鞠秀云，姜素平，刘金娟，袁 博，蒋继宏 *
（江苏师范大学 江苏省药用植物生物技术重点实验室，江苏 徐州 221116）
摘 要：为探究黑大蒜和鲜大蒜中可溶性蛋白成分的差异，采用研磨浸提、硫酸铵沉淀、凝胶柱层析的方法，获得黑大蒜和鲜大蒜可溶性蛋白；采用阿尔玛蓝（Alamar Blue）法检测其体外抗肿瘤活性，采用牛津杯法检测其抗菌活性，并利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析其可溶性蛋白成分的差异。结果表明：从黑大蒜和鲜大蒜中提取的可溶性蛋白均具有抗人肝癌细胞株HepG2的活性，鲜大蒜中可溶性蛋白的抗肿瘤活性高于黑大蒜中可溶性蛋白的抗肿瘤活性，且具有耐热性；鲜大蒜中可溶性蛋白还具有抗大肠杆菌和抗金黄色葡萄球菌的活性，其分子质量在10～55 kD之间；黑大蒜中的可溶性蛋白不具有抗菌活性，其分子质量在10 kD左右。黑大蒜与鲜大蒜的可溶性蛋白在种类上差异较大，在抗人肝癌细胞株HepG2、抗大肠杆菌和抗金黄色葡萄球菌的功能上差异显著。
关键词：大蒜；可溶性蛋白；抗肿瘤；抗细菌活性
大蒜（Allium sativum L.）为百合科葱属多年生草本植物的地下鳞茎，具有抗菌消炎 [1-2]、增强免疫力 [3]、护肝 [4]、防癌 [5]、抗癌 [6-7]、延缓衰老 [8]、降低胆固醇水平 [9]和降低心血管疾病风险 [10-11]等多种功效。对于大蒜这些药理活性的物质基础目前研究较多的是含硫有机化合物 [12-13]（主要包括蒜氨酸、大蒜素等）和大蒜多糖 [14-15]。
黑大蒜是以新鲜的生大蒜为原料，经过清洗、一定条件下较长时间的美拉德反应、干燥等过程加工而成的一种新型大蒜制品。它去除了大蒜的异味，带有甜味、口感较好。研究表明黑大蒜中多种营养成分（如糖分、多酚、氨基酸）的含量增加了1 倍以上 [16-17]，而作为美味成分的氨基酸、果糖的含量则比鲜大蒜增加了2.5 倍 [18-19]；陈浏丹 [20]还对黑大蒜提取物对固有免疫细胞抗肿瘤活性的影响进行了相关研究。但目前对于大蒜中蛋白质的研究却较少，仅魏雪盈等 [21]从鲜大蒜中分离到两种抗真菌活性蛋白，另有一些研究者采用凯氏定氮法测定了黑蒜总蛋白质的含量 [22]。本实验采用提取法将黑大蒜和鲜大蒜中的可溶性蛋白提取后进行检测，比较其含量和相关活性差异，为人们正确理解黑大蒜和鲜大蒜的保健功能提供实验依据。
1.1 材料
鲜大蒜 市售；黑大蒜 徐州绿之野生物食品有限公司。
大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）均由江苏省药用植物生物技术重点实验室提供。
人肝癌细胞株HepG2，江苏省药用植物生物技术重点实验室提供。
Bradford蛋白浓度测定试剂盒 碧云天生物技术研究所；阿尔玛蓝（Alamar Blue）、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、Tris、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）、考马斯亮蓝R-250 美国Sigma公司；Bio-Gel P4 Gel 美国Bio-Rad公司；其余试剂为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
D37520型Heraeus Biofuge台式高速离心机 德国Kendrc公司；CO 2细胞培养箱 美国Thermo公司；电泳系统 美国Bio-Rad公司；SpectraMax M2酶标仪 美国分子仪器公司；AKTA purifier快速纯化系统（配有可变波长紫外检测器、实时电导监测器、样品自动收集器和色谱工作站） 美国GE医疗集团。
1.3 方法
1.3.1 可溶性蛋白提取
硫酸铵沉淀：将样品剪碎，加少量10 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.5），充分研磨后，再加入两倍体积磷酸盐缓冲液，4 ℃条件下浸泡10 h以上。将浸提液4 ℃、8 000 r/min离心10 min，取上清液，加入硫酸铵固体到80%饱和度，4 ℃静置过夜，12 000 r/min离心30 min，收集沉淀，溶于10 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.5），得到可溶性蛋白粗提液，－20 ℃保存。
凝胶柱层析脱盐脱色：取上述可溶性蛋白粗提液，上样到平衡好的Bio-Gel P4 Gel柱（1.5 cm×27 cm，45～90 μm），用20 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.5）洗脱，洗脱流速为1.0 mL/min，紫外检测器波长280 nm，按峰收集洗脱液。
1.3.2 可溶性蛋白含量测定
采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒，具体操作按试剂盒说明书进行，以牛血清白蛋白为标准样品。
1.3.3 抗肿瘤细胞活性测定
采用Alamar Blue法检测样品可溶性蛋白的体外抗肿瘤活性。将处于对数生长期的HepG2细胞，用完全培养基制成2×10 5个/mL的悬液，用微量加样器接种于96 孔板中，每孔100 μL，边缘孔中不加细胞，仅加完全培养基作为无细胞空白组，（37.0±0.5） ℃、5% CO 2培养箱中培养过夜。每孔加一定量样品，再用完全培养基补加至100 μL；同时留数孔不加样品，补加完全培养基100 μL，作为空白对照组。相同培养条件继续培养48 h后，弃去培养液，每孔用200 μL基本培养基洗一次，倾去，每孔再加入基本培养基180 μL、Alamar Blue 20 μL，继续培养4 h，于激发光波长530 nm、发射光波长590 nm处检测并记录荧光强度，按下式计算样品对HepG2细胞的抑制率。
1.3.4 抗细菌活性测定
采用牛津杯法（管碟法）测定样品的抑菌活性：将灭好菌的LB培养基冷却至60 ℃左右，倒入培养皿内，每皿约15 mL，水平放置至其完全凝固，取0.2 mL制备好的菌悬液（金黄色葡萄球菌和大肠杆菌）在平板上均匀涂布，涂布后以平板无可见水滴为准。用镊子将无菌的牛津杯轻轻放入培养皿中，每皿均匀地放置3 支牛津杯。取样品液0.20 mL加至牛津杯中，每一个样品重复3 次，置于37 ℃培养箱中培养24 h后，观察记录实验结果。
1.3.5 分子质量范围测定
采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）测定黑大蒜和鲜大蒜中可溶性蛋白的分子质量，其中分离胶中丙烯酰胺总含量为15%；浓缩胶中丙烯酰胺总含量为5%，其中交联的丙烯酰胺占2.6%，考马斯亮蓝法染色 [23]。
2.1 可溶性蛋白提取结果
鲜大蒜和黑大蒜经研磨浸提、硫酸铵沉淀、Bio-Gel P4 Gel柱层析后，获得可溶性蛋白，采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定每步提取后的可溶性蛋白含量，计算纯度和回收率，具体结果见表1。
表1 鲜大蒜和黑大蒜中可溶性蛋白提取结果
Table 1 Isolation of soluble proteins from black garlic and fresh garlic
（g/100 g）纯度/%回收率/%研磨浸提12.23.528.7100.011.42.925.4100.0硫酸铵沉淀4.72.451.568.64.12.158.572.4 Bio-Gel P4 Gel柱层析2.32.191.360.02.11.885.762.1提取步骤鲜大蒜黑大蒜粗提物含量/（g/100 g）可溶性蛋白含量/（g/100 g）纯度/%回收率/%粗提物含量/（g/100 g）可溶性蛋白含量/
分析表1的提取结果发现，黑大蒜中提取到的可溶性蛋白比鲜大蒜中略低；而有些文献报道，黑大蒜中的蛋白质含量为鲜大蒜中的2 倍。造成这种差异的原因是获取蛋白的方法不同，文献中普遍采用凯氏定氮法测定蛋白质含量，而非直接测定可溶性蛋白含量。
2.2 可溶性蛋白的抗肿瘤细胞活性
将鲜大蒜和黑大蒜的研磨浸提液和Bio-Gel P4 Gel柱层析后的收集液用水配制成可溶性蛋白含量为1 mg/mL的样品溶液，同时取一定量上述溶液进行95 ℃、5 min的加热处理，将制备好的样品再用细胞培养基进行1∶10、1∶20、1∶40稀释，测定其抗肿瘤细胞活性，具体结果见表2。
表2 鲜大蒜和黑大蒜中可溶性蛋白抗肿瘤细胞活性比较
Table 2 Comparison of antitumor activity of soluble proteins from black garlic and fresh garlic
率/%标准偏差/%抑制率/%标准偏差/%抑制率/%标准偏差/%鲜大蒜浸提液99.41.896.42.045.52.1鲜大蒜柱层析液99.41.798.02.484.13.2鲜大蒜浸提液加热97.92.013.03.1－0.41.4鲜大蒜柱层析液加热98.02.198.22.181.72.0黑大蒜浸提液99.12.772.92.5－9.03.1黑大蒜柱层析液96.22.033.01.87.91.7黑大蒜浸提液加热96.82.764.71.6－14.51.1黑大蒜柱层析液加热95.61.646.52.0－6.71.4样品1∶10稀释液1∶20稀释液1∶40稀释液抑制
分析表2数据可以发现，当质量浓度为1 mg/mL的各样品1∶10稀释后，均表现出很高的抑制人肝癌细胞株HepG2的活性，这说明鲜大蒜和黑大蒜的可溶性蛋白均具有抗肿瘤细胞的活性；但随着溶液稀释倍数的增大，各样品表现出了不同程度的抑制肿瘤细胞活性，当稀释倍数为1∶40时，鲜大蒜柱层析液仍表现出较高的抑制人肝癌细胞株HepG2的活性（加热前样品的抑制率为84.1%，加热后样品的抑制率为81.7%），经相同条件处理的黑大蒜提取液则没有活性。由此可以推断，鲜大蒜中的可溶性蛋白抑制人肝癌细胞株HepG2的活性高于黑大蒜，而且具有耐热性。
从表2的数据中还可以发现，样品稀释倍数增加后，加热后的鲜大蒜浸提液抗肿瘤细胞活性快速下降（1∶40稀释时对HepG2的抑制率为－0.4%），而较纯的蛋白样品，即鲜大蒜柱层析液加热后活性降低较慢，产生这种现象的原因可能是浸提液中的其他成分在加热条件下对可溶性蛋白有破坏作用，这与黑大蒜的可溶性蛋白抗肿瘤活性低于鲜大蒜的结果相一致。黑大蒜是由鲜大蒜在高湿高温的条件下生产得到的 [24]，在此过程中部分具有抗肿瘤活性的可溶性蛋白被降解，从而导致其抗肿瘤活性低于鲜大蒜。
2.3 可溶性蛋白的抗细菌活性
将从鲜大蒜和黑大蒜中提取的可溶性蛋白配制成1 mg/mL的溶液，同时取一定量上述溶液进行95 ℃、5 min的加热处理，将上述样品分别进行抗大肠杆菌和抗金黄色葡萄球菌的实验，结果如图1～3所示。
图1 鲜大蒜中可溶性蛋白对大肠杆菌的抑制作用
Fig.1 Inhibitory effect of soluble proteins from fresh garlic on Escherichia coli
a. 浸提液；b. 柱层析液；c. 浸提液加热；d. 柱层析液加热。图2同。
图2 鲜大蒜中可溶性蛋白对金黄色葡萄球菌的抑制作用
Fig.2 Inhibitory effect of soluble proteins from fresh garlic on Staphylococcus aureus
由图1、2可知，鲜大蒜的可溶性蛋白对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用，但加热后抑菌活性基本消失，这说明鲜大蒜中具有抗菌活性的可溶性蛋白不具有耐热性。由图3可知，黑大蒜的可溶性蛋白没有抑菌活性。
图3 黑大蒜中可溶性蛋白对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用
Fig.3 Inhibitory effect of soluble proteins from black garlic on Escherichia coli and Staphylococcus aureus
a. 浸提液对大肠杆菌的作用；b. 柱层析液对大肠杆菌的作用；c. 浸提液对金黄色葡萄球菌的作用；d. 柱层析液对金黄色葡萄球菌的作用。
2.4 可溶性蛋白分子质量范围
将经过Bio-Gel P4 Gel柱层析获得的可溶性蛋白配成2 mg/mL的溶液，取20 μL进行SDS-PAGE分析，结果显示鲜大蒜的可溶性蛋白分子质量主要在10～55 kD范围内（图4中2号条带），而黑大蒜的可溶性蛋白分子质量主要在10 kD左右（图4中3号条带）。这说明鲜大蒜经高温高湿的等工艺生产得到黑大蒜，在此过程中蛋白质发生了降解，使得黑大蒜中可溶性蛋白分子质量明显低于鲜大蒜。
图4 鲜大蒜和黑大蒜可溶性蛋白的SDS-PAGE图
Fig.4 SDS-PAGE of soluble proteins from black garlic and fresh garlic
1.蛋白质分子质量标准；2.鲜大蒜中的可溶性蛋白；3.黑大蒜中的可溶性蛋白。
大蒜是著名的药食两用植物，具有多种生物活性 [25]。随着人们对自身健康的重视以及对天然药食的青睐，已围绕大蒜开发出多种保健食品，如大蒜粉、大蒜油、大蒜饮料、脱水大蒜等 [26-27]，其中黑大蒜因去除了原来的辣味且略带果香味、营养成分丰富而备受人们的喜爱。有关鲜大蒜和黑大蒜营养成分的研究也受到了人们的重视。张鑫等 [28]比较了黑大蒜和鲜大蒜提取物对小鼠细胞免疫功能的影响，发现黑大蒜提取物较鲜大蒜提取物有更强的自然杀伤（natural killer，NK）细胞活性和促NO、白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、IL-17、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）分泌的作用；二者对IL-4的分泌水平无影响。王卫东等 [29]对黑大蒜在生产过程中的营养成分变化和抗氧化活性进行了研究，发现黑大蒜中的水分含量相较于鲜大蒜有所下降；还原糖、总酸、总酚含量相较于鲜大蒜有所上升，黑大蒜的还原能力、羟自由基清除率分别是鲜大蒜的10 倍和3 倍。由此得出黑大蒜抗氧化能力的增强在一定程度上与其含有的总酚和美拉德反应产物含量增加有关的结论。
在对于蛋白质含量的变化研究中，研究者普遍采用凯氏定氮法测定，得出黑大蒜蛋白含量比鲜大蒜增加了1 倍左右的结论。凯氏定氮法测定的是样品中总氮元素的含量，是间接测定样品中蛋白质含量的一种方法。鲜大蒜经过较长时间的美拉德反应后，一些蛋白质会发生变化，可能会使原本的蛋白氮变成非蛋白氮。因此，仅通过比较黑大蒜和鲜大蒜中的总蛋白含量来评估两者的优劣不够全面和科学。本研究将样品中的可溶性蛋白提取后进行测定，比较其含量和相关活性的差异。结果发现，黑大蒜中的可溶性蛋白分子质量远低于鲜大蒜，这说明经过美拉德反应后，高分子质量的蛋白质降解为低分子质量的蛋白质，甚至是氨基酸。蛋白质分子质量的降低有利于人体肠道的消化吸收，对于胃肠道功能较弱的人，食用黑大蒜更有利。然而随着蛋白质分子质量的改变，其功效也发生了改变，黑大蒜中可溶性蛋白的体外抗肿瘤活性、抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的活性有所下降。本研究结果为人们理解黑大蒜和鲜大蒜的保健功能和正确食用两类食品提供了实验依据。
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Comparison of Soluble Protein Components of Black Garlic and Fresh Garlic
JU Xiuyun, JIANG Suping, LIU Jinjuan, YUAN Bo, JIANG Jihong*
(Key Laboratory of Biotechnology for Medicinal Plant of Jiangsu Province, Jiangsu Normal University, Xuzhou 221116, China)
Abstract：The aim of this study was to compare the difference of soluble protein components isolated from black garlic and fresh garlic. Soluble proteins were isolated from garlic by serial extraction methods including grinding, ammonium sulfate precipitation and gel filtration. Then, the antitumor activities of the extracts were determined in vitro using alamar blue method; the antibacterial activities were detected by oxford cup assay; and the differences of soluble protein components were further compared using SDS-PAGE. The results showed that the soluble protein components from both fresh garlic and black garlic were able to inhibit the growth of HepG2 cells. The soluble protein components from fresh garlic had stronger antitumor activity than those from fresh garlic and had heat resistance property. The soluble protein components from fresh garlic could inhibit Escherichia coli and Staphylococcus aureus. SDS-PAGE results showed that the molecular weight of soluble proteins in fresh garlic was in the range from 10 to 55 kD, and was about 10 kD for black garlic. This study indicated that there were significant differences in soluble protein species and functions between black garlic and fresh garlic.
Key words：garlic; soluble protein; antitumor; antibacterial activity
中图分类号：TS255.1
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）21-0090-05
doi：10.7506/spkx1002-6630-201521018
收稿日期：2014-12-31
基金项目：徐州市科技计划项目（XF13C036）
作者简介：鞠秀云（1973—），女，高级实验师，硕士，研究方向为天然产物化学。E-mail：juxiuyun@jsnu.edu.cn
*通信作者：蒋继宏（1962—），男，教授，博士，研究方向为药用植物生物技术。E-mail：jhjiang@jsnu.edu.cn