超声波协同流水净化对克氏原螯虾中菌落总数及菌相构成的影响

摘要：目的：研究超声波协同流水净化对活体克氏原螯虾携带的细菌数量及菌相构成的影响。方法：测定了净化过程中克氏原螯虾壳+肉、腮部和肠道部位菌落总数变化，并应用随机扩增多态性 DNA（ random amplified polymorphic DNA， RAPD）指纹图谱结合 16S rDNA测序鉴定分析龙虾在净化处理前后不同部位的菌相构成。结果：超声波协同流水处理能够显著减少虾壳+肉、腮和肠道部位的细菌载量，降低量分别达到 2.18、 2.23、 1.01（ lg（ CFU/g））。挑取的 218个单菌落中存在 21种不同的 RAPD谱型，不同谱型的细菌属于 9个属 18个种，其中气单胞菌属、黄杆菌属、嗜冷杆菌属、希瓦氏菌属和肠杆菌属细菌为虾壳肉和腮中的优势菌群，净化处理后虾中分布的细菌种群数降低为 6个属 9个种，其中温和气单胞菌（ Aeromonas sobria）、阴沟肠杆菌（ Enterobacter cloacae）、黄杆菌（ Flavobacterium granuli）和腐败希瓦氏菌（ Shewanella putrefaciens）是残留的优势细菌种群。结论：超声波协同流水净化对活体克氏原螯虾具有良好的减菌效果。

克氏原螯虾（Procambarus clarkii）俗称小龙虾，味道鲜美、风殊独特，是一种低脂肪、高蛋白的优质水产食品，深受广大消费者欢迎。克氏原螯虾原产于北美洲，是我国目前养殖范围最广的淡水螯虾种类。近年来，江浙沪地区大中城市的年小龙虾消费量都在万吨以上，仅江苏地区小龙虾产品（虾仁和整肢龙虾）出口量达 5 500 t [1]。由于小龙虾生长环境复杂但适应性强，其体内外会携带大量的微生物 [2]，其中包括一些重要的人兽共患病原如致病性嗜水气单胞菌 [3]、副溶血性弧菌 [4]、致病性螺旋体 [5]等，若控制不当，食用后会对人体健康产生危害并造成贸易障碍 [6-7]。流水净化系统是国外常见的虾类净化体系 [8-9]，原料虾经过系统净化 1～ 2 d可以清除小龙虾肠道消化食物，改善外观，增加市场价值，并能够降低去壳虾仁的细菌数量 [9]。但我国目前小龙虾清洗净化体系尚未形成工业化规模，清洗操作简单，相关研究也很少，给小龙虾及其产品的安全性和品质带来隐患。随着我国小龙虾养殖和加工产业的不断发展以及为保证消费者的食用安全，开展相关研究非常必要。近年来研究表明，超声波在液体中的空化效应导致液体中产生瞬间高温、高压及其交变能够在极短的时间内杀灭和破坏多种微生物 [10]，利用超声波协同其他杀菌技术如热处理、紫外线、化学杀菌剂量在食品加工和水处理中显示广阔的应用前景 [11-12]。但超声波协同流水净化系统是否能够实现活体小龙虾中微生物有效减除目前国内外尚没有相关研究报道。本实验对克氏原螯虾在超声波协同流水净化处理过程中壳肉、腮部和肠道部位的菌落总数变化进行了研究，并应用随机扩增多态性 DNA（ random amplified polymorphic DNA， RAPD）指纹图谱结合 16S rDNA测序鉴定对菌相构成及变化进行了分析，旨在为原料克氏原螯虾的减菌化处理和高效清洗和净化体系建立奠定基础。

1 材料与方法

克氏原螯虾（Procambarus clarkii）样品来源于扬州本地的生态农业有限公司，平均质量为（ 39.5± 1.5） g/只。

营养肉汤琼脂培养基和 LB培养基广州环凯生物试剂有限公司；蛋白酶 K、 10× Buffer、 dNTPs、Taq酶、 DNA Marker、细菌 16S rDNA扩增引物（ 8F： 5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和 15R： 5’ -AAGGAG GTGATCCAGCCGCA-3’）、随机引物（ AP31： 5’ -AGGGGTCTTG-3’）生工生物工程（上海）股份有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

BS210S型电子天平北京赛多利斯天平有限公司； KQ5200超声波洗涤器昆山市超声仪器有限公司； FSH-2型可调高速匀浆机金坛市荣华仪器制造公司； UV-2401PC紫外分光光度计日本岛津公司； TG16-WS型台式高速离心机湘仪离心机仪器有限公司； SX-500型高压蒸汽灭菌锅日本 Tommy公司； DGX-9053B-2型生化培养箱上海福玛实验有限公司； ABI2720热循环仪美国 Life Technologies公司； DYYSB型稳压稳流电泳仪北京市六一仪器厂；凝胶成像系统法国 Vilber Lourmat公司。

从捕捞不超过 2 h的克氏原螯虾中，挑选色泽均一、体格健硕、活力强的个体，加冰块保藏并运送到实验室后立即实验。

随机选取 10只克氏原螯虾测定起始带菌量，其余虾随机分成 3组，每组 30只放入 3只容量 10 L的超声波洗涤器（ 40 kHz， 160 W），将净水器过滤的自来水接入洗涤池，调节水流量为 45 L/h，净化时间为 12 h。处理组 1不加超声波处理；处理组 2在 2 h超声处理 1次，持续时间 120 s；处理组 3在 2、 6 h超声处理 2次，持续时间均为 120 s，净化过程中每隔 4 h取样 1次，每次 10只用于菌落总数测定。

将克氏原螯虾头尾分开，无菌条件下分别取腮部，肠道以及尾部的壳与肉部分，将取下的三部分样品分别称质量后参考文献 [13]的方法与灭菌生理盐水按 1∶10（m /V）的比例混合并匀浆，无菌吸取匀浆 1 mL用灭菌生理盐水做 10倍递增稀释。选择 5个连续稀释度，每个稀释度取 250 ☒L涂布营养肉汤琼脂培养基，每个稀释度涂布 2个培养皿，倒置于 37℃培养箱培养 36 h，人工计数并计算菌落总数（ CFU/g），实验重复 3次，取平均值表示样品中的菌落总数。

每个样品选择 3个分离良好（菌落数在 100～ 300 CFU/g之间，菌落无黏连）的菌落计数平板挑取单菌落，每个平板随机挑取总菌落数的 10%～ 15%，挑取的单菌落在营养肉汤琼脂平板上划线纯化，挑取单菌落接种于 LB液体培养基， 37℃条件下培养 24 h，培养物进行标号后加 15%甘油于- 70℃条件下冻存备用。

细菌基因组 DNA的提取方法参照文献 [14]所述的十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB）法提取。

菌株之间的基因型差异通过 RAPD指纹图谱鉴别。以细菌基因组 DNA为模板，应用 AP31随机引物进行 RAPD扩增。将 DNA提取物用 ddH 2 O稀释至 50 ng/μL，随机引物浓度稀释至 10 pmol/μL，优化的聚合酶链式反应（ polymerase chain reaction， PCR）体系为：模板 2.0 ☒L， dNTPs 0.5 ☒L，随机引物 2.0 ☒L， 10× Buffer 2.5 ☒L， MgCl 2 2.5 ☒L，Taq酶 0.3 ☒L， ddH 2 O 15.7 ☒L； RAPD反应循环参数为： 94℃预变性 3 min， 94℃变性 1 min； 36℃退火 55 s； 72℃延伸 2 min， 35个循环； 72℃补充延伸 10 min。取 10 ☒L产物在 1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳（电压 5 V/cm） 1.5 h， EB染色 20 min，凝胶成像系统拍照记录，根据条带清晰程度，弥散背景以及带型强弱情况选择稳定的指纹图谱进行分析。

根据在指纹图谱中同一迁移率位点上的扩增条带的“有”和“无”进行数字化处理，用“ 1”表示“有”，“ 0”表示“无”，建立矩阵，应用 DPS7.05数据处理系统中的 0-1系统聚类分析程序，选择 Nei氏遗传距离和类平均法进行聚类分析。

以基因组 DNA为模板进行 16S rDNA的 PCR扩增。 PCR反应体系（ 50 ☒L）包括：模板（ 50 ng/☒L） 2.0 ☒L、 dNTPs（ 10 mmol/L） 2.0 ☒L、 25 pmol/☒L引物 8F和 15R各 2.0 ☒L、 10× Buffer 5.0 ☒L、 MgCl 2（ 25 mmol/L） 2.0 ☒L、Taq酶（ 5 U/☒L） 0.3 ☒L，最后加 ddH 2 O补足至 50 ☒L。热循环参数为： 94℃预变性 5 min； 94℃变性 1 min， 50℃退火 50 s， 72℃延伸 2.0 min， 35次循环； 72℃延伸 10 min。取 7.0 ☒L PCR产物用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测片段大小，其余 PCR产物委托生工生物工程（上海）有限公司测序，所得序列在 GenBank（ http∶// www. ncbi.nlm.nih.gov）数据库中进行在线比对，序列同源性大于 99%设为相同种。

2 结果与分析

由图 1A可知，虾壳+肉中的菌落总数为 6.64（ lg（ CFU/g）），由图 1B、 1C可知，腮部和肠腺中的菌落总数显著高于虾壳+肉，达到 7.18、 7.22（ lg（ CFU/g）），总体带菌水平略低于李明彦 [15]测定的结果（ 7.63～ 8.43（ lg（ CFU/g））），可能与虾来源与养殖环境有关。通过流水净化（处理组 1）可以显著降低不同部位的细菌含量，处理 12 h后的虾壳肉、腮部和肠腺中菌落总数比起始值分别降低了 0.59、 1.05、 0.44（ lg（ CFU/g）），腮中的细菌在流水中比其他部位容易去除。超声波处理能够显著促进净化过程中的细菌减除，在 2 h超声处理 120 s（处理组 2），虾壳+肉、腮部和肠腺中最终菌落总数比起始值分别降低了 1.71、 2.11、 0.84（ lg（ CFU/g））；处理组 3在 2 h和 6 h各超声处理 120 s，最终菌落总数分别降低了 2.18、 2.23、 1.01（ lg（ CFU/g）），处理组 2和 3中克氏原螯虾的最终菌落总数水平均极显著低于未加超声波的处理组 1（P＜ 0.01），结果表明超声波协同流水处理对克氏原螯虾的虾壳 +肉和腮部具有良好的减菌效果。虾死亡率是评价净化工艺的重要指标 [8-9]，本实验中在净化中使用两次超声处理（间隔 4 h，持续 120 s），净化结束后未出现克氏原螯虾死亡，活力与未处理组也无明显差别，表明在净化中加入适当超声波处理是可行的。

根据 1.3.4节方法，共分离获得 218个分离株，其中净化前分离菌落虾壳+肉部分 52个（编号为 KR1-1～ KR1-52），腮部分 61个（编号为 TS1-1～ TS1-61）；净化后分离菌落虾壳+肉部分 49个（编号为 KR3-1～ KR3-49），腮部分 56个（编号为 TS3-1～ TS3-56），所有菌落通过划线纯化后保种。

将所有分离株提取基因组 DNA，结果发现提取物 OD 260 nm /OD 280 nm在 1.86～ 2.28之间，定量结果显示 DNA质量浓度在 157～ 475 ☒g/mL，琼脂糖凝胶电泳结果表明 DNA完整，没有断裂和降解现象。以 100 ng DNA作为模板进行 RAPD指纹图谱扩增，共获得 21个不同的指纹图谱模式（ A～ U），表明所采用的随机引物 AP31和建立的体系具有较好的分型效率。克氏原螯虾中主要好氧和兼性厌氧菌群显示较高的分子多样性，按不同指纹图谱的相似性进行聚类分析，结果如图 2所示，在 Nei’ s遗传距离 50%处可以明显分成 5簇：Ⅰ（ 28%，包括 A、 B和 N）；Ⅱ（ 27%，包括 H、 O、 R、 Q、 T、 K和 J）；Ⅲ（ 27%，包括 L、 U、 M和 P）；Ⅳ（ 1%，包括 C）；Ⅴ（ 17%，包括 D、 G、 I、 S、 E和 F）。其中指纹图谱为 N、 P和 J的菌株占 47.7%，是克氏原螯虾中的优势菌群。 RAPD技术快速、廉价、简便，在微生物分子生态学研究中有着广泛的应用 [16]，但分型效率与随机引物序列密切相关，随机引物 AP31在前期研究中显示了良好的种内分型能力 [17]，本研究结果表明常规培养结合 AP31建立的 RAPD体系可以实现克氏原螯虾中菌群构成的快速分析。

研究表明 RAPD指纹图谱可以应用于鉴别种内差异 [18]，因此本研究将具有相同指纹图谱模式的菌株认为具有相同种属，选取代表菌株进行 16S rDNA测序鉴定，结果应用引物 8F和 15R及建立的 PCR方法能够顺利扩增出产物，片段大小为 1 500 bp左右，将扩增产物委托生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果进行在线比对，结果如表 1所示。结果表明 21个谱型的细菌属于 9个属 18个种，其中不动杆菌属（Acinetobacter sp.）包括 A型和 B型菌株；气单胞菌属（Aeromonas sp.）包括 R、 H、 T、 Q和 O型菌株；芽孢杆菌属（Bacillus sp.）包括 C型菌株；肠杆菌属（Enterobacter sp.）包括 J型菌株；黄杆菌属（Flavobacterium sp.）包括 N型菌株；假单胞菌属（Pseudomonas sp.）包括 E和 F型菌株；嗜冷杆菌属（Psychrobacter sp.）包括 D、 G、 I和 S型菌株；希瓦氏菌属（Shewanella sp.）包括 M、 L、 U和 P型菌株； K型菌株属于丛毛单胞菌属（Comamonas jiangduensis）。 Scott等 [2]研究表明 41%的淡水龙虾血淋巴中携带不动杆菌属、气单胞菌属、节细菌属、芽孢杆菌属、棒状杆菌属、黄杆菌属、假单胞菌属和弧菌属的细菌，本研究中共分离 9个属细菌，其中的 5个属与 Scott等研究一致，表明这些细菌是克氏原螯虾普遍携带的菌群，另外分离到的 4个属（肠杆菌属、嗜冷杆菌属、希瓦氏菌属、丛毛单胞菌属）可能与本地克氏原螯虾的养殖水体环境有关。

表1 不同基因型细菌分离株的16S rDNA测序鉴定结果
Table1 16S rDNA sequencing identification results for different genotypes of bacterial isolates

基因型代表菌株16S rDNA扩增片段长度/bp同源序列登录号最高同源性菌株种属同源性/% AKR1-31 445JX867754.1Acinetobacter bouvetii strain 3-699.8 BKR1-71 448JN228315.1Acinetobacter sp. D14（2011）99.9 CTS1-121 445EF433410.1Bacillus licheniformis strain BCRC 1170299.1 DTS1-151 442EU196312.1Psychrobacter psychrophilus NP4299.7 EKR1-121 435JX120705.1Pseudomonas aeruginosa strain HJ101299.2 FTS1-191 442KF030906.1Pseudomonas putida strain DNRS0399.8 GTS1-211 447AY639872.1Psychrobacter cibarius strain JG-22099.7 HTS1-241 455HQ832417.1Aeromonas piscicola strain CECT744399.9 IKR3-111 447AB334769.1Psychrobacter glacincola99.9 JTS3-151 431JQ435862.1Enterobacter cloacae strain 34499.5 KTS1-251 438JQ941713.1Comamonas jiangduensis strain YW198.4 LKR3-81 451CP000753.1Shewanella baltica OS18599.6 MTS1-341 444FJ002586.1Shewanella sp. S0599.8 NTS1-371 421JQ994263.1Flavobacterium granuli strain Fl2G199.5 OTS1-391 451KF413415.1Aeromonas veronii strain HL-999.7 PTS1-421 446AB681550.1 Shewanella putrefaciens strain NBRC 10172699.9 QTS1-431 447KF761305.1Aeromonas sobria strain XJJ0199.3 RTS1-451 441KJ150711.1Aeromonas hydrophila strain Jxsks299.5 STS1-471 448HQ698582.1Psychrobacter pulmonis strain LMG 101299.9 TTS1-521 453AM296506.1 Aeromonas salmonicida subsp. Masoucida100.0 UTS1-591 452CP001252.1Shewanella baltica OS22399.9

结合菌株指纹图谱的分布和测序鉴定结果，对超声波协同流水处理前后克氏原螯虾携带菌群的构成进行分析，结果如表 2所示。结果显示超过 50%的种群在净化以后不能被检测到，表明超声波协同流水处理极大地减少了虾壳肉和腮中携带的细菌种群数量，在虾壳+肉部分，起始菌群中包括 13个 RAPD谱型，净化以后能检测到的只有 6个 RAPD型，分别属于Pseudomonas putida 、Psychrobacter glacincola 、Shewanella baltica 、Flavobacterium granuli 、Shewanella putrefaciens 、Aeromonas sobria 6个种。在克氏原螯虾的腮部起始菌群极具多样性，能够检出 18个 RAPD型，净化以后只能检测到 9个 RAPD型，分别属于Aeromonas piscicola 、Aeromonas sobria 、Aeromonas hydrophila 、Pseudomonas putida 、Psychrobacter glacincola 、Enterobacter cloacae 、Flavobacterium granuli 、Shewanella putrefaciens 8 个种，其中Aeromonas sobria 、Enterobacter cloacae 、Flavobacterium granuli 和Shewanella putrefaciens是净化以后克氏原螯虾中残留的优势种群，这 4种细菌广泛分布于土壤和水体环境中，是鱼类等水生动物疾病的重要病原菌 [19-20]，但对龙虾的致病性尚未见报道，其中Aeromonas sobria和Enterobacter cloacae能够产生毒素并对人类具有致病性 [21-24]，Flavobacterium granuli和Shewanella putrefaciens水产食品的重要腐败菌 [20,25]，尤其Shewanella putrefaciens冷藏水产类的主要腐败菌，其腐败活性强，在低温和低氧条件下能够代谢产生腐败效应 [26]，在克氏原螯虾及其产品加工中应该针对这 4种细菌采取抑菌措施，确保产品安全和卫生。

表2 超声波协同流水净化对克氏原螯虾菌群构成的影响
Table2 Effect of ultrasonic and running water treatments on bacterial community composition of crawfish

注：—.未检出。

菌群种属基因型分离株数（构成百分比/%）起始菌群净化以后菌群壳+肉腮壳+肉腮Acinetobacter bouvetii A5 （9.6）1 （1.6）——Acinetobacter sp.B2 （3.8）2 （3.3）——Aeromonas hydrophila R—4 （6.6）—2（3.6）Aeromonas piscicola H—3 （4.9）—7（12.5）Aeromonas salmonicida T—2 （3.3）——Aeromonas sobria Q1 （1.9）3 （4.9）9（18.4）1（1.8）Aeromonas veronii O—2 （3.3）——Bacillus licheniformis C—2 （3.3）——Comamonas jiangduensis K—1 （1.6）——Enterobacter cloacae J5 （9.6）4 （6.6）—15（26.8）Flavobacterium granuli N13 （25.0）12 （19.7）17（34.7）9（16.1）Pseudomonas aeruginosa E2 （3.8）——Pseudomonas putida F3 （5.8）3 （4.9）2（4.1）1（1.8）Psychrobacter psychrophilus D1 （1.9）4 （6.6）——Psychrobacter cibariusG4 （7.7）1 （1.6）——Psychrobacter glacincolaI6 （11.5）—5（10.2）1（1.8）Psychrobacter pulmonis S—4 （6.6）——Shewanella sp. M—2 （3.3）——Shewanella baltica L3 （5.8）—5（10.2）—Shewanella baltica U2 （3.8）3 （4.9）—6（10.7）Shewanella putrefaciens P5 （9.6）8 （13.1）11（22.4）14（25.0）

3 结论

克氏原螯虾携带高水平的好氧和兼性好氧细菌，壳 +肉部分携带量为 6.64（ lg（ CFU/g）），腮部和肠腺中达到 7.18、 7.22（ lg（ CFU/g）），流水净化可以降低克氏原螯虾中的细菌载量，处理 12 h后，腮部细菌总数降低最多，达到 1.05（ lg（ CFU/g））。超声波处理能够显著促进流水净化过程中的细菌减少，两次超声处理使虾壳肉、腮部和肠道中细菌载量最终降低 2.18、 2.23、 1.01（ lg（ CFU/g）），表明超声波协同流水处理对活克氏原螯虾的虾壳 +肉和腮部具有良好的减菌效果。

克氏原螯虾携带菌群构成具有高度种属和分子多样性，主要包括不动杆菌属、气单胞菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属、黄杆菌属、假单胞菌属、嗜冷杆菌属、希瓦氏菌属以及Comamonas属，其中气单胞菌属、黄杆菌属、嗜冷杆菌属、希瓦氏菌属和肠杆菌属细菌为优势菌群。超声处理协同流水净化能有效降低虾壳肉和腮部携带的好氧和兼性好氧细菌种群数量， 50%以上的种群在净化以后不能被检测到，但温和气单胞菌（Aeromonas sobria）、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）、黄杆菌（Flavobacterium granuli）和腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）仍然是净化以后克氏原螯虾中残留的优势种群，在后期加工中可以针对这 4个属种细菌采取抑菌措施。

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Effect of Synergistic Purification with Ultrasonic and Running Water on Bacterial Load and Microflora in Crawfish (Procambarus clarkii)

YANG Zhenquan, ZHOU Haibo, GAO Lu, RAO Shengqi, YIN Yongqi, FANG Weiming
(College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China)

Abstract： Objective∶ To examine the effect of synergistic purification with ultrasonic and running water on bacterial quantity and community composition in live crawfish ( Procambarus clarkii ). Methods∶ The bacterial colony numbers in the unshelled meat, grills and intestinal parts of crawfish were determined during the purification process and changes in bacterial community composition were analyzed using random amplified polymorphic DNA (RAPD) fingerprint technique combined with 16S rDNA sequencing identification.Results∶ The purification procedure by ultrasonic combined with running water significantly reduced the bacterial loads in the unshelled meat, grills and intestine of crawfish to 2.18, 2.23 and 1.01 (lg (CFU/g)), respectively. A total of 218 single colonies were collected from bacterial counting plates, fingerprint patterns of 21 colonies of which were obtained through RAPD analysis. The 16S rDNA sequencing identification showed that the isolates with different fingerprint patterns belonged to 9 bacterial genera including 18 species, among which Aeromonas sp., Flavobacterium sp., Pseudomonas sp., Shewanella sp. and Enterobacter sp. were the predominant bacterial groups for crawfish shell, meat and gills. After being purified with ultrasonic and running water, the remaining bacterial groups were reduced to 9 species from 6 genera, among which, Aeromonas sobria , Enterobacter cloacae , Flavobacterium granuli and Shewanella putrefaciens were the major residual bacteria species. Conclusion∶ The synergistic purification with ultrasonic and running water is highly effective in reducing bacterial level and species in live crawfish.

基金项目：苏北科技发展计划项目（BC2013438）；江苏省科技支撑计划项目（BE2013733）；江苏省青蓝工程资助项目

作者简介：杨振泉（1975—），男，副教授，博士，主要从事食品微生物资源开发与利用研究。E-mail：yangzq@yzu.edu.cn

超声波协同流水净化对克氏原螯虾中菌落总数及菌相构成的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

3 结论