猪心肌高铁肌红蛋白分子结构解析

李亚东,吴名草,金邦荃 *

(南京师范大学金陵女子学院,江苏 南京 210097)

摘 要:本研究分别运用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)、紫外光谱、氨基酸分析、质谱和分子信息技术,比较中国山猪心肌高铁肌红蛋白(pig metmyoglobin,pMetMb)分子信息和三维结构。结果表明:pMetMb肽链至少含有133 种氨基酸组分,但较hMb缺少脯氨酸(Pro)和精氨酸(Arg);与美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库猪野生型gi|494385比对,其匹配度79.7%(置信度100%),故推测肽链长度在133~153之间。pMetMb含有7 个α螺旋和2 个3 10螺旋,由于3 10螺旋存在(马Mb没有),使肽链中疏水基团作用加强,形成更加紧密盘叠的球状亚基;第6和7螺旋的His64和His93的咪唑基团N(Im N—)与Fe 2+/Fe 3+键合,构成核心heme-Fe功能域;它镶嵌于蛋白质内部疏水结构内,更便于电子传递和Fe 2+/Fe 3+氧化还原反应,维系肉色。

关键词:高铁肌红蛋白;氨基酸种类;α螺旋;分子结构信息;猪心肌

肉色作为肉品品质的重要质量和经济指标之一,也是消费者购买肉及肉制品的首要参考因素 [1-4]。宰后生鲜肉的色泽主要由肌细胞内肌红蛋白(myoglobin,Mb)的含量及其氧化还原状态决定 [2-3]。Mb广泛存在于脊柱动物的心肌和骨骼肌细胞,有3 种存在形式,即Mb、氧合肌红蛋白(myoglobin-O 2,MbO 2)和高铁肌红蛋白(metmyoglobin,MetMb) [4]。三者不断进行氧化还原反应,相互转化,从而维系畜肉理想的鲜红色 [2-3,5-12]

随着对肉色研究的深入,大部分研究者并未对影响肉色的Mb的分子信息和结构特征做出较好的阐释 [2-3,5-7]。为此经过10余年的科研工作,本课题组从中国山猪心肌中成功分离纯化出了高铁肌红蛋白(pMetMb) [13-14],希望通过对其分子信息和化学结构的深入研究,探究其影响猪肉色稳定性的分子生物学机理,为进一步的肉色及护色等相关研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

马心肌肌红蛋白(horse myoglobin,hMb):棕红色粉末,纯度为90.0%,购于美国Sigma公司,为参照。猪心肌高铁肌红蛋白(pig metmyoglobin,pMetMb):棕红色粉末,纯度≥93.0%,南京师范大学金陵女子学院功能性食品实验室制备 [13-14]

α-腈基-4-羟基苯丙烯酸(纯度≥95.0%) 美国Sigma公司;乙腈、三氟乙酸、碘乙酰胺(均为色谱纯)德国Merck公司;胰蛋白酶(Trypsin)(质谱纯) 美国Promega公司;考马斯亮蓝R-250 美国Amresco公司;蛋白质Marker、丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺(29∶1,m/m,分析纯) 生工生物工程(上海)股份有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

4800 Plus MALDI TOF/TOF TMAnalyzer质谱仪美国ABI公司;GelDoc 2000成像系统 美国Bio-Rad公司;L-8900全自动氨基酸分析仪 日本Hitachi公司;UV-6100A紫外分光光度计 上海安锐自动化仪表有限公司;DYY-12电泳仪 北京六一仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 2 种Mb紫外和电泳定性

0.2 mol/L pMetMb和hMb水溶液置于紫外-可见分光光度计下190~900 nm波长范围内扫描,检测其特征峰波长 [15];以14.4、20.0、31.0、45.0、66.2、98.0 kD蛋白质标准品为基准,将纯化后pMetMb于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)100 V、2~3 h条件下电泳(5%浓缩胶、12%分离胶、考马斯亮蓝R-250染色后脱色)并成像,得到其表观分子质量 [13-14];重复6 次。

1.3.2 2 种Mb氨基酸组分及比对

参照GB/T 18246—2000《饲料中氨基酸的测定》,分别将2 种Mb按1∶1(m/V)溶于6 mol/L HCl,110 ℃条件下至完全消化,用全自动氨基酸分析仪检测2 种Mb酸解氨基酸组分(amino acids,AAs),计算AAs种类、数量和百分比并进行2 种Mb间的比对 [16]

1.3.3 pMetMb分子结构信息解析

pMetMb裂解:将pMetMb按1∶5(m/V)溶于10 mg/mL胰蛋白酶液中,于37 ℃水浴20 h,之后加入100 μL 60%乙腈-0.1%三氟乙酸15 min超声并于-83 ℃冻干后备用。

pMetMb一级结构质谱解析:质谱仪工作条件:200 Hz/355 nm Nd-YAG激光器、2 kV加速电压及碰撞能量、800~4 000 D肽指纹图谱(peptide mass fingerprinting,PMF)质量扫描区域、信噪比大于50母离子、2 500 次激发二级质谱(mass spectrometry/mass spectrometry,MS/MS)、正离子模式自动采集数据;NCBI-SUS scrofa数据库、MS+MS/MS的Masot软件联合检索。

pMetMb裂解液冻干粉复溶于2 μL体积分数20%乙腈,取1 μL复溶液点于不锈钢靶板(384 孔)并自然干燥,再滴加0.5 µL过饱和α-腈基-4-羟基苯丙烯酸基质溶液(50%乙腈-0.1%三氟乙酸)并自然干燥,之后置于4800基质辅助激光解析串联飞行时间二级质谱(matrixassisted laser desorption ionization time of flight/ionization time of flight-MS,MALDI TOF/TOF-MS),进行小片段肽链的氨基酸序列解析 [17]

1.3.4 2 种Mb分子结构信息比对

2 种Mb氨基酸序列同源性和差异性,采用美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库及其中NCBI-BLASTp计算软件进行计算 [18];且在PDB数据库中,运用pyMOL软件推演并显示pMetMb二级结构和三级结构。

2 结果与分析

2.1 pMetMb和hMb的化学态分析

经紫外全程扫描,pMetMb和hMb均在409 nm波长处的Mb特征区域呈现蛋白质特征峰,故同属哺乳类Mb(图1);不论是否采用K 3Fe(CN) 6氧化hMb,hMb、hMb+K 3Fe(CN) 6和pMetMb的特征峰高度重合,其中hMb和hMb+K 3Fe(CN) 6峰高和出峰时间高度一致,说明hMb实质为马心肌高铁肌红蛋白(horse metmyoglobin,hMetMb),可与pMetMb进行同类化合物分子信息和结构的比较 [19]。在前人研究的基础上可知 [20-21],409 nm是MetMb紫外特征吸收波长,而MbO 2的紫外特征吸收波长则在420、540、580 nm左右处,Mb在430、560 nm左右处。由此可鉴定所获得蛋白质的MetMb化学态归属,因此本实验制备的猪心肌pMetMb确实归属于氧化态的MetMb。

SDS-PAGE法测得pMetMb表观分子质量为17 kD,而hMb分子质量为16.9 kD [22-23](图2)。众所周知,Mb在长期进化中具有高度稳定性和传承性,尤其在高等哺乳类动物中,心肌源的Mb在分子质量上高度接近,差异不足4% [18,23-24]

从hMb和pMetMb水溶液电泳和紫外扫描结果判断:二者均为单条带的单一肽链蛋白质,409 nm波长处呈现紫外特征光谱,均属于氧化态Mb,即MetMb,故hMb可作为本研究参照物。

图1 pMetMb和hMb紫外光谱
Fig.1 UV spectra of pMetMb and hMb

图2 pMetMb的SDS-PAGE图
Fig.2 SDS-PAGE of pMetMb

2.2 2 种MetMb氨基酸组分

2.2.1 氨基酸种类的比较

表1 2种MetMb氨基酸组成
Table 1 Amino acid comparison of two MetMbs

注:—.未检测出。

性/% AAs比例/%差异性/% pMetMbhMetMbpMetMbhMetMb甘氨酸(Gly)1.746.0555.33胱氨酸(Cys)5.451.1964.16丝氨酸(Ser)2.122.6410.92精氨酸(Arg)—1.61100丙氨酸(Ala)6.157.046.75蛋氨酸(Met)0.191.0970.31苏氨酸(Thr)1.824.3240.72谷氨酸(Glu)7.1212.7328.26缬氨酸(Val)7.903.5038.60天冬氨酸(Asp)3.617.2133.27异亮氨酸(Ile)1.424.7854.19赖氨酸(Lys)7.4314.9533.60亮氨酸(Leu)6.2612.4433.05苯丙氨酸(Phe)7.436.4372.15酪氨酸(Tyr)2.272.270组氨酸(His)18.9910.5428.61脯氨酸(Pro)—4.12100氨(NH 3)2.971.7126.92 AAs比例/%差异

由表1、图3可知,2 种MetMb盐酸水解后,揭示出pMetMb和hMetMb分别由15、17 种AAs组成;其中pMetMb AAs与hMetMb相比缺失脯氨酸(Pro)和精氨酸(Arg);经比对,2 种蛋白质AAs种类同源性高达88.2%,差异仅为11.8%,符合同源蛋白质基本规律;因物种进化,马属于哺乳类动物中的草食动物,而猪属于杂食动物,在早期物种分化上早已分支,它们心肌Mb/MetMb的AAs种类从而发生了微小改变,并具备了各自物种的特征 [23-24]

图3 hMetMb(a)和pMetMb(b)的氨基酸组分
Fig.3 Amino acid composition of hMetMb (a) and pMetMb (b)

2.2.2 氨基酸比例的比较

根据组分中每一氨基酸的峰高和半峰宽计算其所占总数比例,结果发现2 种MetMb中17 种AAs比例不尽相同,其中pMetMb AAs组分缺少Pro和Arg,其比例分别记为0%,因此pMetMb和hMetMb中这两种氨基酸比例差异达100%;比较其他15 种AAs,对应的比例均不相同,存在不同程度的差异(表1,图3)。

经分析,二者均有8 种AAs比例超过5%。pMetMb组分中His比例最高,达到18.99%;hMetMb中Lys最高,达到14.95%,其次是12.73% Glu和12.44% Leu。比较后注意到,hMetMb中Lys比例几乎是pMetMb的2 倍,而Cys+ Met比例则明显低于pMetMb(表1,图3)。

对2 种MetMb中17 种AAs所占比例进一步分析,仅Pro、Arg、Phe、Met、Cys、Gly和Ile 7 种AAs的比例差异较大,平均73.73%;Tyr无差异;其他AAs比例差异都在50%以下,其中仅Ser和Ala差异在20%以下,分别为10.92%和6.75%。经加权分析(AAs种类差异性/%= {[(1.74+6.05)×55.33+(2.12+2.64)×10.92+(6.15+7.04)×6.75+(1.82+4.32)×40.72+(7.90+ 3.50)×38.60+(1.42+4.78)×54.19+(6.26+12.44)× 33.05+(2.27+2.27)×0+(0+4.12)×100+(5.45+1.19)×64.16+(0+1.61)×100+(0.19+ 1.09)×70.31+(7.12+12.73)×28.26+(3.61+7.21)× 33.27+(7.43+14.95)×33.60+(7.43+6.43)×72.15+(18.99+10.54)×28.61+(2.97+1.71)×26.92] /(2×17×10 4)}×100),2 种MetMb AAs比例的同源性为98.1%,差异性仅为1.9%,属于高度同源的蛋白质。

2.3 2 种MetMbs肽链氨基酸序列解析与比较

2.3.1 pMetMb氨基酸序列解析

酶解pMetMb经MALDI TOF质谱累积扫描25 次,得到一级质谱的肽指纹图谱。由图4可知,800~4 000 D范围内共有137 个肽片段;进一步缩小分子质量范围,800~2 000 D含有104 个肽片段,2 000~3 000 D中有21 个肽片段,而3 000~4 000 D中仅含12 个肽片段,该蛋白质酶解后肽链AAs片段主要集中在800~2 000 D,占总数的76%。

图4 MALDI-TOF质谱pMetMb离子峰
Fig.4 Peptide ions of pMetMb in MALDI TOF mass spectrum

选取一级质谱中峰型好、强度高的离子峰片段,高能量(2 kV)碰撞诱导肽片段进一步裂解(collisioninduced dissociation,CID),并用MALDI TOF/TOF二级质谱累积扫描2 500 次,从而获得8 个二级质谱的肽碎片指纹图谱(peptide fragment fingerprinting,PFF),即8 个氨基酸序列小片段。根据pMetMb的PMF结合其8 个PFF,在NCBI数据库蛋白质猪源子库(gi)进行搜索和比对,仅得到PMF中m/z 1 955.268 6及8 个PFF中m/z 1 393.990 6、1 488.850 5、1 593.070 1和1 827.156 6这5 片段精确氨基酸排序,一级结构与gi|494385匹配最近,725 分Mascot,置信度100%,匹配度79.7%(图5,表2)。

图5 MALDI TOF/TOF质谱pMetMb离子峰
Fig.5 Peptide ions of pMetMb by MALDI TOF/TOF mass spectrometry

A~D分别表示A、B、C1、D的二级质谱片段。

表2 pMetMb肽链AAs序列NCBI数据库检索
Table 2 Peptide sequence alignment of pMetMb in NCBI

蛋白质名称序列号分子质量/D等电点相似性得分相似性得分置信度/%离子得分离子得分置信度/%匹配度/% pMetMbgi|49438516 901.86.5472510066210079.7

pMetMb 5 片段氨基酸序列依次命名为A、B、C1、C2和D片段(图6),分别起始于17~31位(15 AAs)、64~77 位(14 AAs)、80~96 位(17 AAs)、79~96 位(18 AAs)和119~133 位(15 AAs)。

研究发现,其中C2片段在N端比C1片段多一位Lys;同时在m/z 2 083.396 2 处的一级质谱解读到另一离子峰,与数据库gi|494385比对,该片段可能是19 AAs多肽,且在N端再增加一位K,因此其肽链AAs序列推测为KKGHHEAELTPLAQSHATK,且指认为C3片段。pMetMb肽链可任意在第80位、第79位或第78位Lys处被Trypsin水解或剪切,形成C1、C2和C3片段,只是分子质量或AAs序列略有不同(图4,图6),符合前人推理 [25]。由此表明,本实验室制备的pMetMb肽链AAs序列至少含有133 AAs,与蛋白质数据库猪子库中gi|494385猪野生型Mb/MetMb分子信息高度同源,故pMetMb肽链AAs的一级结构归属于猪种MetMb。

研究进一步分析了B和C片段AAs序列(图6),发现第64位(B片段)和93位(C片段)的His在蛋白质α螺旋过程中,2 His所在咪唑基团(Imidazole,Im)高度接近,可能是构成heme的基础。其中N—可与Fe 2+/Fe 3+形成配位,不断由6配位低自旋(heme-Fe 3+)转化为5配位高自旋(heme-Fe 2+),通过电子传递携带O 2,营养肌肉组织,以维系肉色稳定 [2-3]。经紫外光谱证实:在409 nm波长处存在heme-Fe 3+结构特征峰(图1),佐证了在B和C片段处形成heme环状结构的可能性。

图6 MetMb肽链氨基酸序列
Fig.6 Amino acid sequences in 2 MetMb

黑体为同位置换。

2.3.2 2 种MetMbs氨基酸同位置换及差异

根据蛋白质NCBI数据库检索,得到一高度同源的猪野生型Mb/MetMb(gi|494385)和马心肌Mb/MetMb(gi|157834316)分子信息,它们肽链均为153 AAs。由本实验室制备的pMetMb其MALDI TOF/TOF质谱得到的结果,它的分子信息与猪野生型gi|494385高度匹配,因此本实验以猪gi|494385和马gi|157834316进行物种间AAs序列比对。

2 种MetMbs比对(BLASTp)后发现,AAs序列中有14 位点同位置换,分别在第9位(Leu/Gln)、第21位(Val/Ile)、第34位(Lys/Thr)、第51位(Ser/Thr)、第53位(Asp/ Ala)、第66位(Asn/Thr)、第67位(Thr/Val)、第87位(Thr/Lys)、第101位(Val/Ile)、第109位(Glu/Asp)、第113位(Gln/His)、第116位(Gln/His)、第132位(Ser/Thr)和第142位(Met/Ile),其物种间差异仅为9.2%(图6)。

进一步统计2 种MetMbs肽链中相同AAs个数,其中7 种AAs(Gly、Tyr、Pro、Cys、Arg、Asp和Phe)个数完全一致,另5 种AAs(Ala、Val、Leu、Glu和Lys)个数达到98.8%,仅Ser、Thr、His、Ile和Met 5 种AAs个数差异较大(表3)。

表3 2种MetMb肽链的氨基酸个数
Table 3 Number comparison of amino acids between two MetMb

AAshMetMb pMetMb AAshMetMbpMetMb Gly1515 Cys00 Ser58Arg22 Ala1514Met23 Thr75Glu1314 Val78Trp32 Ile96Lys1918 Leu1718Phe77 Tyr22His118 Pro44Asp88

本研究分析表明,Mb/MetMb是高度进化的蛋白质,尤其在高等哺乳类动物间,猪和马的同源性可高达90.8%。

2.4 pMetMb高级结构解析

2.4.1 二级结构解析

NCBI数据库中pMetMb与猪野生型Mb/MetMb(gi|494385)的AAs序列比对,二者匹配度79.7%,为高度同源蛋白质。

MALDI TOF/TOF得到的pMetMb 4/5典型小肽片段,经PDB二级结构解析,解读出pMetMb具有7 个α螺旋和2 个3 10螺旋共9 个螺旋结构。A、B、C1/C2和D小肽片段分别构成第2螺旋、第6螺旋、第7螺旋和第9螺旋N端部分区域,还包括第6、7螺旋和第8、9螺旋间的无规卷曲。

文献指出,其他大多数哺乳类动物,如抹香鲸或马,肌红蛋白二级结构仅有8 个α螺旋 [4,26];但猪的第3螺旋结构被分裂成2 个3 10螺旋,即形成第3和第4螺旋 [27]。由于3 10螺旋更紧密,片段更短,更有利于肽链三级结构的形成。本实验前期采用光谱学手段,指认pMetMb二级结构,其α螺旋结构可高达50%,属于高度螺旋的球状蛋白质 [28-29]

由于第6和7螺旋在空间结构上相互靠近,二螺旋间的无规卷曲形成疏水间隙,heme-Fe镶嵌其中,heme-Fe两侧的His64和His93通过咪唑环N—与Fe 2+/Fe 3+形成配位结构,其作用力使二螺旋间的无序卷曲发生弯曲,从而导致第6和第7螺旋空间结构进一步相向接近,更有利于Fe 2+和Fe 3+电子传递,从而构成Mb/MetMb核心结构功能域 [4,27,30]

2.4.2 三级空间结构推演

图7 pMetMb空间结构
Fig.7 Spatial structure of pMetMb

采用pyMOL软件,推演pMetMb三级空间结构。由于该蛋白质肽链结构可形成7 个α螺旋和2 个3 10螺旋,螺旋与螺旋间在侧链基团(H—H,S—S等)的非极性键作用下,紧密盘曲折叠,形成球状结构(图7A);在第6和7螺旋间形成内部狭窄的疏水间隙,即在球蛋白质分子表面出现凹陷区域,官能团heme-Fe镶嵌于此(图7B)。

3 结 论

通过对pMetMb较hMetMb中AAs组分的解析、计算和比对,pMetMb较hMetMb缺失Pro和Arg,且AAs比例和个数不尽相同。但它们种类同源性达88.2%,比例和个数分别为98.1%和90.8%,证明二者AAs组分高度同源。

一级结构测序说明pMetMb肽链至少含有133 种AAs;经将5 个重点小肽片段与NCBI数据库中猪野生型gi|494385精确比对,其79.7%匹配度(置信度100%)证明研究获得的pMetMb属于猪源MetMb,而推测出pMetMb肽链中AAs序列长度在133~153之间。

pMetMb的二、三级结构含有7 个α螺旋和2个3 10螺旋,且螺旋间存在部分无规卷曲;由于3 10螺旋存在,二级结构中疏水基团更易相互作用,形成紧密折叠的球状亚基。

pMetMb肽链His64和His93分别位于第6和第7螺旋,2 His Im N-形成内部疏水结构,与Fe 2+/Fe 3+键合后构成核心功能域,导致heme-Fe 2+/Fe 3+官能团镶嵌于此,更便于电子传递和Fe 2+/Fe 3+氧化还原反应,以维系理想肉色。

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Structural Elucidation of Metmyoglobin in Pig Myocardium

LI Yadong, WU Mingcao, JIN Bangquan*
(Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China)

Abstract:The structural elucidation of metmyoglobin (Mb) is helpful for understanding the mechanism of meat color. Molecular information and three-dimensional structure of metmyoglobin (pMetMb) in pig myocardium were studied by SDS-PAGE, UV spectroscopy, amino acid analysis, mass spectrometry and bioinformatics. The peptide chain of pMetMb was composed of at least 133 amino acids (AAs). AAs from pMetMb lacked proline (Pro) and arginine (Arg) compared with horse Mb (hMb). pMetMb was matched 79.7% (100% confidence) with gi|494385 in NCBI database, suggesting that the length of pMetMb peptide was in the range of 133-153 AAs including 7 α-helixes and 2 3 10helixes in its secondary structure. Due to the 3 10helixes, hydrophobic groups in pMetMb had increased interaction with each other and the peptide chain highly folded as globin subunit, while hMb contained no 3 10helixes. Both His64 and His93 located at the 6 thα-helix and 7 thα-helix contained imidazole group with nitrogen (N-) that could bind with Fe 2+/Fe 3+to form heme-Fe domain which was embed into hydrophobic groups, facilitating electron transfer and oxidation-reduction and consequently for maintaining desirable meat color.

Key words:metmyoglobin (MetMb); amino acids; alpha helix; molecular and structural information; pig myocardium

中图分类号:TS251

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2015)21-0062-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201521013

收稿日期:2015-01-05

基金项目:江苏省自然科学基金项目(BK2009402);江苏省农业科技创新项目(CX(11)1301)

作者简介:李亚东(1989—),男,硕士研究生,研究方向为食品肉品学。E-mail:ns_liyadong@163.com

*通信作者:金邦荃(1956—),女,教授,博士,研究方向为食品科学。E-mail:jinbangquan@njnu.edu.cn