猪肝乙醇脱氢酶的分离纯化及部分性质

（西南大学生命科学学院，重庆市甘薯工程研究中心，三峡库区生态环境教育部重点实验室，重庆 400715）

摘要：新鲜猪肝经匀浆、缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析及Superdex-200凝胶过滤层析，获得电泳纯的乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）。纯化结果显示：该酶比活力为1 622.33 U/mg，回收率为29.05% ，纯化倍数为34.58；该酶分子质量约为171.79 kD，亚基分子质量约为43.68 kD。ADH酶学性质研究显示：最适反应温度和pH值分别为45 ℃和10.0；在25～45 ℃及pH 7.5～9.0范围内稳定性较好；最适条件下测得该酶对乙醇的 K m 值为19 mmol/L；正丁醇、氯仿、异丙醇、十二烷基硫酸钠、草酸、Zn 2+ 、Cu 2+ 、Ag + 对该酶的抑制作用最强，Mg 2+ 对该酶有激活作用，EDTA对该酶有双重作用。

乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase ，ADH ）广泛存在于人和哺乳动物的肝脏、植物组织及微生物中，是生物体内重要的氧化还原催化剂之一，作为生物体内主要短链醇代谢的关键酶，其在很多生理过程中起着重要作用 [1-6] 。该酶广泛应用于临床、化工及食品等领域 [7-9] 。国内市场上的ADH 产品几乎都来源于酿酒酵母，因其来源单一、且高纯度ADH 价格昂贵，所以寻求来源广泛、纯度高、成本低廉的ADH 在理论和实践方面均具有十分重要的意义。目前国内外研究人员已对多种来源的ADH 进行了相关研究 [10-12] ，但尚未见猪肝ADH 的相关报道。本实验以价廉易得的猪肝为原材料提取ADH 并对其部分酶学性质进行研究，旨在为ADH 的获得提供一条新途径，更为以后对ADH 的深入研究提供参考。

1 材料与方法

考马斯亮蓝 R-250、三羟甲基氨基甲烷美国 Bio-Rad公司； DEAE-Sepharose、蛋白质十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）标准品及 Superdex-200凝胶层析分子质量标准品美国 GE Healthcare公司；甲叉 -双丙烯酰胺、丙烯酰胺瑞士 Fluka公司；其余试剂均为国产分析纯。

UV-2550型分光光度计、蛋白核酸定量仪日本岛津公司； MC4L冷冻干燥机德国 Uni Equip公司； Mill-Q plus超纯水仪美国 Millipore公司； pHS-32W微电路 pH计上海理达仪器厂；精密电子天平瑞士 Mettler-Toledo公司； GL-21M高速冷冻离心机湖南湘仪实验室仪器开发有限公司； AKTA prime plus蛋白质纯化系统美国 GE公司；垂直板电泳槽和电泳仪美国 Bio-Rad公司。

将新鲜猪肝去除结缔组织和脂肪，称取 50 g，用剪刀剪碎后按 1∶4的比例加入预冷的 Tris-HCl缓冲液（ pH 8.0）中，匀浆后放于 4℃冰箱中静置抽提 2 h，离心 30 min（ 12 000 r/min， 4℃）后所得上清液即为粗酶液。

向粗酶液中加入硫酸铵粉末至 30%饱和度， 4℃条件下盐析 2 h， 4℃、 12 000 r/min离心 30 min，弃沉淀收集上清液；往上清液中加入硫酸铵粉末至 70%饱和度， 4℃盐析 1.5 h， 4℃、 12 000 r/min离心 30 min，弃上清收集沉淀；将沉淀用 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（ pH 8.0）溶解，再用 10 mmol/L的 Tris-HCl缓冲液（ pH 8.0）作透析液，于 4℃冰箱中透析 24 h后，即得初酶液。

DEAE-Sepharose离子交换层析柱用 50 mmol/L、 pH 8.0的 Tris-HCl缓冲液（含 1 mmol/L二硫苏糖醇）平衡好后，取 8 mL初酶液上柱，用 0～ 0.5 mol/L的 NaCl溶液（用 50 mmol/L、 pH 8.0的 Tris-HCl缓冲液配制）进行线性梯度洗脱，流速 0.5 mL/min，每管收集 5 mL；测定各管 ADH活力和蛋白质含量，收集活性较高的酶液，透析并冷冻干燥后保存备用。

Superdex-200层析柱用 50 mmol/L、 pH 8.0的 Tris-HCl缓冲液（含 1 mmol/L二硫苏糖醇）平衡后，取在 1.3.3节中收集的干燥后的样品，用双蒸水溶解后取 3 mL上柱，用 50 mmol/L、 pH 8.0的 Tris-HCl缓冲液（含 1 mmol/L二硫苏糖醇）缓冲液洗脱，流速 0.3 mL/min，每管收集 3 mL；测定各管 ADH活力和蛋白含量；收集活性较高的几管酶液， 4℃超纯水透析脱盐 24 h，冷冻干燥后得到 ADH纯品，并于- 20℃冰箱保存备用。

参照文献 [13]方法（稍作改动）进行测定： ADH在催化乙醇转化为乙醛的同时，将辅酶 NAD +还原成 NADH，而 NAD +和 NADH各在 260、 340 nm波长处有最大吸收峰，因此以 NAD +为辅酶的脱氢酶都可以通过测定 340 nm吸光度的变化，定量测定酶的活力。本实验测酶体系包括： 3 mL缓冲液（ 0.1 mol/L、 pH 8.0的 Tris-HCl）、 0.4 mL 0.2 mol/L的乙醇、 0.1 mL 4.5 mmol/LNAD +、 80μL酶液。酶活力单位定义为：将A 340 nm在 25℃、 1 min内每变化 0.001定义为一个活力单位（U）。

通过SDS-PAGE法对1.3.4节中获得的酶活力较高管ADH进行纯度鉴定及亚基分子质量的测定，制备质量分数分别为5% 的浓缩胶和12% 的分离胶，上样量为10μL ，经SDS-PAGE法测定ADH亚基分子质量。用凝胶层析法测定ADH全分子质量 [14] 。

在 pH 8.0条件下、不同温度（ 25～ 80℃）下测定 ADH的酶活力，将酶活力最高值记为 100%，计算各温度下的相对酶活力，以确定其最适反应温度。将酶液分别置于不同温度（ 25～ 75℃）下保温不同的时间后，测定 ADH的酶活力，将不保温时测得的酶活力记为 100%，计算温育不同时间下的相对酶活力，以研究该酶的热稳定性。

在 45℃，不同 pH值（ 4.0～ 10.6）的缓冲体系中测定 ADH的酶活力，将酶活力最高值记为 100%，计算各 pH值条件下的相对酶活力，以确定其最适反应 pH值。将酶液分别置于不同 pH值的缓冲液中孵育 2 h后分别测定其酶活力，将酶活力最高值记为 100%，计算各不同 pH值缓冲液孵育后酶液的相对活力，以研究该酶的 pH值稳定性。

采用双倒数作图法 [15]（ Lineweaver-Burk法），以不同浓度（ 10～ 100 mmol/L）的乙醇作为底物，在 45℃、 pH 10.0最适反应条件下测定猪肝 ADH的酶活力，求出猪肝 ADH的K m值。

将 ADH酶液分别与等体积的不同体积分数的氯仿、甲醇、异丙醇、正丁醇混合并在常温下孵育 20 min后，分别在最适反应条件（ 45℃、 pH 10.0）下测酶活力，将等体积双蒸水稀释后酶液的活力记为 100%，计算 ADH的相对酶活力。

将 ADH酶液分别与等体积的不同浓度的抗坏血酸、草酸、尿素、乙二胺四乙酸（ ethylenediamine tetraacetic acid， EDTA）、 SDS混合并在常温下孵育 20 min后，分别在最适反应条件（ 45℃、 pH 10.0）下测酶活力，将等体积双蒸水稀释后酶液的活力记为 100%，计算 ADH的相对酶活力。

将 ADH酶液分别与等体积不同浓度的金属离子（ Zn 2+、 K +、 Co 2+、 Mg 2+、 Ag +、 Ca 2+、 Cu 2+、 Fe 3+、 Mn 2+）混合，在常温下孵育 20 min后，分别在最适反应条件（ 45℃、 pH 10.0）下测酶活力，将等体积双蒸水稀释后酶液的活力记为 100%，计算 ADH的相对酶活力。

2 结果与分析

猪肝 ADH初酶液经 DEAE-Sepharose离子交换层析后结果如图 1所示，该酶活力峰主要集中在 10～ 18管，其中第 14管酶活力最高，收集酶活性较高管的酶液，冷冻干燥后用于凝胶过滤层析，经 Superdex-200凝胶层析，洗脱图谱如图 2所示，酶活性峰主要集中在 27～ 35管，其中第 31管为酶活力最高峰，收集第 31管酶液，用双蒸水透析 24 h后冷冻干燥，通过 SDS-PAGE电泳，显示为单一条带（图 3），说明该酶经纯化后达到了电泳纯。该酶的整个分离纯化结果如表 1所示，最终得到猪肝 ADH的回收率为 29.05%，纯化倍数为 34.58，酶比活力为 1 622.33 U/mg。

图1 猪肝ADH的DEAE-Sepharose层析图谱
Fig.1 DEAE-Sepharose chromatography of ADH from pig liver

图2 猪肝ADH的Superdex-200层析图谱
Fig.2 Superdex-200 chromatography of ADH from pig liver

表1 猪肝ADH的纯化结果
Table1 Purification of ADH from pig liver

纯化步骤总酶活力/U总蛋白质量/mg酶比活力/（U/mg）回收率/%纯化倍数匀浆后离心159 562.53 400.3846.921001硫酸铵分级沉淀121 8751 266.596.2376.382.05 DEAE-Sepharose54 60078.29697.4134.2214.86 Superdex-20046 35028.571 622.3329.0534.58

纯化后的 ADH经 SDS-PAGE电泳显示为单一条带（图 3），测得 ADH亚基分子质量约为 43.68 kD；用 Superdex-200凝胶过滤层析测得全酶的分子质量为 171.79 kD（图 4），由此可以推断该酶由 4个相同的亚基组成。

图3 猪肝ADH的SDS-PAGE图谱
Fig.3 SDS-PAGE of ADH from pig liv er

图4 Superdex-200凝胶过滤层析测得的猪肝ADH分子质量
Fig.4 Molecular weight estimation of ADH from pig liver by Superdex-200 gel filtration chromatography

图5 温度对猪肝ADH活力的影响
Fig.5 Effect of temperature on the activity of ADH from pig liver

最适温度的实验结果如图 5所示， 25～ 45℃时，酶活力随温度升高而增加，当温度高于 45℃酶活力随温度升高而下降，因此该酶最适温度为 45℃，其温度作用范围广，在 80℃条件下其相对酶活力仍保持在 55.4%。温度稳定性的实验结果如图 6所示， ADH在 25～ 45℃范围内热稳定性较好，保温 3 h后其相对酶活力也分别保持在 99.2%、 98.2%和 86.2%；超过 55℃保温后酶活力迅速下降，在 65℃保温 2 h酶活力完全消失， 75℃保温 1 h酶活力完全消失。

图6 猪肝ADH的热稳定性
Fig.6 Thermal stability of ADH from pig liver

图7 pH值对猪肝ADH活力的影响
Fig.7 Effect of pH on the activity of ADH from pig liver

如图 7所示，该酶在 pH 10.0时有最大活力，在 pH 7.5时其相对酶活力达到 95.5%。 pH值稳定性实验结果如图 8所示，纯化后的酶液在 pH 7.5～ 9.0条件下孵育 2 h后，酶活力均保持在较高水平（ 75%以上）； pH值小于 7.0的酸性条件或 pH值大于 9.0的碱性条件下保存 2 h其酶活力迅速下降。

图8 猪肝ADH的pH值稳定性
Fig.8 pH Stability of ADH from pig liver

在 45℃， pH 10.0条件下以不同浓度的乙醇作为底物，测定该酶活力，并采用双倒数作图法求得 ADH的米氏常数，结果如图 9所示，其K m值为 19 mmol/L。

图9 双倒数法测定猪肝ADH的米氏常数图
Fig.9 K mdetermination of ADH from pig liver by Lineweaver-Burk plot

图10 氯仿、异丙醇、甲醇、正丁醇对猪肝ADH活力的影响
Fig.10 Effects of chloroform, isopropyl alcohol, methanol and
n-butanol on the activity of ADH from pig liver

如图 10所示，氯仿、异丙醇、甲醇、正丁醇 4种有机溶剂对该酶均有较强的抑制作用，且随着有机溶剂体积分数越大其抑制作用越强，其中正丁醇对该酶抑制作用最为强烈，当体积分数达到 20%时该酶活性完全丧失。

由图 11a可知， SDS对该酶有很强的抑制作用，当浓度达到 3 mmol/L时，酶几乎完全失活； EDTA对该酶活性的影响具有双重作用，低浓度时对该酶有一定的激活作用，当其浓度大于 10 mmol/L时对该酶有一定的抑制作用；草酸和尿素对该酶具有抑制作用，且此作用会随着化合物浓度增高而增强；抗坏血酸对该酶的影响最小（图 11b）。

图11 不同化合物对猪肝ADH活力的影响
Fig.11 Effect of various compounds on the activity of ADH from pig liver

通过实验发现，Ca 2+ 、Mn 2+ 、K + （图12a、12c）对该酶的活力影响不大；Mg 2+ 对该酶有一定的激活作用（图12a）；Zn 2+ 、Ag + 、Cu 2+ 、Fe 3+ 、Co 2+ 对该酶均有不同程度的抑制作用，其中Zn 2+ 抑制作用最强，当其浓度达到0.4 mmol/L时酶活力已完全丧失，Ag + 和Cu 2+ 浓度达到0.5 mmol/L时该酶也彻底失活。

图12 不同金属离子对猪肝ADH活力的影响
Fig.12 Effect of metal ions on the activity of ADH from pig liver

3 讨论

本实验以猪肝为原材料，经分离纯化得到了电泳纯的 ADH，利用此方法分离纯化 ADH相较于已有研究具有以下优势：猪肝廉价易得、一年四季均可取材、纯化步骤简单、实验周期短、其回收率和纯化倍数高。相较于兔肝 ADH [16]，本实验减少了 DEAE-纤维素除杂蛋白及超滤步骤，但仍获得了电泳纯的 ADH。

猪肝 ADH最适温度为 45℃，与柿果实 [17]和醋酸杆菌 [18]一致，高于酿酒酵母（ 37℃） [19]低于硬质小麦 [20]（ 50℃）。该酶在 80℃时相对酶活力为 55.4%，相比于柿果实（ 60℃，完全失活）、蚕豆 [21]（ 70℃，完全失活）、酿酒酵母 [19]（ 45℃，活性急剧下降），其温度作用范围广。该酶在 25～ 45℃条件下最为稳定，较醋酸杆菌（ 20～ 30℃）、酿酒酵母（ 30～ 40℃），该酶热稳定性范围较大，较耐热。

pH 10.0时猪肝 ADH活性最高，这与多数豆类 [21]一致，与人血清 ADH [22]（ pH 9.0）接近，较莲雾 [24]（ pH 11.0）低，比蚕豆 [21]（ pH 8.7）高。该酶在 pH 7.5和 10.0均出现酶活峰，这与兔肝（ pH 10.8和 7.5）、松鼠猴（ pH 10.8和 8.2）类似。 ADH的最适 pH值不同可能与材料来源不同相关，如植物 ADH的最适 pH值多偏碱性，很多微生物如草莓中提取的扭脱甲基杆菌、葡萄杆菌 [26]和醋酸杆菌 [27] ADH的最适 pH值均出现在酸性区域。

猪肝 ADH亚基分子质量约为 43.68 kD，与马肝 [28]（ 44 kD）类似，高于栖热菌 [29]（ 37.5 kD）、黄杆菌 [30]（ 40 kD）、酒类酒球菌 [31]（ 35 kD）。该酶对底物乙醇的K m值为 19 mmol/L，与柿果实（ 8.33 mmol/L）、兔肝（ 3.0 mmol/L）、人血清 [22]（ 3.03 mmol/L）、酿酒酵母（ 4.5 mmol/L）相比有较大差异，说明不同材料、不同组织来源的乙醇脱氢酶对底物的亲和力不同，可能是因为生物体为了能更好地适应环境，满足生长代谢的需求而表现出的生物特异性，这是生物体基因不断进化并选择性表达的结果 [32]。

氯仿、异丙醇、甲醇、正丁醇均对该酶有抑制作用，可能原因如下：酶在有机溶剂环境中受到了扩散限制和立体障碍，使得酶与底物接触受到限制；该酶在有机溶剂中的构象发生了变化，酶只有当其分子本身具有一定构象时才有一定的催化活性，有机溶剂缺乏提供多种氢键的能力，而且由于它们的低介电常数往往会导致蛋白质带电基团之间更强的静电作用，使蛋白质的“刚性”更强，使其活性降低 [33] 。

不同金属离子对 ADH活性影响有很大差异， Ca 2+、 Mn 2+、 K +对该酶活力影响不大； Zn 2+、 Ag +、 Cu 2+、 Fe 3+、 Co 2+对该酶均有不同程度的抑制作用，这与大多数文献的相关报道结果类似 [23-24]，其中 Zn 2+、 Ag +和 Cu 2+在低浓度下即可使酶完全失活，据悉此 3种离子可与硫醇发生反应生成硫醇盐 [34]，可能正是这一结构的变化影响了酶活性中心构象，导致酶失活； Mg 2+对该酶有一定的激活作用，这与米根霉 [35]和啤酒废酵母中 Mg 2+对该酶的抑制作用不同，这说明同种金属离子对不同来源的同一种酶的活性会产生不同的效应。

自 1937年首次分离出乙醇脱氢酶以来，国内外对该酶的研究从未间断，对于多种来源的 ADH的研究也已深入到分子水平，通过以上对于不同来源的 ADH的各个性质进行比较，了解到不同来源的酶具有不同的生化性质，由此决定了其不同的实际用途。因此为了更好的开发和利用猪肝 ADH，还有待在分子水平上对其进行深入研究。

[1] CHROSTEK L, JELSKI W, SZMITKNOWSKI M, et al. Alcohol dehydrogenase(ADH) isoenzymes and aldehyde dehydrogenase(ALDH) activity in the human pancreas[J]. Digestive Diseases and Sciences, 2003, 48(7)∶ 1230-1233.

[2] SUN Hongwei, PLAPP B. Progressive sequence alignment and molecular evolution of the Zn-containing alcohol dehydrogenase family[J]. Journal of Molecular Evolution, 1992, 34(6)∶ 522-535.

[3] CLEMENS D L, HALGARD C M, MILES R R, et al. Establishment of a recombinant hepatic cell line stably expressing alcohol dehydrogenase[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1995, 321(2)∶ 311-318.

[4] NICULESCU M, ERICHSEN T, SUKHAREV V. Quinohemo protein alcohol dehydrogenase-based reagentless amperometric biosensor for ethanol monitoring during wine fermentation[J]. Analytica Chimica Acta, 2002, 37(463)∶ 39-51.

[5] 霍丹群, 张云茹, 侯长军. Acetobacter Z127乙醇脱氢酶的纯化及酶学性质[J]. 重庆大学学报∶ 自然科学版, 2006, 29(4)∶ 65-68.

[6] 祁月魁, 安家彦, 陈莉. 醋酸杆菌AS1.41产乙酸发酵条件的优化[J].大连工业大学学报, 2009, 28(1)∶ 23-25.

[7] 胡建强, 刘风兰. 血清乙醇脱氢酶活性测定及临床应用[J]. 天津医科大学学报, 2001, 7(1)∶ 110-111.

[8] 伏建峰, 史清海, 路西春, 等. 乙醇脱氢酶法测定血浆中乙醇[J]. 西北国防医学杂志, 2005, 26(5)∶ 345-347.

[9] 张海生, 陈锦屏. 柿饼加工中脱涩和反涩机理的研究[J]. 食品工业科技, 2003, 24(12)∶ 39-40.

[10] 隋德新, 张艳华, 吴燕. 酵母乙醇脱氢酶的快速纯化[J]. 江苏农学院学报, 1988, 9(3)∶ 32-33.

[11] CHENG Fangfang, TAO Hu, YAN An, et al. Purification and enzymatic characterization of alcohol dehydrogenase from Arabidopsis thaliana[J]. Protein Expression and Purification, 2013, 90(2)∶ 74-77.

[12] 姜萍. 乙醇脱氢酶应用与纯化进展[J]. 上海化工, 2008, 33(12)∶31-33.

[13] 汤甜甜, 周亮, 吉鹏飞, 等. 人乙醇脱氢酶ADH1B2在毕赤酵母中的表达及活性分析[J]. 浙江大学学报, 2012, 39(5)∶ 557-563.

[14] 李建武, 余瑞元. 生物化学实验原理和方法[M]. 北京∶ 北京大学出版社, 1994∶ 171-223.

[15] 陈钧辉, 陶力, 朱婉华, 等. 生物化学实验[M]. 5版. 北京∶ 科学出版社, 2004∶ 204-205.

[16] HOSHINO T. Rabbit liver alcohol dehydrogenase∶ purification and properties[J]. Journal of Biochemistry, 1985, 97(4)∶ 1163-1172.

[17] 梁银娜, 李宝. 柿果实乙醇脱氢酶酶学特性研究[J]. 中国农业大学学报, 2011, 16(5)∶ 65-70.

[18] 张晓霞. 乙醇脱氢酶的制备工艺及酶学性质研究[D]. 西安∶ 陕西科技大学, 2008∶ 36-48.

[19] 吴桂英. 酿酒酵母乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的研究[D]. 武汉∶ 武汉工程大学, 2007∶ 51-56.

[20] SUSEELAN K N, MITRA R, BHATIA C R. Purif ication and characterization of variant alcohol dehydrogenase isozymes from durum wheat[J]. Biochemical Genetics, 1987, 25(7/8)∶ 581-590.

[21] LEBLOVA S, MANCAL P. Characterization of plant alcohol dehydrogenase[J]. Physiologia Plantarum, 1975, 34(3)∶ 246-249.

[22] 卓孝福, 陈仁奋, 郑靖. 血清乙醇脱氢酶活性测定及临床意义[J]. 上海医学检验杂志, 1998, 1 3(2)∶ 84-86.

[23] KOUTSOM POGERAS P, KYRIACOU A, ZABETAKIS I. Characterization of NAD-dependent alcohol dehydrogenase enzymes of strawberry’s achenes (Fragaria x ananassa cv. Elsanta) and comparison with respective enzymes from Methylobacterium extorquens[J]. LWTFood Science and Technology, 2010, 43(5)∶ 828-835.

[24] HSU Y M, T SENG M J, LIN C H. Purification and characterization of alcohol dehydrogenase isozymes in flooded wax-apple (Syzygium samarangense Merr. et Perry) roots[J]. Taiwanese Journal of Agricultural Chemistry and Food Science, 2002, 40(1)∶ 19-27.

[25] LEBLOVD S. Isolation and partial characterization of alcohol dehydrogenase from broad bean (Vicia faba)[J]. Australian Journal of Plant Physiology, 1974, 1(4)∶ 579-582.

[26] ISLAMI M, SHABANI A, SAIFI-ABOLHASSAN M, et al. Purification and characterization of alcohol dehydrogenase from Gluconobacter suboxydans[J]. Pakistan Journal of Biological Sciences, 2008, 11(2)∶ 208-213.

[27] ABOLHASS AN M S, SEPEHR S, ISLAMI M, et al. Purification and characterization of membrane-bound quinoprotein alcohol dehydrogenase from an ativestrain of Acetobacter[J]. Journal of Biological Sciences, 2007, 7(2)∶ 315-320.

[28] QUAGLIA D, IRWIN J A, PARADISI F. Horse liver alcohol dehydrogenase∶ new perspectives for an old enzyme[J]. Molecular Biotechnology, 2012, 52(3)∶ 244-250.

[29] HOLLRIGL V, HOLLMANN F, KLEEB A C, et al. TADH,the thermo stable alcohol dehydrogenase from Thermus sp. ATN1∶ a versatile new biocatalyst for organic synthesis[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, 81(2)∶ 263-273.

[30] TAKAYUKI K, TADAO O, IKUO M, et al. A cold-active and thermostable ADH of a psychrotorelant from Antarctic seawater, Flavobacterium frigidimaris KUC-1[J]. Extremophiles, 2007, 11(2)∶257-267.

[31] VALLET A, SANTARELLI X, LONVAUD-FUNEL A, et al. Purification of an alcohol dehydrogenase involved in the conversion of methional to methionol in Oenococcus oeni IOEB 8406[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2009, 82(1)∶ 87-94.

[32] 孙芳, 任美凤, 胡瑞斌, 等. 韭菜酸性磷酸酶的分离纯化和部分性质研究[J]. 食品科学, 2013, 34(17)∶ 187-191. doi∶ 10.7506/spkx1002-6630-201317040.

[33] 彭立凤. 有机溶剂对酶催化活性和选择性的影响[J]. 化学进展, 2000, 12(3)∶ 297-299.

[34] JOCELYN P C. Biochemistry of the SH Group[M]. New York∶Academic Press, 1972∶ 63-93.

[35] 郑志, 姜绍通, 罗水忠, 等. 米根霉乙醇脱氢酶粗酶液的特性研究[J].食品科学, 2006, 27(9)∶ 115-118.

Isolation, Purification and Partial Characterization of Alcohol Dehydrogenase from Pig Liver

FU Ting, WANG Dan, WAN Ji, TANG Yunming*
(Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, Chongqing Sweetpotato Engineering Research Center, School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Abstract：Electrophoresis-purity alcohol dehydrogenase (ADH) from pig liver was obtain ed through homogenization, buffer extraction, ammonium sulfate fractionation, DEAE-Sepharose ion-exchange chromatography and Superdex-200 gel fi ltration chromatography. Results showed that the specifi c activity of the purifi ed ADH was 1 622.33 U/mg with an activity recovery of 29.05% and a purifi cation fold of 34.58. The relative molecular weight of the ADH was approximately 171.79 kD, in which the subunit molecular mass was roughly 43.68 kD. The enzymatic properties showed that the optimum temperature and pH for the ADH were 45 ℃and 10.0, respectively. The enzyme was stable at 25–45 ℃and pH 7.5–9.0, and its apparent K mtowards ethanol was 19 mmol/L. The enzyme activity of ADH could be strongly inhibited by n-butanol, chloroform, isopropanol, sodium dodecyl sulfate, oxalic acid, Zn 2+, Cu 2+, and Ag +, and activated by Mg 2+. EDTA had a dual effect on this enzyme.

Key words： pig liver; alcohol dehydrogenase; isolation and purification; enzymatic properties

作者简介：傅婷（1990—），女，硕士研究生，主要从事蛋白质与酶工程研究。E-mail：futing3526@126.com

*通信作者：唐云明（1960—），男，教授，博士，主要从事蛋白质与酶工程研究。E-mail：tbright@swu.edu.cn

猪肝乙醇脱氢酶的分离纯化及部分性质

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨 论

3 讨论