3平板点种实验
取基本固态发酵培养基于三角瓶中，加 150 mL蒸馏水浸泡 48 h，取 100 mL浸提液，加 2 g琼脂， 121℃条件下灭菌 20 min，倒平板。无菌操作分别点种：枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母、白地霉， 30℃条件下恒温培养 24 h，观察菌落生长情况。
1.3.4拮抗实验
将枯草芽孢杆菌、产朊假丝酵母、白地霉 3种菌，两两交叉划线接种于普通营养琼脂培养基上， 30℃条件下培养 24 h，观察十字交叉处是否有被抑制而发生菌落萎缩和消失的现象。
1.3.5单菌种发酵实验
取基本固态发酵培养基，分别按 15 mL/100 g的接种量接入单菌种，于 30℃条件下恒温培养箱中培养 72 h。
1.3.6混菌发酵实验
取基本固态发酵培养基，将三菌两两组合，按 15 mL/100 g的总接种量分别接入双菌组合（接种比例为 1∶1）和三菌（接种比例为 1∶1∶1）混合发酵，于 30℃条件下恒温培养箱中培养 72 h。
1.3.7三菌发酵单因素试验
接种方式：在m（酒糟） ∶m（麸皮） =9∶1（麸皮添加量为10%），接种总量为 15 mL/100 g（白地霉（ G） ∶枯草芽孢杆菌（ B） ∶产朊假丝酵母（ C） =1∶1∶1），尿素添加量为 2%的条件下，将其接种方式设定为同时接种 B+C+G发酵 72 h（Ⅰ组）；先接种 B发酵 24 h，再接种 C+G发酵 72 h（Ⅱ组）；先接种 G发酵 24 h，再接种 B+C发酵 72 h（Ⅲ组）；先接种 B+G发酵 24 h，再接种 C发酵 72 h（Ⅳ组）；同时接种 B+C+G发酵 96 h（Ⅴ组）。发酵结束后测定其粗蛋白、真蛋白和粗纤维含量。
接种量：在m（酒糟） ∶m（麸皮） =9∶1（麸皮添加量为10%），尿素添加量为 2%，先接种 B+G发酵 24 h，再接种 C发酵 72 h的条件下，将 G+B+C混合接种量（ mL/100 g）设定为 5+5+10、 5+10+10、 5+5+5、 5+10+5、 10+5+5。发酵结束后测定其粗蛋白、真蛋白和粗纤维含量。
尿素添加量：在m（酒糟） ∶m（麸皮） =9∶1（麸皮添加量为10%），尿素添加量为 2%，先接种 10 mL/100 g白地霉和 5 mL/100 g枯草芽孢杆菌发酵 24 h，再接种 5 mL/100 g产朊假丝酵母发酵 72 h的条件下，将尿素添加量设定为 1.5%、 2%、 2.5%、 3%、 3.5%，发酵结束后测定其粗蛋白、真蛋白和粗纤维含量。
麸皮添加量：在尿素添加量为 2.5%，先接种 10 mL/100 g白地霉和 5 mL/100 g枯草芽孢杆菌发酵 24 h，再接种 5 mL/100 g产朊假丝酵母发酵 72 h的条件下，将麸皮的添加量设定为 5%、 10%、 15%、 20%、 25%，发酵结束后测定其粗蛋白、真蛋白和粗纤维含量。
1.3.8正交试验
以接种方式、接种量（ G+B+C）、尿素添加量和麸皮的添加量为变量，以真蛋白含量为指标，进行 L 16（ 4 4）正交试验，确定最佳发酵条件。
1.3.9测定方法
粗蛋白含量测定：参照 GB 5009.5— 2010《食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法。
真蛋白含量的测定 [23]：称取 0.5 g样品，置于 250 mL烧杯中，加蒸馏水 50 mL，电炉加热煮沸，加入 10% CuSO 4· 5H 2 O 20 mL，在搅拌下加 2.5% NaOH 20 mL，摇匀，室温放置 2 h，沉淀物用中性快速定性滤纸过滤，并用煮开的蒸馏水洗涤烧杯和沉淀物数次，直至洗出液无硫酸根离子（用 10% BaSO 4溶液检验），最后连同滤纸一起于 80℃烘箱中烘至略潮，移入凯氏烧瓶中，消化后用凯氏定氮法测定样品中真蛋白含量，同时作空白对照（对应加入一块滤纸消化）。
粗纤维含量的测定：粗纤维测定仪。
2.1 3种菌在基本固态发酵培养基上的生长情况
图1 3 种菌在基本固态发酵培养基上的生长
Fig.1 Growth status of Bacillus subtilis, Candida utilis and Geotrichum candidum on solid basal medium
如图 1所示，培养基上 3种菌落均能良好生长，说明基本固态发酵培养基能满足枯草芽孢杆菌、白地霉和产朊假丝酵母的生长需求，可以选择其为发酵菌种。
2.2拮抗实验
图2 3 种菌的拮抗实验结果
Fig.2 Antagonism of Bacillus subtilis, Candida utilis and Geotrichum candidum
如图 2所示，平板上 3种菌均生长良好，两两交叉处无菌落萎缩或消失现象，说明 3种菌之间没有拮抗作用，可以用于混菌发酵实验。
2.3单菌种发酵和混菌发酵研究
图3 不同单菌种对发酵效果的影响
Fig.3 Influence of different pure cultures on the contents of true protein, crude protein and crude fiber
由图 3可知，枯草芽孢杆菌和白地霉具有较好的降解纤维素的能力，与空白对照组相比，分别降低了 4.22%和 3.90%，白地霉和产朊假丝酵母具有较好的转化蛋白的能力，真蛋白含量分别提高了 9.52%和 9.60%。三菌发酵效果最好，粗蛋白含量可以达到 28.95%，真蛋白含量可以达到 22.63%，粗纤维含量降低为 19.96%。
2.4三菌发酵条件优化
2.4.1接种方式对发酵效果的影响
表1 不同接种方式对发酵效果的影响
Table1 Influence of different inoculation methods on the contents of true protein, crude protein and crude fiber
注：同行小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。表2同。
项目空白对照组Ⅰ组Ⅱ组Ⅲ组Ⅳ组Ⅴ组粗蛋白含量/%19.54±0.28 d28.93±0.24 b29.22±0.31 b28.73±0.35 bc29.78±0.37 a28.35±0.29 c真蛋白含量/%12.97±0.18 d22.62±0.13 b22.71±0.12 ab22.28±0.22 c23.01±0.17 a21.98±0.26 c粗纤维含量/%23.78±0.34 a19.96±0.38 cd19.67±0.41 d20.09±0.36 b18.57±0.45 e20.52±0.49 c
由表 1可知，当先接种白地霉和枯草芽孢杆菌发酵 24 h，再接种产朊假丝酵母发酵 72 h时（Ⅳ组），粗蛋白含量和真蛋白含量最高，分别为 29.78%和 23.01%，粗纤维含量最低，为 18.57%。这可能是因为菌种的生长周期不完全相同，产酶种类对菌种间的协同作用有影响，当先接种白地霉和枯草芽孢杆菌时，能降解一部分粗纤维，并分解淀粉为单糖， 24 h后接种产朊假丝酵母，酵母能利用已被分解的单糖和小分子物质合成蛋白，从而提高发酵产物中的蛋白含量。
2.4.2接种量对发酵效果的影响
微生物在生长过程中要经历迟缓期、对数生长期、稳定生长期和衰亡期，迟缓期的存在会延长微生物正常的生长周期，所以应尽量缩短迟缓期，而适当增大接种量可以缩短、甚至消除迟缓期 [24]。由表 2可知，随着总接种量的增加，发酵产物的真蛋白质含量先升高后降低，当白地霉的接种量为 10 mL/100 g，枯草芽孢杆菌的接种量为 5 mL/100 g，产朊假丝酵母的接种量为 5 mL/100 g时，粗蛋白含量和真蛋白含量最高，分别为 30.53%和 23.47%，粗纤维含量最低，为 18.18%。但是接种量过多时，会使菌种间竞争性的利用营养物质，反而不利于菌种的生长发酵，会影响发酵效果，当总接种量为 25 mL/100 g时，粗蛋白和真蛋白的含量分别为 29.18%和 22.84%，粗纤维的含量为 18.38%。
表2 不同接种量对发酵效果的影响
Table2 Influence of different inoculum sizes on the contents of true protein, crude protein and crude fiber
项目空白对照组接种量（G+B+C）/（mL/100 g）5+5+105+10+105+5+55+10+510+5+5粗蛋白含量/%19.54±0.28 d30.16±0.21 ab29.18±0.19 c29.75±0.33 b29.88±0.25 b30.53±0.36 a真蛋白含量/%12.97±0.18 c23.24±0.16 ab22.84±0.23 b23.02±0.29 ab23.14±0.24 ab23.47±0.35 a粗纤维含量/%23.78±0.34 a18.79±0.42 b18.38±0.38 b18.57±0.49 b18.34±0.51 b18.18±0.44 b
2.4.3尿素添加量对发酵效果的影响
图4 不同尿素添加量对发酵效果的影响
Fig.4 Influence of urea concentration on the contents of true protein, crude protein and crude fiber
由图 4可知，添加尿素能提高发酵产物蛋白质含量，随着尿素添加量的增加，粗蛋白含量增加；当尿素添加量为 2.5%时，真蛋白含量最高，达到 24.15%，粗蛋白含量为 31.32%，粗纤维含量最低，为 17.97%。当氮源添加量低于 2.5%时，不能满足混菌生长的需要，菌体生长缓慢，发酵产物的蛋白含量降低，尿素添加量 1.5%时，粗蛋白和真蛋白的含量分别为 29.65%和 23.06%，粗纤维含量为 18.73%；当氮源添加量高于 2.5%时，微生物对外加氮源的利用能力有限，不能将过量的无机氮源转化为菌体蛋白，尿素添加量 3.5%时，粗蛋白和真蛋白含量分别为 31.14%和 23.51%，粗纤维含量为 18.29%。
2.4.4麸皮添加量对发酵效果的影响
微生物在生长代谢过程中需要吸收各种有机碳水化合物构建新的细胞组分，所以添加适量的碳源可以促进菌体的生长代谢，有效提高发酵产物的蛋白含量，但是碳源过高反而会抑制微生物的生长。由图 5可知，当麸皮的添加量小于 15%时，随着麸皮的添加量增多，蛋白含量呈增长趋势。 5%的麸皮添加量时，粗蛋白和真蛋白的含量分别为 29.26%和 22.69%，粗纤维的含量为 18.44%；当酒糟的添加量为 85%，麸皮的添加量为 15%时，粗蛋白含量和真蛋白含量最高，分别为 32.15%和 24.92%，粗纤维含量最低，为 17.62%。当麸皮的添加量大于 15%时，随着麸皮的添加量增多，蛋白含量呈降低趋势。 25%的麸皮添加量时，粗蛋白和真蛋白的含量分别为 31.03%和 24.17%，粗纤维的含量为 17.89%。
图5 不同麸皮添加量对发酵效果的影响
Fig.5 Influence of wheat bran concentration on the contents of true protein, crude protein and crude fiber
2.4.5正交试验结果
表3 正交试验结果
Table3 Results of orthogonal array experiments
试验号A接种方式B接种量（G+B+C）/（mL/100 g）C尿素添加量/% D麸皮添加量/%真蛋白含量/% 11（Ⅰ组）1（5+5+10）1（1.5）1（10）22.67 212（5+10+10）2（2.0）2（15）22.89 313（5+10+5）3（2.5）3（20）23.26 414（10+5+5）4（3.0）4（25）21.95 52（Ⅱ组）12324.07 6221422.06 7234123.19 8243224.82 93（Ⅲ组）13423.59 10324322.78 11331223.73 12342124.56 134（Ⅳ组）14224.38 14423124.12 15432423.64 16441324.67 K 190.7794.7193.1394.54 K 294.1491.8595.1695.82 K 394.6693.8295.7994.78 K 496.8196.0092.3091.24 R1.511.040.871.14
表4 正交试验设计方差分析Table4 Analysis of variance of the orthogonal design
Tab
方差来源平方和自由度均方F显著水平A4.68731.562111.57α=0.01 B2.28130.76058.28α=0.01 C2.04030.68048.57α=0.01 D2.94830.98370.21α=0.01误差0.04330.014总和11.99915
由表 3可知，影响真蛋白含量的主次因素为A＞D＞B＞C，最佳条件组合为A 4B 4C 3D 2。且由因素C的K 2和K 3可以看出两水平结果较为相近。因为正交试验中没有进行A 4B 4C 3D 2组试验，为了确定其准确性，在此条件下做验证实验，测得发酵产物真蛋白的含量为 24.93%。且A 4B 4C 2D 2试验组测得的发酵产物真蛋白的含量为 24.85%，与 24.93%相差不大，粗蛋白含量达 32.09%，粗纤维含量降低到 17.66%。综合考虑成本原因，最终选择A 4B 4C 2D 2组为最佳试验组。由方差分析得到 4个因素对发酵产物中真蛋白含量的提高均有显著影响。
枯草芽孢杆菌、白地酶和产朊假丝酵母 3种菌作为蛋白转化菌来生产饲料用蛋白或食品中间物，因其不产生毒素而安全可靠。
对固态发酵过程中提取蛋白的影响因素进行了研究。结果表明接种方式、接种量、尿素添加量、麸皮添加量对发酵产物中的真蛋白均有显著性影响，影响因素主次为接种方式＞麸皮添加量＞接种量＞尿素添加量。
通过正交试验进行了三菌混合发酵条件的优化，得到较优试验条件为添加 15%的麸皮和 2%的尿素，先接种 5%的枯草芽孢杆菌和 10%的白地霉 30℃培养 24 h，然后接种 5%的产朊假丝酵母 30℃培养 72 h。在此条件下蛋白转化率高，其粗蛋白含量可达 32.09%，真蛋白含量达 24.85%，粗纤维含量降低到 17.66%。
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Optimization of Mixed-Culture Fermentation Conditions for Biotransformation of Distilled Spirit Lees
JIAO Xiaofei, LIU Jianxue*
, HAN Sihai, LI Xuan, LI Peiyan, LUO Denglin, ZHANG Weiwei, XU Baocheng
(College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China)
Abstract： With the aim of achieving increased true protein content of distilled spirit lees, this studyinvestigated the effects of different mixed cultures and solid-state fermentation conditions on protein content of distilled spirit lees. Comparison was carried out with the unfermented control group. Fermentation experiments were conducted with pure and mixed cultures of Bacillus subtilis , Geotrichum candidum and Candida utilis , and the best results were obtained when all the three strains were used together. By the combined use of one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods, the optimal fermentation conditions were determined as follows∶ addition of wheat bran and urea to distilled spirit lees in proportions of 15% and 2% , respectively, and sequential culture at 30℃ for 24 hwith 5% Bacillus subtilis and 10% Geotrichum candidum followed by 5% Candida utilis for 72 h. The fermented lees under these conditions contained 24.85% true protein and 32.09% crude protein, and the crude fiber content was reduced to 17.66% .
Key words： distilled spirit lees; mixed-culture fermentation; true protein; optimization of fermentation conditions
中图分类号： Q939.99
文献标志码： A 文章编号：1002-6630（2015）17-0164-05
文章编号：1002-6630（2015）17-0164-05
doi：10.7506/spkx1002-6630-201517031
收稿日期：2014-11-26
基金项目：公益性行业（农业）科研专项（201413015）；河南省重点攻关项目（142102310262）
作者简介：焦肖飞（1988—），女，硕士研究生，研究方向为农产品副产物高值化利用技术。E-mail：jiaoxiaofei0204@163.com
*通信作者：刘建学（1964—），男，教授，博士，研究方向为农产品高值化利用及质量检测技术。E-mail：jx_liu@163.com