表1 5 级气味强度表示法
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Table1 Descriptions of odor intensities
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强度级别嗅觉感觉0无任何气味1稍微感觉到极弱的气味2能感觉和分辨出何种气味3能明显感觉到气味4能感觉到强烈的气味
杨 君 1，郜海燕 2，储国海 1，李泽桦 3，牛云蔚 4，蔡 铭 3，胡安福 1，蒋 健 1,*
（1.浙江中烟工业有限责任公司，浙江 杭州 310009；2.浙江省农业科学院食品科学研究所，浙江 杭州 310021；3.浙江工业大学海洋学院，浙江 杭州 310014；4.上海应用技术学院香料香精技术与工程学院，上海 201418）
摘 要：研究佛手精油的挥发性物质和关键香气成分。佛手经水蒸气蒸馏法提取精油，利用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）结合气相色谱-嗅闻（gas chromatography-olfactometry，GC-O）技术对挥发性物质和香气成分进行分析。GC-MS-O检测出36 种挥发性物质，主要成分为D-柠檬烯（34.69%）、γ-松油烯（20.42%）、β-甜没药烯（4.59%）。采用稀释法和强度法分析发现D-α-蒎烯、D-柠檬烯、β-芳樟醇、别罗勒烯、4-松油醇、α-佛手柑烯具有较大的香气强度；D-α-蒎烯、β-蒎烯、β-罗勒烯、橙花乙酸酯、α-佛手柑烯具有较大风味稀释因子。综合分析认为D-α-蒎烯和α-佛手柑烯是佛手精油的关键特征香味成分。
关键词：佛手精油；香气成分；气相色谱-质谱联用仪；气相色谱-嗅闻技术
佛手（Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle）是芸香科柑橘属植物香橼的变种，为常绿小乔木，由于果实顶部张开呈指状，因此得名 [1]。佛手精油含量较高，主要存在于佛手果实的外果皮、中果皮中，色泽透明或淡黄色，具有清新怡人的特征香味，常作为高档香料而广泛应用于食品、化妆品领域 [2]。佛手精油具有较多生理活性功能，如治疗胃痛、胁涨、呕吐、痰饮咳嗽、解酒等 [3]。佛手精油主要物质是柠檬烯，此外还含有一定量γ-松油烯、β-蒎烯、β-月桂烯等物质 [4-5]。研究 [6-8]表明，柠檬烯对大肠杆菌O157∶H7和肠炎沙门氏菌具有很强抑制作用，γ-松油烯对沙门氏菌具有较好抑菌活性。Peng等 [4]发现佛手精油能促进胰岛素分泌，可用于治疗Ⅱ型糖尿病。Somrudee等 [9]报道佛手精油具有抗焦虑效果。实验证明，佛手挥发油对支气管哮喘动物具有止咳、平喘、祛痰等治疗作用 [10]。此外，佛手精油还可改善情绪、应激障碍等轻度症状 [11]。目前，对佛手精油挥发性成分的研究已取得了众多进展，但对其关键香气成分的研究还尚属空白。
气相色谱-嗅闻（gas chromatography-olfactometry，GC-O）法是目前香气成分分析的重要手段之一。GC-O是一种直观的感官检测方法，即通过人的鼻子直接嗅闻复杂的混合气味从而筛选出具有气味的化合物，并对气味特征进行评价。GC-O可以发现食品中大量挥发性成分中真正具有气味活性的成分和各气味成分在不同浓度条件下对整体气味的贡献，在鉴别特征香味化合物、香味活性化合物等方面具有明显的优势，广泛应用于食品、环境监测等领域 [12-16]。常用的GC-O检测方法有稀释法、强度法、检测频率法等 [17]。稀释法是将被分析物稀释一定倍数，嗅辨师鉴定在哪个稀释度条件下仍然能闻到，并描述该气味。风味稀释因子（flavor dilution factor，FD）是气味化合物能被感知的最大稀释度，FD值高的物质即被认为是重要的致香物质。强度法是根据实际嗅闻到的气味强度评价各化合物对整体香气贡献程度，化合物气味强度越大，其对香气整体贡献就越大。
本实验采用气相色谱-质谱（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）技术鉴定佛手精油中挥发性物质，利用GC-O稀释法和强度法评价各香气成分对整体香味的贡献，对佛手精油在食品药品、香精香料领域中的应用具有一定的指导意义。
1.1 材料与试剂
金华佛手柑（2014年） 浙江金手宝生物科技有限公司；无水乙醇为色谱纯，乙醚、无水硫酸钠均为分析纯。
1.2 仪器与设备
TRACE1300GC仪配有ISQ LT MS仪 美国Thermo Fisher Scientific公司；Sniffer 9000嗅味检测仪 瑞士Brechbühler公司。
1.3 方法
1.3.1 佛手精油的分离提取
取金华佛手柑果实切成1 cm×1 cm×1 mm片状。按料液比1∶10（g/mL）加入蒸馏水，加热至微沸，自沸腾起计时保持3 h，收集精油，加入一定量的Na 2SO 4至精油中，静置过夜，过滤，用乙醚洗涤Na 2SO 4，并将洗涤液与滤液合并，用0.45 μm有机膜过滤精油，挥发除尽乙醚，得佛手脱水精油。
1.3.2 GC-MS分析条件
GC条件：DB-5 MS色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；分流比10∶1；进样量1.0 μL；进样温度250 ℃；载气为高纯氦气，纯度大于99.999%；流量1.0 mL/min；程序升温：50 ℃保持1 min，5 ℃/min升到130 ℃，保持0.5 min，15 ℃/min升到250 ℃，保持10 min。
MS条件：电子电离源；电子能量70 eV；离子源温度280 ℃；质量扫描范围50～500 u；用Mainlab谱库检索加以确认。各物质相对含量采用峰面积归一化法确定。
1.3.3 GC-O分析条件
GC-O系统由GC（配氢火焰离子检测器（flame ionization detector，FID））和Sniffer嗅辨仪组成。
GC条件：DB-5 MS色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；分流比10∶1；进样量1.0 μL；进样温度250 ℃；FID检测器温度为280 ℃；载气为高纯氦气，纯度大于99.999%，流量1.0 mL/min。程序升温条件同GC-MS。气相毛细管柱末端以分流比为1∶1分别连接FID检测器和Sniffer嗅辨仪。GC柱箱与嗅辨仪传输线温度220 ℃，在嗅觉端口处对气体进行加湿，防止因气体干燥引起嗅辨师不适。
嗅辨师经专业训练，熟悉各种香味并掌握一定量术语描述香味与香气特征。为避免嗅觉疲劳，每次嗅闻时间不超过40 min，且2 次嗅闻之间至少间隔30 min。实验采用稀释法和强度法，即嗅辨师在实验过程中需描述闻到的气味和强度。样品逐级稀释（分别稀释50、100、200、400 倍等），直到嗅辨师闻不到气味为止。每种香味化合物最高稀释倍数即为FD值，气味强度级别表示见表1。
表1 5 级气味强度表示法
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Table1 Descriptions of odor intensities
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强度级别嗅觉感觉0无任何气味1稍微感觉到极弱的气味2能感觉和分辨出何种气味3能明显感觉到气味4能感觉到强烈的气味
样品经GC-MS分析，结果如表2所示，总离子流图如图1所示。共发现33 种物质，其中烯烃类物质16 种，相对峰面积占83.53%；醇类物质6 种，相对峰面积占7.40%；酸类物质3 种，相对峰面积占7.48%；酯类物质3 种，相对峰面积占0.85%；酚类物质2 种，相对峰面积占0.23%；醛类物质2 种，相对峰面积占0.18%和烷烃物质1 种，相对峰面积占0.31%。相对含量超过1%的物质有D-柠檬烯（34.69%）、γ-松油烯（20.42%）、β-甜没药烯（4.59%）、月桂酸（2.98%）、α-松油醇（2.63%）、石竹烯（2.53%）、肉豆蔻酸（1.98%）、4-萜品醇（1.91%）、2-蒈烯（1.73%）、棕榈酸（1.53%）、β-蒎烯（1.48%）、β-罗勒烯（1.26%）、大牻牛儿烯（1.23%）、D-α-蒎烯（1.20%）。结果与其他学者研究基本相符。陈丽君等 [19]从橙油中检测到35 种挥发性物质，其中相对含量较高的化合物为柠檬烯（80.79%）、芳樟醇（3.85%）、癸醛（2.90%）、β-月桂烯（1.94%）、β-蒎烯（0.82%）等。金宏等 [20]报道佛手挥发油中95%以上物质是柠檬烯、1-甲基-（1-甲乙基）-苯、β-蒎烯和α-蒎烯。赵磊等 [21]定性定量分析了12 种金华佛手的挥发油，鉴定出27 种化学成分，主要成分均是柠檬烯和γ-松油烯。柠檬烯通常是柑橘类精油中含量最高的物质，相对含量可达60%～90%，相对含量与种植环境、成熟程度有关 [22-25]。柠檬烯可作为用于掩盖某些生物碱苦味的风味改良剂或作为合成香芹酮的前体物质。通过GC-O分析，共发现26 种物质，其中有3 种风味物质（保留时间在3.35、3.90、27.70 min）并未在MS分析中检测出，可能是相对含量低于MS的检测限而没有被检测到。
表2 佛手精油GC-MS和GC-O分析结果
Table2 Analytical results of fi nger citron essential oil by GC-MS-O
编号保留时间/min相对含量/%FD值强度值化合物描述13.35501果香，木质感23.90502清甜香3*7.171.204004D-α-蒎烯清甜果香，有焦味，清滋味，刺感48.291.484002β-蒎烯清香，果甜，松针味58.610.960β-月桂烯69.360.591002α-松油烯柑橘香79.9034.691003D-柠檬烯花香，凉味感，柠 檬特征香810.211.264001β-罗勒烯壤香，果甜，清香910.7020.422002γ-松油烯柑橘香，清甜1011.361.7320022-蒈烯柠檬清甜，松针1 111.710.421003β-芳樟醇酱香，清甜1212.410.412003别罗勒烯花甜香，果香，霉味1313.190.2720011-(1,4dimethyl-3-cyclohexen-1-yl)-ethane清甜味1414.001.9120034-萜品醇清甜香/柠檬香，果肉感1514.422.632002α-松油醇焦甜香，松针感1615.260.33502香叶醇果香1715.680.091002β-柠檬醛果甜，果肉感1816.470.070α-柠檬醛1917.200.122001百里香酚清甜花香，柑橘甜味2017.320.080香芹酚2118.740.224002橙花乙酸酯果甜2219.110.291002乙酸牻牛儿酯果甜，清甜23*19.680.164003α-佛手柑烯清甜，柑橘2419.842.530石竹烯2520.350.490蛇麻烯2620.640.280衣兰油烯2720.731.232001大牻牛儿烯果甜，果肉感
续表2
注：*.特征香味。
编号保留时间/min相对含量/%FD值强度值化合物描述2821.044.592002β-甜没药烯果甜，焦甜，清香2921.240.420荜澄茄烯3021.982.982001月桂酸清甜3122.780.23502β-甜没药醇柠檬感3222.930.900α-甜没药醇3323.591.980肉豆蔻酸3424.981.530棕榈酸3525.780.231001亚油酸甲酯清甜3627.702001松针
图1 佛手精油GC-MS总离子流图
Fig.1 GC-MS TIC chromatogram for fi nger citruon essential oil
图2 佛手精油的强度法（A）和稀释法（B）图谱Fig.2 GC-MS-O analysis of fi nger citron essential oil
1. D-α-蒎烯；2. D-柠檬烯；3. β-芳樟醇；4.别罗勒烯；5. 4-萜品醇；6. α-佛手柑烯；7. β-蒎烯；8. β-罗勒烯；9. 橙花乙酸酯。
由图2A可知，香气强度值最大的物质为D-α-蒎烯（强度值为4），其他较大的物质有D-柠檬烯（强度值为3）、β-芳樟醇（强度值为3）、别罗勒烯（强度值为3）、4-萜品醇（强度值为3）、α-佛手柑烯（强度值为3），说明它们是佛手精油香味的重要成分。由图2B可知，在稀释法中，D-α-蒎烯、β-蒎烯、β-罗勒烯、橙花乙酸酯、α-佛手柑烯FD值都达到400，说明它们在浓度极低的情况下仍可提供强烈的香气，被认为对佛手精油香味的影响非常大。物质气味强度和浓度之间存在一定关系，Kamadia等 [26]采用稀释法证实了物质气味强度和浓度之间满足Steven’s Law定律。因此，稀释法可以弥补强度法的缺陷，二者优势互补，更有利于把握佛手精油中的关键致香物质。佛手精油整体嗅香主要表现为清香、甜香、果香为主体的香韵，经过嗅辩师反复闻香鉴定，强度和稀释度均为最大的D-α-蒎烯表现出强烈的清甜果香，与精油的头香果香味很相似，确定为佛手精油的主体香韵，α-佛手柑烯表现为清甜香、柑橘香，也与佛手的香韵非常相似。而其他物质的香气强度或浓度未达到主体香的要求，故确定D-α-蒎烯和α-佛手柑烯是佛手精油的特征香味，即佛手精油的关键致香物质。以上分析也说明，各化合物是否是关键致香物质，不能仅靠单一的方法来进行判断，稀释法和强度法结合可以更有效的鉴别精油的关键致香物质。
对比GC-MS和GC-O分析，D-柠檬烯和γ-松油烯相对含量虽然较高，但FD值较小，说明其对佛手精油的整体香气影响较小，从结果可以看出，对佛手精油香味贡献大的物质相对含量并不一定大，仅从相对含量来比较不同成分对香味的贡献是不准确的，需要结合阈值才能得出更真实的结果。
利用GC-MS和GC-O鉴定出佛手精油中挥发性成分和香气物质36 种。佛手精油主要成分是D-柠檬烯（34.69%）、γ-松油烯（20.42%）、β-甜没药烯（4.59%）等。佛手精油中烯烃相对含量占到大部分，达83.53%，酸类、醇类、酯类、酚类、醛类和烷烃分别占到总相对含量的7.48%、7.40%、0.85%、0.23%、0.18%和0.31%。嗅闻实验中采用强度法和稀释法结合的方法，发现D-α-蒎烯、D-柠檬烯、β-芳樟醇、4-松油醇、α-佛手柑烯具有较大的强度，D-α-蒎烯、β-蒎烯、β-罗勒烯、橙花乙酸酯、α-佛手柑烯具有较大FD值。综合分析后确定D-α-蒎烯和α-佛手柑烯是佛手精油的特征香味。
近年来，食品风味方面的研究越来越受到人们的重视，GC-O作为分析风味物质的有力工具，应用越来越多，尤其是食品和饮料领域。本实验利用GC-MS-O联用方法，快速准确地筛选出香气中关键致香物质，为佛手精油在食品药品、添香领域的应用提供理论参考，并为香精香料进一步研究开发提供新的思路。
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Characterization of Volatile Constitutes and Odorous Compounds in Essential Oil of Finger Citron(Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle) by GC-MS and GC-O
YANG Jun
1, GAO Haiyan
2, CHU Guohai
1, LI Zehua
3, NIU Yunwei
4, CAI Ming
3, HU Anfu
1, JIANG Jian
1,*
(1. China Tobacco Zhejiang Industrial Co. Ltd., Hangzhou 310009, China; 2. Institute of Food Science, Zhejiang Acadmy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China; 3. College of Ocean, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China; 4. Shanghai Institute of Technology, School of Perfume and Aroma Technology, Shanghai 201418, China)
Abstract：The volatile constitutes and odorous compounds in essential oil of finger citron (Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle) were evaluated. The oil was extracted by hydrodistillation and analyzed by gas chromatographymass spectrometry (GC-MS) and gas chromatography-olfactometry (GC-O). A total of 36 compounds in the oil were identifi ed, among which, D-limonene (34.69%), γ-terpinene (20.42%), and β-bisabolene (4.59%) were the main compounds. D-α-pinene, D-limonene, β-linalool, allo-ocimene, terpin-4-ol and α-bergamotene displayed strong aromatic intensity, while D-α-pinene, β-pinene, β-ocimene, neryl acetate and α-bergamotene showed relatively higher fl avor dilution (FD) factor. The results demonstrated that D-α-pinene and α-bergamotene were the key contributors to the characteristic aroma of fi nger citron oil.
Key words：finger citron essential oil; odorous compounds; gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS); gas chromatography-olfactometry (GC-O)
中图分类号：TS255.1
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）20-0194-04
doi：10.7506/spkx1002-6630-201520037
收稿日期：2015-02-15
作者简介：杨君（1972—），男，高级工程师，硕士，研究方向为天然植物提取、感官组学。E-mail：yangjun@zjtobacco.com
*通信作者：蒋健（1978—），男，高级工程师，硕士，研究方向为香精香料化学分析。E-mail：jiangj@zjtobacco.com