α-淀粉酶在不同地衣芽孢杆菌宿主菌中分泌表达的对比分析

（1.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，湖北武汉 430070；2.华中农业大学食品科学技术学院，湖北武汉 430070）

摘要：研究不同地衣芽孢杆菌（ Bacillus licheniformis）宿主菌对 α -淀粉酶分泌表达的影响。以 Bacillus subtilis的 P43启动子， B. licheniformis WX-02 α -淀粉酶基因的信号肽、编码区和终止子序列为表达原件，构建了 α -淀粉酶分泌表达载体 pP43SAT。将 pP43SAT分别转入 3株 B. licheniformis宿主菌： WX-02（ Δ amyL）、 BL9和 BL10，获得 3株 α -淀粉酶基因工程菌WX-02（ Δ amyL，pP43SAT）、BL9（pP43SAT）和BL10（pP43SAT），并将构建的 3株工程菌进行发酵对比分析。BL9（pP43SAT）和BL10（pP43SAT）的淀粉酶发酵活力分别达到94.01 U/mL和101.94 U/mL，比原始宿主菌WX-02（ Δ amyL，pP43SAT）分别提高了21%和31%，这说明BL9和BL10新型宿主菌有利于淀粉酶的分泌表达。本研究证明多蛋白酶基因缺失可显著提高 α -淀粉酶的表达，为 α -淀粉酶的高效表达提供了新型宿主菌和新策略。

α -淀粉酶可水解淀粉，产生糊精、低聚糖和单糖，在食品、医药和纺织品领域应用广泛 [1-2]。基因工程技术常用来提高目标蛋白的产量，李金霞等 [3]通过大肠杆菌宿主菌实现了α -淀粉酶的表达，但大肠杆菌表达系统易形成包涵体，且外膜含有对人和动物有毒性的内毒素脂多糖，产物分离纯化比较困难 [4]。相比之下，地衣芽孢杆菌为食品级微生物，具有较高的安全性，且最适生长温度高，生长速度快，细胞壁组成简单，蛋白分泌能力强 [5]。王凤寰等 [6]通过同源整合技术，构建了含透明颤菌血红蛋白基因的地衣芽孢杆菌宿主菌，显著提高了α -淀粉酶的发酵活性。牛丹丹等 [7]采用同源介导α -淀粉酶基因扩增技术，提高了基因拷贝数，显著提高了α-淀粉酶的发酵活性。杨艳华等 [8]通过过量表达调控基因degQ，显著提高了α -淀粉酶的表达水平。 Ghang等 [9]选择不同酿酒酵母表达α -淀粉酶基因，最大淀粉酶活性提高了 10倍，而 Galdino等 [10]发现α -淀粉酶在酿酒酵母中的表达活力仅为 3.93 U/mL。由此可见，宿主菌对外源蛋白的表达影响很大，宿主菌的改造对α -淀粉酶的发酵生产至关重要。

宿主菌的胞外蛋白酶可降解目标蛋白，从而降低目标蛋白的表达量。因此，缺失其胞外蛋白酶可能抑制目标蛋白的降解，从而提高目标蛋白的表达量。 Ignatova等 [11]采用不同的大肠杆菌宿主菌表达青霉素酰化酶，发现多蛋白酶基因缺失可显著提高青霉素酰化酶的表达量。 Nguyen等 [12]利用 8蛋白酶基因缺失的枯草芽孢杆菌 WB800为宿主菌，显著提高了纳豆激酶的表达量。 WX-02为本课题组前期筛选的一株地衣芽孢杆菌 [13]，可高产聚谷氨酸 [14-15]、 2,3-丁二醇 [16]和乙偶姻 [17]，在 WX-02的基础上，通过叠加敲除的手段分别构建了多蛋白酶基因缺失的新型宿主菌，前期研究结果证实多基因缺失宿主菌可显著提高纳豆激酶的表达量 [18]。多蛋白酶基因缺失的宿主菌还未应用于α -淀粉酶的表达，无法理解宿主菌蛋白酶缺失对α -淀粉酶的影响，阻碍该策略在α -淀粉酶表达中的应用。本研究以前期构建的多基因缺失宿主菌 BL9和 BL10为宿主菌进行α -淀粉酶的分泌表达，评价多蛋白酶基因缺失对α -淀粉酶表达的影响，为α -淀粉酶的高效表达提供新思路。

1 材料与方法

表 1为实验所用菌株。其中 BL9缺失 7个蛋白酶基因（mpr、vpr、aprX、epr、bpr、wprA、aprE、amyL）和 1个鞭毛蛋白基因（hag），同时为了排除自身基因组中α -淀粉酶基因对α -淀粉酶表达的影响，还缺失了α -淀粉酶基因（amyL）， BL10是在 BL9的基础上进一步敲除了蛋白酶基因bprA。

表1 实验所用菌株
Table1 A list of the strains used in this study

菌株特性Escherichia coli DH5αsupE44 ΔlacU169（f 80 lacZΔM15）hsd R17 recA1 gyrA96 thi1 relA1 B. licheniformis WX-02野生型B. licheniformis WX-02（ΔamyL）WX-02（ΔamyL）B. licheniformis BL9WX-02（Δhag、Δmpr、Δvpr、ΔaprX、Δepr、Δbpr、ΔwprA、ΔaprE、ΔamyL）B. licheniformis BL10WX-02（Δhag、Δmpr、Δvpr、ΔaprX、Δepr、Δbpr、ΔwprA、ΔaprE、ΔamyL、ΔbprA）WX-02（ΔamyL，pP43SAT）W X-02 （ΔamyL）携带pP43SAT BL9 （pP43SAT）BL9携带pP43SAT BL10 （pP43SAT） BL10携带pP43SAT BL10（PHY300PLK）BL10携带pHY300PLK

DNA聚合酶、 dNTPs、各种 DNA限制性内切酶、 T4 DNA连接酶、 RNA酶、蛋白质标准 Marker、 DNA Marker日本 TaKaRa公司； DNA回收试剂盒武汉思特进科技发展有限公司；琼脂糖法国 Biowest公司；氨苄青霉素（ ampicillin， Amp）、四环素（ tetracycline， Tet）、蛋白胶配制所需试剂美国 Sigma公司；其他主要生化试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

LB培养基：蛋白胨 10 g/L、酵母浸出粉 5 g/L、 NaCl 10 g/L， pH 7.0～ 7.2，固体培养基加琼脂 15 g/L。

芽孢杆菌感受态制备培养基：生长培养基为含 0.5 mol/L山梨醇的 LB培养基；洗涤培养基为 0.5 mol/L山梨醇， 0.5 mol/L甘露醇， 10%甘油；恢复培养基为含 0.5 mol/L山梨醇和 0.38 mol/L甘露醇的 LB培养基。

淀粉酶发酵培养基：玉米浆干粉 5 g/L、酵母粉 5 g/L、蛋白胨 10 g/L、柠檬酸钠 12 g/L、 K 2 HPO 4· H 2 O 1 g/L、 MgSO 4· 7H 2 O 0.5 g/L、 CaCl 2· 2H 2 O 0.15 g/L， pH 7.0～ 7.2。

抗生素质量浓度：大肠杆菌克隆筛选和培养使用 Amp质量浓度为 100μg/mL；芽孢杆菌转化子筛选使用 Tet质量浓度为 20μg/mL，重组菌株的培养使用 Tet质量浓度为 25μg/mL。

凝胶成像系统美国 Alpha公司； GenePulser TM电脉冲转化仪美国 Bio-Rad公司； HQL300B恒温大幅振荡摇床武汉中科科仪技术发展有限责任公司；高压灭菌锅日本三洋公司；电子分析天平（万分之一）德国 Sartorius Analytic公司。

α -淀粉酶分泌表达载体构建参考本课题组先前报道的方法 [19]，构建步骤如图 1所示。根据B. licheniformis WX-02基因组序列中的amyL基因序列（ MUY_00877），设计一对引物 PamyLF1（ 5’ -GAGAGGAATGTACA CATGAAATGAAACAACAAAAACGGCTT-3’ ）和PamyTR（ 5’ -GAAGATCTCGCAATAATGCCGTCGCAC TG-3’），以B. licheniformis WX-02的总 DNA为模板，聚合酶链式反应（ polymerase chain rea ction， PCR）扩增得到α -淀粉酶基因的编码区（包括信号肽）片段和终止子片段amyL +TamyL，长度约 2 040 bp。根据B. subtilis 168基因组上 P43启动子的序列设计一对引物 P43F（ 5’ -GG AATTCTGATAGGTGGTATGTTTTCG-3’）和 P43R1（ 5’ -AAGCCGTTTTTGTTGTTTCATTTCATGTGTACA TTCCTCTC-3’）， PCR扩增得到启动子 P43片段，长度约 305 bp，将这两个片段经 DNA纯化试剂盒纯化回收后作为模板，用重叠延伸 PCR法（ splicing overlap extension PCR， SOE-PCR）连接在一起，得到片段 SAT，总长度约 2 345 bp，纯化回收后，用Eco RⅠ和BglⅡ双酶切，纯化回收片段 SAT。然后将 pHY300PLK空质粒用同样的酶双酶切，纯化回收后与前面得到的片段连接。连接产物转化E. coli DH5α，转化子经菌落 PCR验证、质粒抽提和双酶切验证，获得的重组α -淀粉酶分泌表达质粒命名为 pP43SAT，长度约 4 870 bp。

图 1 1 α-淀粉酶表达载体pP43SAT的构建过程
Fig.1 Construction process of α-amylase expression vector (pP43SAT)

重组表达菌株参考本课题组先前报道的方法构建 [18]。分别接种B. licheniformis BL9和 BL10于 LB培养基， 37℃、 180 r/min过夜培养，转接至电转化生长培养基中， 250 r/min、 37℃培养至 OD 600 nm为 0.8～ 0.9，冰浴 10 min， 5 500 r/min离心 6 m in，收集菌体，用电转化洗涤培养基洗涤菌体 3次，重悬于洗涤培养基中，即为感受态细胞。取感受态细胞加入 5μL pP43SAT质粒 DNA（ 50 ng/μL），转至预冷的电转化杯（ 0.2 cm）中，冰浴 1～ 1.5 min，用电脉冲转化仪 2.5 kV电击 1次，迅速加 900μL电转化恢复培养基， 37℃水浴 1 h， 100 r/min恢复培养 2 h，涂含有 20μg /mL的四环素抗性平板， 37℃培养 20 h，挑取转化子，经菌落 PCR验证、质粒抽提验证，获得阳性转化子，通过该方法构建重组表达菌株B. licheniformis BL9（ pP43SAT）和 BL10（ pP43SAT），并构建含有空质粒 pHY300PLK的对照表达菌株。

将B. licheniformis BL9（ pP43SAT）， BL10（ pP43SAT）和对照菌株接种于 5 mL的含四环素（ 20μg /mL）的 LB培养基中， 37℃、 180 r/min培养过夜。再以 4%的接种量转接到 50 mL新鲜的 LB培养基中，直到 OD 600 nm为 1.0时，以 1%的接种量接种到 50 mL新鲜的淀粉酶发酵培养基中， 37℃、 180 r/min振荡培养。每隔 4 h取样一次，测定其 OD 600 nm和淀粉酶活力，取发酵终点的发酵液用于十二烷基硫酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳（ sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）分析，鉴定淀粉酶的表达。

取 0.9 mL发酵上清液，加入 0.1 mL 100 g/100 mL的三氯乙酸（ trichloroacetic acid， TCA）溶液，颠倒 10次混匀， 4℃过夜放置， 13 000 r/min离心 10 min，弃上清，加入 0.2 mL无水乙醇洗涤， 13 000 r/min离心 10 min，弃上清，依此重复洗涤 3次， 37℃吹干，加入 30μL包含 8 mol/L尿素和 2 mol/L硫脲的溶液溶解蛋白样品，再加入 30μL 2× SDS-PAGE上样缓冲液和 3μL 1 mol/L二硫苏糖醇（DL -dithiothreitol， DTT）， 100℃水浴 10 min溶解沉淀。 SDS-PAGE凝胶参考《分子克隆实验指南》进行配制 [20]。将溶解好的蛋白离心后取 20μL上样，用 80 V的电压电泳，当溴酚蓝指示剂从浓缩胶进入分离胶后，电压调到 120 V，继续电泳直到溴酚蓝指示剂抵达分离胶底部，断开电源停止电泳。电泳结束后，于考马斯亮蓝 R250染色液中处理 1～ 2 h，最后于脱色液中处理数次直至条带清晰。

发酵液经 1 000 r/min离心 10 min，取上清液，稀释即为待测样品。吸取 20.0 mL 2 g/mL可溶性淀粉溶液于 50 mL离心管中，加入 5 mL磷酸盐缓冲液（ pH 6.0）摇匀后置于 60℃恒温水浴锅中预热 8 min。加入 1 mL待测样品，摇匀，反应 10 min。吸取 1.00 mL反应液至预先盛有 0.5 mL 0.1 mol/L盐酸溶液和 5 mL稀碘液的离心管中，摇匀，并以 0.5 mL盐酸溶液和 5 mL稀碘液为空白，在 660 nm波长处迅速测定其吸光度（A）。淀粉酶活力单位为 U/mL， 1 U定义为：在 60℃、 pH 6.0的条件下 1 min水解 1 mg淀粉所需的酶量 [21]。

2 结果与分析

以设计在 pHY300PLK载体上 PHY-F/PHY-R为引物，通过菌落 PCR初步挑选阳性克隆子。挑取候选阳性克隆子过夜培养，抽质粒，酶切验证结果如图 2所示， pP43SAT质粒经过BglⅡ和Eco RⅠ双酶切后，得到片段大小约为 4 870 bp和 2 345 bp的两个片段，分别与空质粒 pHY300PLK和片段 SAT大小相等，说明 pP43SAT质粒构建成功。

图2 表达质粒pP43SAT的酶切鉴定
Fig.2 Identification of expression vector pP43SAT by restriction enzyme digestion

图3 不同基因工程菌胞外蛋白的SDS-PAGE图谱分析结果
Fig.3 SDS-PAGE analysis of extracellular proteins from different genetically engineered strains

将构建好的α -淀粉酶表达载体 pP43SAT分别转入 BL9和 BL10，得到工程菌株 BL9（ pP43SAT）和 BL10（ pP43SAT），并在 BL10中转入空质粒 pHY300P LK得到对照菌 BL10（ pHY300PLK），抽质粒进行验证，经过液体发酵，取发酵 24 h时的发酵液样品，在相同条件下进行 SDS-PAGE分析，结果如图 3所示。与空白对照相比， BL9（ pP43SAT）和 BL10（ pP43SAT）菌株发酵液中含有强烈的α -淀粉酶条带，大小约 58 kD，与先前报道的B. licheniformis α -淀粉酶的分子质量相一致 [22]，说明α -淀粉酶在 BL9和 BL10中实现了分泌表达。从α -淀粉酶条带强度可以看出， BL10宿主菌具有更高的α -淀粉酶表达量。 BL10是在 BL9的基础上敲除了bprA基因，说明宿主菌缺失蛋白酶 BprA可进一步提高α -淀粉酶的表达。

图4 不同宿主菌对α-淀粉酶发酵过程的影响
Fig.4 Effects of different host strains on the fermentation process of α-amylase

为了对比 BL9、 BL10和野生菌 WX-02的α -淀粉酶表达效果，并排除B. licheniformis自身α -淀粉酶对蛋白表达的影响，将 pP43SAT表达载体转入缺失α -淀粉酶基因的 WX-02（ ΔamyL）宿主菌中，构建了B. licheniformis WX-02（ ΔamyL， pP43SAT）。 WX-02（ ΔamyL， pP43SAT）、 BL9（ pP43SAT）和 BL10（ pP43SAT）的淀粉酶发酵过程如图 4所示。与 WX-02（ ΔamyL， pP43SAT）相比， BL9（ pP43SAT）和 BL10（ pP43SAT）菌体生长相对缓慢，最终生物量微弱下降（图 4A），这可能是由于 BL9和 BL10菌株分别缺失 9个和 10个基因，对菌体的生长具有微弱的损伤作用，这与本课题先前发现的现象相似 [18]。

微弱降低的菌体量并没有降低淀粉酶的表达量，如图 4B所示， BL9（ pP43SAT）和 BL10（ pP43SAT）淀粉酶发酵活力分别达到 94.01 U/mL和 101.94 U/mL，比 WX-02（ ΔamyL， pP43SAT）的发酵活力（ 77.88 U/mL）提高了 21%和 31%，这说明 BL9和 BL10新型宿主菌有利于α -淀粉酶的表达，这与先前报道的纳豆激酶变化趋势相符合 [18]。B. licheniformis宿主菌缺失蛋白酶基因后，可降低自身蛋白酶对目标蛋白的降解作用，这可能是淀粉酶表达活性增加的原因。同时， BL10（ pP43SAT）的α -淀粉酶表达活性相对于 BL9（ pP43SAT）提高了 8%，这与 SDS-PAGE的蛋白质浓度变化趋势相一致，进一步说明 BprA蛋白酶的缺失有利于α -淀粉酶的表达。

3 结论

本研究构建了α -淀粉酶表达载体 pP43SAT，实现了α -淀粉酶在地衣芽孢杆菌宿主菌 WX-02（ ΔamyL）、 BL9和 BL10中的成功表达。与宿主菌 WX-02（ ΔamyL）相比， BL9和 BL10可显著提高α -淀粉酶的表达，分别提高了21%和 31%。目前，以枯草芽孢杆菌蛋白酶缺失株为宿主表达外源蛋白的研究较多，如 6蛋白酶缺失株B. subtilis WB600可高效表达纳豆激酶 [23]和枯草蛋白酶 [24]， 8蛋白酶缺失株B. subtilis WB800可高效表达木聚糖酶 [25]和磷脂酶 C [26]，而多蛋白酶缺失的地衣芽孢杆菌宿主菌报道较少，本课题组前期证明 BL10有利于纳豆激酶的表达，本研究证明胞外蛋白酶基因缺失可显著提高α -淀粉酶的表达，进一步证实多蛋白酶缺失宿主菌的应用价值。更重要的是，本研究为α -淀粉酶的增强表达提供了新的思路，提供了一种高效表达α -淀粉酶的地衣芽孢杆菌工程菌 BL10（ pP43SAT），相信经过进一步的发酵工艺优化和中试放大研究，该菌株有望应用于α -淀粉酶的工业化生产。

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Comparative Analysis on the Effects of Different Host Strains of Bacillus licheniformis on the Expression and Secretion of α-Amylase

CHEN Jingbang 1 , ZHOU Yinhua 1 , ZHAO Xinyu 1,2 , CHEN Shouwen 1 , WEI Xuetuan 1,2,*
(1. State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

Abstract： In the present study, effects of different host strains of Bacillus licheniformis on the expression and secretion of α -amylase were investigated. Firstly, the α -amylase expression vector, named pP43SAT, was constructed based on the promoter P43 from Bacillus subtilis and the signal peptide, coding region and terminator of α -amylase gene from B. licheniformis WX-02. The pP43SAT plasmids were then transformed into the B. licheniformis host strains WX-02 (Δ amyL ), BL9 and BL10B, respectively, to obtain the α -a mylase genetic engineering strainsWX-02 ( Δ amyL ;pP43SAT), BL9 (pP43SAT) and BL10 (pP43SAT) , respectively. The α -amylase fermentation processes of these engineered strains were compared.The α -amylase activities ofstrains BL9 (pP43SAT) and BL10 (pP43SAT) reached 94.01 and 101.94 U/mL, respectively, which were increased by 21% and 31%, respectively, as compared with that of WX-02 ( Δ amyL ;pP43SAT). These results showed that the novel host strains BL9 and BL10 contributed to the secretion and expression of α -amylase. It was proved that the deletion of multiple proteases genes could enhance α -amylase expression obviously, and this st udy provided the novel host strains and novel strategies for efficient expression of α -amylase.

Key words： α -amylase; Bacillus licheniformis; host strain; secretion and expression

基金项目：湖北省自然科学基金项目（2014CFB943）；华中农业大学自主科技创新基金项目（2662015QC035）

作者简介：陈敬帮（1990—），男，硕士研究生，研究方向为食品酶学。E-mail：1176154594@qq.com

*通信作者：魏雪团（1984—），男，讲师，博士，研究方向为食品微生物学。E-mail：weixuetuan@mail.hzau.edu.cn

α-淀粉酶在不同地衣芽孢杆菌宿主菌中分泌表达的对比分析

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

3 结论