丙烯酰胺对睾丸间质细胞R2C活性及孕酮合成功能的影响

李名薇 1,孙建霞 2,许 伟 1,邹飞雁 1,*,白 顺 1,朱翠娟 1,胡云峰 1,焦 睿 1,吴 实 1,欧仕益 1,冯梦鸽 1,白卫滨 1,*

1.暨南大学理工学院食品科学与工程系,生命科学技术学院,第一附属医院,广东 广州 5106322.广东工业大学轻工化工学院,广东 广州 510006

摘 要:目的:研究丙烯酰胺( acrylamideAA)对体外培养的睾丸间质细胞 R2C生长及孕酮合成功能的影响。方法:用浓度为 0.250.50.751246 mmol/LAA作用于 R2C细胞 24 h,四甲基偶氮唑蓝( methyl thiazolyl tetrazoliumMTT)法获得 IC 25 、IC 50 及IC 75 的AA作用浓度。用以上 3种浓度的 AA处理 R2C细胞 24 h,观察细胞形态。 AA作用于 R2C细胞 4 h后,通过彗星实验( Comet assay)检测细胞 DNA的损伤程度;放射免疫法( radioimmunoassayRIA)测定 AA处理 R2C细胞 4 h24 h后的孕酮合成量。结果: AA能抑制 R2C细胞活性,其 IC 25IC 50IC 75分别为 1.1401.9253.250 mmol/L3种浓度的 AA能不同程度地影响 R2C细胞生长形态;作用 4 hR2C细胞 DNA有损伤作用;各浓度组作用 24 h后均能降低 R2C细胞的孕酮合成量。结论: AA能影响 R2C细胞增殖及孕酮合成能力。

关键词:丙烯酰胺; R2C细胞;细胞活性; DNA损伤;孕酮

丙烯酰胺( acrylamideAA)是一种广泛存在于常见食品及工业生产中的化学物质 [1-3],它被认为是一种对人类有潜在致癌作用的物质 [4]20024月,瑞典国家食品管理局宣布在富含碳水化合物,如薯片、咖啡、烤面包等的热处理过程中会产生大量的丙烯酰胺 [5-6],这一发现引起了广泛关注。据报道,丙烯酰胺具有基因毒性、神经毒性及生殖毒性等,对人类具有致癌的危害性 [7-8]Yang[9]通过大鼠实验发现,较低剂量的 AA即可抑制睾丸内精子的生成,影响大鼠的生殖功能,然而 其造成雄性生殖毒性的具体机制还不确定。本研究通过探索丙烯酰胺对体外大鼠睾丸间质细胞 R2C的毒性损伤情况,探讨其引起生殖毒性的机制,为丙烯酰胺的安全性评估提供一定依据。

1 材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

R2C细胞,由暨南大学生物医药中心实验室提供。

AACAS登录号: 79-06-01,纯度 98%) 德州市富凯化工有限责任公司; F12培养液、马血清 美国Life公司;胎牛血清、胰酶 美国 Gibco公司;二甲基亚砜( dimethy l sulfoxideDMSO)、四甲基偶氮唑蓝( methyl thiazolyl tetrazoliumMTT) 美国 Amresco公司;低熔点琼脂糖、正常熔点琼脂糖 美国 FMC公司; Tris、乙二胺四乙酸二钠( ethylene diamine tetraacetic acid disodium saltEDTA-Na 2)、聚乙二醇辛基苯基醚( Triton X-100) 美国 Genview公司;孕酮放射免疫试剂盒 北方生物技术研究所。

37℃细胞培养箱、酶标仪 美国 Thermo公司;低温离心机 金坛市富华仪器公司; GC-1200γ 放射免疫计数仪科大创新股份中佳公司。

1.2方法

1.2.1 MTT法检测 AAR2C细胞活性的影响

将生长对数期的 R2C细胞接种于 96孔板,每孔 200μL悬液, 4× 10 3个细胞。 24 h后,加入无血清 F12培养液稀释的浓度为 0.250.50.751246 mmol/LAA,每组 3个复孔,并设置无细胞的空白组(只加 200μL F12培养液)和对照组(加 200μL细胞悬液,不加 AA),重复 3次。作用 24 h后,每孔加 10μL 5 mg/mLMTT试剂,放于 37 ℃培养箱。4 h后,去除液体,加 200μL DMSO,置于脱色摇床摇动 10 min,于酶标仪 570 nm波长处检测吸光度,按照下式计算 AAR2C细胞活性的抑制率。

式中:A 0、A 1、A 2分别为空白组、 AA给药组、对照组的吸光度。

将得到的数据通过 Graphpad软件分析 AA作用的 IC 25IC 50IC 75

1.2.2倒置显微镜观察 AAR2C形态的影响

R2C细胞以 1× 10 6/mL的浓度接种于 6孔板,加入 IC 25IC 50IC 75浓度的 AA作用 24 h后,用倒置显微镜观察细胞并拍照。

1.2.3彗星实验( Comet assay)检测 AAR2C细胞 DNA的损伤

R2C细胞生长至对数期后,将细胞以 1× 10 5/mL的浓度接种于 6孔板。培养 24 h,分别加入 IC 25IC 50IC 75浓度的 AA作用于细胞。 4 h后将对照组及经过 3种浓度 AA处理的 R2C细胞消化、离心后,磷酸盐缓冲液( phosphate buffered salinePBS)清洗 1遍。

将细胞重悬于 0.8%的低熔点琼脂糖( low melting agaroseLMP)中,取 100μL到已预涂了一层正常熔点琼脂糖的载玻片上,然后在最上层再加一层 LMP。待琼脂糖凝固后,将载玻片置于裂解液( 0.1 mol/L EDTA- Na 22.5 mol/L NaCl10 mmol/L Tris、体积分数 1%的 Triton X-100、体积分数 10%的 DMSO,临用前配制, pH 10.0)中, 5℃处理 1 h。将载玻片放在碱性电泳缓冲液( 0.3 mol/L NaOH1 mmol/L EDTA-Na 2pH 13.6)中处理 20 min。碱性条件下( pH 13.6)进行电泳( 25 V20 min)。电泳结 束后,用 pH 7.5Tris-HCl溶液将载玻片洗 3次,每次 5 min。用 20μL 25μg /mL的溴化乙锭( ethidium bromideEB)对 DNA染色,盖上盖玻片。荧光显微镜拍照, CASP软件分析电泳检测结果。

1.2.4放射免疫法( radioimmunoassavRIA)检测 AAR2C细胞孕酮合成量的影响

将对数生长期的 R2C细胞调整浓度为 10 6/mL,接种到 6孔板,每孔 1 mL24 h后加入 AA浓度为 IC 25IC 50IC 75的培养液。 4 h24 h后收集上清液,并保存于- 20 ℃。按孕酮放射免疫试剂盒说明书方法进行孕酮合成量的测定。

1.3统计学分析

实验数据以 表示,运用 Graphpad Prism5软件对结果进行统计分析,P< 0.05、P< 0.01表示结果有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 AAR2C细胞生长的抑制作用

由图 1可知, AAR2C细胞活性的抑制率随其浓度的增加而升高。通过 Graghpad软件分析得到 AAR2C细胞的 IC 25IC 50IC 75分别为 1.1401.9253.250 mmol/L

图1 不同浓度AA对R2C细胞的生长抑制率
Fig.1 Inhibitory ratios of AA on the growth of R2C cells

图2 不同浓度AA作用24 h后的R2C细胞形态(×400)
Fig.2 Morphological changes of R2C cells after being exposed to
various concentrations of AA for 24 h (× 400)

由图 2可知,浓度分别为 1.1401.9253.250 mmol/LIC 25IC 50IC 75)的 AA作用 24 h后, R2C细胞变小,形状由不规则多边形变为椭圆形,细胞数目减少且贴壁能力降低,且 AAR2C细胞生长的抑制作用呈现剂量依赖性。

2.2 AAR2C细胞 DNA损伤的作用

图3 不同浓度AA刺激4 h后R2C细胞的尾部DNA含量
Fig.3 Tail DNA content in R2C cells after being exposed to AA for 4 h

由图 35可知,与对照组相比,不同浓度的 AA作用于 R2C细胞 4 h后,细胞拖尾现象显著增加。 R2C细胞的尾部 DNA含量、尾长及 Olive尾距( Olive tail momentOTM)均随 AA浓度增加而增大,尤其当 AA浓度为 1.9253.250 mmol/LIC 50IC 75)时,其尾部 DNA含量、尾长和 OTM分别增加了 1 166.6%、 1 776.7%, 106.4%、 295.7%和 329.3%、 476.9%,结果较对照组具有统计学意义(P< 0.05或P< 0.01),表明 AA可以诱导 R2C细胞产生 DNA损伤。

图4 不同浓度AA刺激4 h后R2C细胞的尾长
Fig.4 Tail length of R2C cells after being exposed to AA for 4 h

图5 不同浓度AA刺激4 h后R2C细胞的Olive尾距
Fig.5 Olive tail moment of R2C cells after being exposed to AA for 4 h

2.3 AAR2C细胞孕酮合成量的影响

图6 不同浓度AA作用4 h后对R2C细胞孕酮合成量的影响
Fig.6 Effect of AA exposure for 4 h on progesterone biosynthesis of R2C cells

图7 不同浓度AA作用24 h后对R2C细胞孕酮合成量的影响
Fig.7 Effect of AA exposure for 24 h on progesterone biosynthesis of R2C cells

孕酮合成量检测结果表明, AA作用 R2C细胞 4 h后,各 AA浓度组细胞的孕酮合成量与对照组相比无明显差异(图 6)。 AA继续作用 R2C细胞 24 h后,各 AA浓度组细胞的孕酮合成量显著降低,与对照组相比分别降低了 19.5%、 28.6%及 34.2%(图 7),且均具有统计学意义(P< 0.05或P< 0.01),且随着 AA作用浓度增加,抑制效果更加明显。

3 讨 论

研究报道丙烯酰胺具有遗传毒性、神经毒性和生殖毒性 [10]。多项研究结果表明, AA能够对动物生殖器官产生毒性作用 [11-12],并证明 AA是通过干扰类固醇激素的合成来影响动物的生殖功能 [13]Chen[14]研究表明, AA能够损伤大鼠睾丸,引起生殖功能的下降,但未通过体外细胞实验对其进行研究。从大鼠体内分离睾丸间质原代细胞程序复杂,并且不能传代培养,限制了其作为评估模型的应用 [15],而 R2C细胞是一个能在无激素刺激条件下持续大量分泌孕酮的睾丸间质细胞株,且具有无限传代的能力,可作为一种快速评价雄性生殖毒性的细胞模型 [16-17]。故本研究以睾丸间质细胞 R2C为体外实验对象,通过检测细胞的生物活性及功能等来探讨 AA的毒性作用。

目前对 AA体外生殖毒理的研究还比较少,因此本实验 AA刺激剂量的选择主要是参考 Mehri[18]研究 AA体外神经毒性的数据,进而确定 AA刺激剂量范围以探讨其生殖毒性作用。实验结果显示, AA能够抑制 R2C细胞的活性、影响细胞的正常生长状态,且上述抑制效果与 AA的作用剂量成正相关。因此, AA可能通过抑制生殖细胞的活性来干扰生殖系统的功能。单细胞电泳结果表明, AA可以诱导 R2C细胞发生明显的 DNA损伤。有研究表明, DNA损伤能够引发细胞凋亡,降低细胞活力甚至导致细胞死亡 [19-20]。由此推测, AAR2C细胞生长的抑制作用可能与其诱导细胞 DNA损伤有关。类固醇激素对于维持动物生殖功能起着重要的作用 [21],睾丸间质细胞最主要的功能是分泌睾酮 [22],而孕酮是睾酮合成的前体物,是其合成通路中最重要的中间产物,睾丸间质细胞模型 R2C细胞株由于 17β -羟化酶功能损坏、 17β -羟类固醇脱氢酶缺失导致其仅能分泌孕酮,通过检测孕酮水平可间接反映睾酮的分泌量 [23-24],所以将睾酮合成的前体物质——孕酮作为评价生殖功能的指标。有研究显示 [25],体外培养睾丸间质细胞,在 4 h时睾酮分泌量达到最大,考虑时间依赖的影响,本实验选取 4 h24 h两个时间点进行研究。结果发现, AA作用于 R2C细胞 4 h后对孕酮合成量无明显影响,作用 24 h后与对照组相比, 3种浓度的 AA均能引起 R2C细胞孕酮合成量显著降低,且 AA浓度越大,降低程度越明显。该结果说明, AA能造成 R2C细胞孕酮合成功能下降,进而能够影响睾酮的合成,且抑制呈时间 -剂量依赖性。

根据上述结果可以推测, AA可能是通过损伤睾丸间质细胞 DNA,造成相关蛋白合成受阻,从而影响细胞孕酮合成功能的下降或细胞活性下降,而细胞活性的下降可能也会影响细胞正常功能的发挥,最终导致生殖系统功能下降。下一步拟通过对孕酮合成途径中某些关键蛋白及其 mRNA表达水平的研究来探讨 AA毒性作用的具体机制,为阐明 AA影响睾丸间质细胞功能的机理研究提供依据。

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Effect of Acrylamide on the Viability and Progesterone Biosynthesis Function of Rat R2C Leydig Cells

LI Mingwei 1 , SUN Jianxia 2 , XU Wei 1 , ZOU Feiyan 1,* , BAI Shun 1 , ZHU Cuijuan 1 , HU Yunfeng 1 , JIAO Rui 1 ,
WU Shi 1 , OU Shiyi 1 , FENG Mengge 1 , BAI Weibin 1,*
(1. The First Affiliated Hospital, College of Life Science and Technology, Department of Food Science and Engineering, College of Science and Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China; 2. Faculty of Chemical Engineering and Light Industry, Guangdong University of Technology, Guangzhou 510006, China)

Abstract: Objective∶ To examine the effect of acrylamide (AA) on cell growth and progesterone synthesis in rat R2C cells. Methods∶ R2C cells were treated with AA at concentrations of 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 4 and 6 mmol/L, respectively. Three inhibitory concentrations (IC 25 , IC 50 and IC 75 ) were determined by MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay. Cell morphology was observed after being sti mulated by the three inhibitory concentrations of AA for 24 h. DNA damage in R2C cells was measured by comet assay. The amounts of progesterone biosynthesis after being exposured to AA for 4 h and 24 h were detected by radioimmunoassay (RIA). Results∶ AA could inhibit the cell viability. The IC 25 , IC 50 and IC 75 were determined to be 1.140, 1.925 and 3.250 mmol/L, respectively. At these three concentrations, AA could affect cell morphology to different extends. DNA was significantly damaged at three concentrations of AA for 4 h, whereas the progesterone levels were significantly reduced after being exposed to AA for 24 h. Conclusion∶ AA can inhibit the cell growth and reduce the progesterone synthesis of R2C cells.

Key words: acrylamide; R2C cell; cell activity; DNA damage; progesterone

中图分类号: Q26

文献标志码: A 文章编号:1002-6630(2015)17-0247-05

文章编号:1002-6630(2015)17-0247-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201517046

收稿日期:2015-04-16

基金项目:广东省高等学校优秀青年教师培养计划项目(Yq2013024);教育部“新世纪优秀人才支持计划”项目;

国家自然科学基金青年科学基金项目(31201402;31201340)

作者简介:李名薇(1989—),女,硕士研究生,研究方向为生殖毒性评价。E-mail:limingwei_2008@163.com

*通信作者:邹飞雁(1963—),女,副教授,博士,研究方向为生殖与发育。E-mail:zoufeiyan6364@yahoo.com.cn

白卫滨(1978—),男,副研究员,博士,研究方向为食品营养与毒理安全性评价。E-mail:baiweibin@163.com