脂肪酶催化单油酸甘油酯制备功能性1,3-甘油二酯

黄楚楚,熊辉煌,龚 斌,喻 芸,冯 越,梁 媛,朱雪梅*

(南昌大学食品学院,食品科学与技术国家重点实验室,江西 南昌 330047)

摘 要:研究固定化脂肪酶TLIM催化单油酸甘油酯(glycerol monooleate,GMO)制备1,3-甘油二酯(sn-1,3-diacylglyerol,sn-1,3-DAG)。比较了游离脂肪酸(共轭亚油酸)和脂肪酸乙酯(共轭亚油酸乙酯)两种不同类型酰基供体、反应时间、底物物质的量比对酰基迁移和sn-1,3-DAG的影响。通过对实验结果的判定及分析得到最佳反应条件为采用20%(质量分数)脂肪酶TLIM、底物物质的量比(共轭亚油酸乙酯和GMO)3∶1、在50 ℃的220 r/min水浴摇床中反应2 h,最后得到sn-1,3-DAG转化率为65%。本研究利用GMO而不是常规的甘油或者甘油三酯来制备sn-1,3-DAG,并比较了不同酰基供体对酰基迁移和sn-1,3-DAG转化率的影响,旨在为脂肪酶催化法制备功能性sn-1,3-DAG的研究提供一定参考。

关键词:酰基迁移;共轭亚油酸;共轭亚油酸乙酯;单油酸甘油酯;脂肪酶TLIM

甘油二酯(diacylglycerol,DAG)是由两分子脂肪酸分别结合到甘油的两个端羧基上形成的二酯,包含1,3-甘油二酯(sn-1,3-DAG)和1,2-甘油二酯(sn-1,2-DAG)两种同分异构体 [1]。1,3-DAG具有良好的乳化作用,可作为乳化剂广泛应用于食品、药品、化妆品等行业;另外,其生理功能具有多样性,研究表明sn-1,3-DAG具有减少内脏脂肪、抑制体重增加、降低血脂的作用,且起到预防动脉血栓形成、缓解糖尿病、肾病的效果 [2-6],对肥胖、高血脂症、脂肪肝等多种脂肪代谢紊乱疾病患者及潜在患者来说,以功能性的sn-1,3-DAG作为一种新型保健食用油代替常规油脂是该类消费群体的不二选择 [7-9]

目前,制备sn-1,3-DAG的方法主要是化学法和酶法。化学法得到高纯度的产品比较困难,往往需要多步骤的反应以及繁琐的纯化操作,而酶法反应条件温和,且酶的选择性高,较易得到高纯度的1,3-DAG [10-11]。近年来国内外已有一些文献报道利用sn-1,3脂肪酶合成和富集sn-1,3-DAG的方法。日本花王集团所生产的Enova oil就是利用sn-1,3位脂肪酶催化大豆油和加拿大菜籽油,经过一系列优化合成条件,来获得80%纯度的sn-1,3-DAG。至于具体转化技术一直处于商业保密状态。就国内而言,一些知名高校及研究所也对DAG食用油进行了研究开发,但至今未取得sn-1,3-DAG高纯度合成技术的突破性进展。目前为止,sn-1,3-DAG生产中存在的主要问题是目标产品转化率低(目前实验条件下最理想结果仅为50%左右)、底物利用率低,且产生空间异构体(sn-1,2-DAG)、甘油单酯等多种副产物 [12]。这些难题制约sn-1,3-DAG的生产和应用。研究发现导致这些问题的主要原因是酶催化合成DAG过程中存在副反应-酰基迁移 [13]。酰基迁移为脂肪酸从sn1或sn3位转移至sn2位,反之亦然。本实验组曾对酰基迁移的控制进行初步研究,如升高反应温度、非极性反应体系等会促进酰基迁移,反之则抑制酰基迁移 [14]。本实验利用固定化脂肪酶TLIM催化酰基供体和单油酸甘油酯(glycerol monooleate,GMO),在无溶剂体系中发生转酯交换反应制备sn-1,3-DAG,旨在通过探究不同酰基供体、反应时间、底物物质的量比对酰基迁移和sn-1,3-DAG的影响,来优化sn-1,3-DAG的提取条件,提高sn-1,3-DAG的转化率。图1为反应原理示意图。

图1 两种酰基供体与GMO反应制备sn-1,3-DAG的原理图
Fig.1 Reactions of two acly donors with glycerol monooleate for synthesizing sn-1,3-DAG

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

共轭亚油酸 韩国Livemax公司;共轭亚油酸乙酯、游离共轭亚油酸通过碱法催化实验室自制;sn-1(3)-GMO 韩国ⅡShin Wells公司;14% BF 3甲醇溶液、sn-1,3-DAG标准品 美国Sigma公司;脂肪酶TLIM 丹麦诺维信公司;正己烷、异辛烷、甲基叔丁基醚、乙醚(色谱纯) 美国Burdick & Jackson公司;其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

SHA-C恒温水浴振荡器 荣华仪器制造有限公司;AR1140电子分析天平 美国奥豪斯贸易公司;DSY-Ⅲ氮吹仪 金科精华苑科技有限公司;GF254硅胶板 德国Merck公司;1200高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)仪(配备Hypersil BDS CPS型色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)和Model 300S蒸发光散射检测器)、6890N气相色谱(gas chromatography,GC)仪 美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪酶催化酰基供体酯交换反应单因素试验

在反应条件为50 ℃、20%脂肪酶TLIM、220 r/min条件下,考察酰基供体(共轭亚油酸和共轭亚油酸乙酯)、反应时间(0.5、1、2、3、4、6、12、24、48、 96 h)、酰基供体与GMO物质的量比(2∶1、3∶1、4∶1)对sn-1,3-DAG转化率和酰 基迁移的影响,以确定以sn-1(3)-GMO为底物合成sn-1,3-DAG的最佳方法,为合成高质量的sn-1,3-DAG奠定理论基础。

1.3.2 脂肪酶催化酰基供体酯交换反应产物中甘油酯组成测定

参照朱雪梅等 [15]实验方法,采用NP(正相)-HPLC法对产物中甘油酯组成进行分析。采用正己烷和甲基叔丁基醚(均含有体积分数0.4%的乙酸)进行二元梯度洗脱分离,流速为1 mL/min。具体洗脱条件为100%的己烷洗脱5 min;随后在10 min内线性增加甲基叔丁基醚的比例至甲基叔丁基醚-己烷体积比80∶20,保持7 min;然后在5 min内线性减少甲基叔丁基醚的含量至100%的己烷,保持5 min。整个分析过程中,氮气为雾化气体,压力为2.2 Pa,蒸发光散射检测器的温度设为400 ℃ [16]。参照Maurelli [17]、钟南京 [18]等实验中峰总面积表示甘油酯含量。

1.3.3 脂肪酸组成及位置组成分析

游离共轭亚油酸与共轭亚油酸乙酯分别和GMO直接经BF 3法甲酯化进GC分析 [19],而游离共轭亚油酸-GMO与共轭亚油酸乙酯-GMO反应后的合成的sn-1,3-DAG的脂肪酸组成是经过薄层层析(thin layer chromatography,TLC)硅胶板分离再甲酯化,即反应后产物经过TLC分离后再刮板,TLC展开条件为:正己烷-乙醚-乙酸体积比50∶50∶1,即将sn-1,3-DAG条带刮下经BF 3甲醇法甲酯化。甲酯化的方法具体如下:上述刮板分离得到的sn-1,3-DAG和准确称取游离共轭亚油酸、共轭亚油酸乙酯、GMO(各50 mg)分别加入1.5 mL 0.5 mol/L甲醇钠,充分混合后在95 ℃反应3 min,冷却,再加入2 mL体积分数14%的BF 3甲醇溶液并充分混匀,继续在95 ℃条件下反应2 min,冷却后加入1 mL饱和氯化钠和2 mL正己烷,提取脂肪酸甲酯的正己烷溶液经过无水硫酸钠干燥后用于GC分析。配有自动进样器和火焰离子化检测器,色谱柱为SP-2560石英毛细管柱(100 m×0.25 mm,0.2 μm)。实验重复操作2 次。GC分析条件:柱温先在100 ℃保温5 min,采用程序升温以4 ℃/min升至220 ℃保持20 min。载气为N 2,总气体流速为52 mL/min,进样口和检测器温度分别为250 ℃和260 ℃。

1.3.4 酰基迁移程度的计算

酰基迁移为脂肪酸从甘油三酯的sn1或sn3位转移至sn2位,反之亦然。TLIM是sn-1,3专一性脂肪酶,在酯化和转酯交换的反应过程中,脂肪酶TLIM把脂肪酸键入到甘油骨架的sn-1,3位或把甘油骨架上sn-1,3位脂肪酸水解为游离脂肪酸,而HPLC分析结果显示有sn-1,2-甘油二酯和甘油三酯,说明发生了酰基迁移。酰基迁移程度即酰基迁移的量,本实验中,合成1 mol的sn-1,2-DAG或甘油三酯(triacylglycerol,TAG)说明有1 mol的脂肪酸发生了酰基迁移,因此,在本研究中酰基迁移程度由HPLC分析的甘油酯成分计算的,即酰基迁移的甘油酯与合成的总DAG和TAG的含量百分比,计算公式如下:

1.4 统计分析

采用数据分析系统软件(Statistical Analysis System Software 8.2,SAS,Cary,NC)进行方差分析。在α=0.05的水平上对数据进行显著性分析,当P<0.05时,说明差异显著。

2 结果与分析

2.1 反应底物和sn-1,3-DAG的脂肪酸组成分析

表1 游离脂肪酸(游离共轭亚油酸)、脂肪酸乙酯(共轭亚油酸乙酯)、GMO及反应后sn-1,3-DAG的脂肪酸组成
Table1 Fatty acid composition of free fatty acids, fatty acid esters, GMO and the produced sn-1,3-DAG %

注:sn-1,3-DAG 1反应条件:底物为3 mol游离共轭亚油酸与1 mol GMO,20%脂肪酶TLIM反应时间为2 h;sn-1,3-DAG 2反应条件:底物为3 mol共轭亚油酸乙酯与1 mol GMO,20%脂肪酶TLIM反应时间为2 h;ND.未检出;同行肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)。

脂肪酸游离共轭亚油酸共轭亚油酸乙酯GMOsn-1,3-DAG 1sn-1,3-DAG 2C 12∶00.00±0.00 d0.00±0.00 d2.74±0.00 a1.03±0.00 b0.84±0.01 cC 16∶00.10±0.00 d0.10±0.00 d4.29±0.00 a2.15±0.01 b1.73±0.05 cC 18∶00.00±0.00 d0.00±0.00 d2.68±0.05 a1.41±0.04 b1.11±0.13 cC 18∶1, cis93.17±0.011 d3.32±0.01 d76.98±0.06 a37.99±1.35 b24.63±0.11 cC 18∶1, cis110.36±0.12 ab0.29±0.00 ab0.55±0.01 a0.47±0.03 ab0.37±0.12 abC 18∶2, trans9 trans90.57±0.03 d0.51±0.06 d1.68±0.00 a1.26±0.02 b0.92±0.10 cC 18∶2, cis9 cis91.27±0.00 d1.28±0.00 d10.13±0.01 a5.71±0.05 b4.02±0.31 cC 18∶2, cis9 trans11(共轭亚油酸)36.49±0.15 a32.71±0.17 bND21.58±0.75 c21.99±0.74 cC 18∶2, trans10 cis12(共轭亚油酸)54.29±0.24 a48.57±0.12 bND29.43±0.64 d33.62±0.81 c其他共轭亚油酸3.74±0.31 b13.21±0.37 aND12.05±2.90 a10.79±1.52 a总共轭亚油酸94.53±0.00 a94.49±0.00 aND63.06±4.29 b66.39±0.02 b

如表1所示,游离共轭亚油酸和共轭亚油酸乙酯中总共轭亚油酸含量在94%以上,纯度较高。GMO中油酸含量最高为76.98%,其次为亚油酸(10.33%)和硬脂酸(4.29%)。不同类型的酰基供体即游离脂肪酸型(游离共轭亚油酸)和脂肪酸酯(共轭亚油酸乙酯)与GMO经脂肪酶催化酯化后,经TLC板分析得到sn-1,3-DAG进行脂肪酸成分分析,结果显示,与游离共轭亚油酸为酰基供体的反应相比,共轭亚油酸乙酯为酰基供体的sn-1,3-DAG与相同物质的量比(3∶1)的共轭亚油酸含量更高,而油酸等其他脂肪酸含量较少。

2.2 酰基供体和反应时间对脂肪酶催化酯交换反应制备sn-1,3-DAG的影响

图2 NP-HPLC分析甘油酯组分的色谱图
Fig.2 NP-HPLC liquid chromatogram of glyceride components

脂肪酶催化后混合物通过NP-HPLC分析,如图2所示,此分离条件可以很好地将各种成分分离,出峰顺序依次为共轭亚油酸乙酯、游离共轭亚油酸、TAG、sn-1,3-DAG、sn-1,2-DAG和GMO。

图3 脂肪酶TLIM催化GMO与不同酰基供体反应得到甘油酯含量变化
Fig.3 The amount of glycerides from TLIM-catalyzed reaction of GMO with different acyl donors

如图3所示,反应2 h获得sn-1,3-DAG含量最高,在图3a中,实际测得sn-1,3-DAG,sn-1,2-DAG和TAG为60.56%、13.35%和7.84%;而在图3b中,sn-1,3-DAG、sn-1,2-DAG和TAG分别为65.41%、11.57%和7.02%。随着反应时间的延长sn-1,3-DAG的含量逐渐减少,相反sn-1,2-DAG和TAG的含量随着反应时间的延长而增加。在游离共轭亚 油酸为酰基供体的反应体系(图3a)中,在96 h的反应后,体系中sn-1,2-DAG的量与sn-1,3-DAG的量接近。与之不同的是,在以共轭亚油酸乙酯为酰基供体的反应中(图3b),TAG含量在0.5~48 h之间是缓慢增加,而48~96 h之间TAG的含量减少,相应的sn-1,2-DAG的含量迅速增加,说明48 h后sn-1,3专一性脂肪酶催化部分TAG发生水解生成sn-1,2-DAG;特别值得一提的是,在整个反应中sn-1,3-DAG的含量远远高于sn-1,2-DAG的量。Nikolaus等 [20]研究了脂肪酸与单甘酯(monoacylglycerol,MAG)的酯化反应,在优化条件下MAG与脂肪酸的酯化反应可得到70%的DAG,其中1,2-DAG与1,3-DAG含量相当;刘艳丰 [21]研究了单甘脂与脂肪酸在以叔丁醇为溶剂的反应中,MAG到DAG的转化率达到75%,其中sn-1,3-DAG占90%,即sn-1,3-DAG的转化率为67.5%。在本实验的反应体系中,酰基供体共轭亚油酸乙酯的sn-1,3-DAG的转化率最高达65%(反应2 h),而此时得到的sn-1,2-DAG为11%。相比较刘艳丰 [21]方法,本实验采用绿色环保的无溶剂体系,且重点研究控制酰基迁移程度。

TLIM为sn-1,3专一性脂肪酶,在假设酶的1,3-特异性完全专一和不考虑反应过程中的酰基转移时 [22],反应过程中接入的酰基供体理应全部接入GMO骨架的sn-3位上,所以不会产生sn-1,2-DAG和TAG,但检测结果表明合成了sn-1,2-DAG和TAG,说明发生了酰基迁移,酰基迁移在本反应中为不利的副反应,因此需要抑制酰基迁移,而图3表明合理控制反应时间可以一定程度上抑制酰基迁移。本实验通过对不同反应时间(0.5、1、2、3、4、6、12、24、48、96 h)进行采样,结果如图3所示,在反应初期,以游离共轭亚油酸和共轭亚油酸乙酯的两个反应体系中sn-1,3-DAG、sn-1,2-DAG含量随着反应时间的延长而增加,2 h之后,sn-1,3-DAG含量达到最大,其中共轭亚油酸乙酯体系比游离共轭亚油酸体系所得sn-1,3-DAG的含量更高。之后随着反应时间的延长,sn-1,3-DAG含量逐渐下降,但sn-1,2-DAG和TAG含量随着反应时间的延长继续增加,由此确定最佳反应时间为2 h。反应时间的延长能够增加酰基迁移已被多次报道,研究者普遍认为随着时间延长反应体系趋近于动力学平衡,副反应的几率增加。

2.3 底物物质的量比对脂肪酶催化酯交换反应制备sn-1,3-DAG的影响

随着反应底物物质的量的改变,反应体系的稳定性及产物的扩散速率与含量都将受到影响 [23-24]。为此,本实验通过控制变量法改变底物物质的量比为2∶1、3∶1、4∶1,分析底物物质的量比对脂肪酶催化酰基供体酯交换反应的影响。

图4 不同底物物质的量比的对甘油酯含量影响
Fig.4 Infl uence of different substrate ratios on the amount of glycerides

如图4所示,在相同条件下,sn-1,3-DAG的产量随着反应底物物质的量比的增加而逐渐增加,共轭亚油酸乙酯作为酰基供体时的反应的产量更大,考虑到生产成本等因素,本实验确定选择最终底物物质的量比例为3∶1。

2.4 酰基供体和底物物质的量比对酰基迁移程度的影响

为探究其对目标产物的影响机制,本实验通过同一底物物质的量比(3∶1)的游离共轭亚油酸与共轭亚油酸乙酯与GMO的反应所得数据对其进行分析,结果如图5所示。

由图5、6可知,在相同条件下,以游离共轭亚油酸作为酰基供体比共轭亚油酸乙酯作为时酰基迁移程度更大,且反应时间的越长、酰基供体的比例越多酰基迁移程度越高。就游离共轭亚油酸和共轭亚油酸乙酯这两种不同酰基供体而言,游离共轭亚油酸的极性大于共轭亚油酸乙酯。极性酰基供体与添加极性的溶剂促进酰基迁移的原理相似,尽管本实验所用脂肪酶为空间位置专一性,脂肪酶也会促进酰基迁移的发生,而且酰基迁移几乎发生在脂肪酶的活性中心附近。因为在极性弱的体系中,体系中的水分集中在酶的活性中心,体系的极性增强,不利于反应过渡态电荷的分散,因此过渡态的能量状态提高,反应的能垒提高,不利于酰基迁移的发生 [25]。所以酰基供体极性更小的共轭亚油酸乙酯的反应体系中酰基迁移发生率更小。因此,在合成sn-1,3-DAG更宜采用脂肪酸酯作为酰基供体,降低酰基迁移副反应,提高目标产品的转化率。

图5 不同酰基供体对酰基迁移程度的影响
Fig.5 Effect of different acyl donors on the degree of acyl migration

图6 不同底物物质的量比对酰基迁移程度的影响
Fig.6 Infl uence of different substrate ratios on the degree of acyl migration

3 结 论

通过单因素试验探究酰基供体(游离共轭亚油酸和共轭亚油酸乙酯)与GMO物质的量比对催化反应产物转化率的影响。再以共轭亚油酸乙酯为酰基供体对时间等条件优化,得到脂肪酶催化法制备功能性sn-1,3-DAG的最优条件为:共轭亚油酸乙酯与GMO物质的量比3∶1、酶加入量20%、反应温度50 ℃、反应时间2 h。采用上述反应条件,与游离共轭亚油酸相比,以共轭亚油酸乙酯为酰基供体的反应实际测得sn-1,3-DAG含量更高(65.41%),酰基迁移程度更低,在将来中式生产中,经过分子蒸馏等纯化手段,分离除去未反应的MAG和重馏分的TAG,sn-1,3-DAG的理论纯度可以达到85%以上,可以用于生产高纯度sn-1,3-DAG。所制备的sn-1,3-DAG中共轭亚油酸含量达到66.39%。

通过比较游离脂肪酸和脂肪酸乙酯两种不同酰基供体,用极性更低的共轭亚油酸乙酯代替游离共轭亚油酸可以降低酰基迁移程度,降低副产物sn-1,2-DAG的得率不仅提高sn-1,3-DAG的纯度和转化率,还降低后续产物的纯化难度。因此以脂肪酸酯为酰基供体制备sn-1,3-DAG和其他的高附加值的位置异构体是更理想的选择。本实验对共轭亚油酸乙酯为酰基供体的研究尝试奠定了利用脂肪酸酯为酰基供体制备高附加值的位置异构体制备的理论依据。

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Production of Functional 1,3-Diacylglyerol from Monoacylglycerol by Lipase-Catalyzed Transesterifi cation

HUANG Chuchu, XIONG Huihuang, GONG Bin, YU Yun, FENG Yue, LIANG Yuan, ZHU Xuemei*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Abstract:sn-1,3-Diacylglycerol (sn-1,3-DAG) was synthesized from glycerol monooleate (GMO) by the immobilized Thermomyces lanuginosus lipase (Lipozyme TLIM)-catalyzed esterifi cation in a solvent-free system. The effects of different types of acyl donors such as conjugated linoleic acid (CLA-FA) and conjugated linoleic acid ethyl ester (CLA-EE), reaction time and molar ratio of substrates on acyl migration and glyceride concentration were investigated to improve the yield of sn-1,3-DAG. of the yield of sn-1,3-DAG was 65% when the reaction proceeded at a TLIM concentration of 20% by mass with a molar ratio of conjugated linoleic acid ethyl ester (CLAEE):GMO of 3:1 for 2 h at 50 ℃ in a water bath shaker at 220 r/min. Also, the effects of two types of acyl donors (free acid and ethyl ester) on acyl migration and the yield of sn-1,3-DAG were compared. This study can provide a reference for the industrial production of sn-1,3-DAG.

Key words:transesterifi cation; conjugated linoleic acid; conjugated linoleic acid ethyl ester; glyceryl monooleate; lipase TLIM

中图分类号:TQ225.24

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2015)22-0001-05

doi:10.7506/spkx1002-6630-201522001

收稿日期:2015-03-21

基金项目:国家自然科学基金地区科学基金项目(31460427);南昌大学国家级创新创业训练计划项目(201310403012)

作者简介:黄楚楚(1993—),女,硕士研究生,研究方向为食品质量与安全。E-mail:huangchuchu93@163.com

*通信作者:朱雪梅(1982—),女,副教授,博士,研究方向为油脂化学、功能性食品。E-mail:zhuxuemei2005@hotmail.com