顾仁勇，杨万根
（吉首大学化学化工学院，湖南 吉首 416000）
摘 要：研制一种延长低盐湘西腊肉贮藏期限的复配防腐剂。采用响应面法，以抑菌率为响应值，考察柠檬酸、双乙酸钠和Nisin（乳酸链球菌素）用量对抑菌率的影响，优化复配防腐剂配方，并测定了复配防腐剂对低盐湘西腊肉的实际贮藏效果。结果表明：柠檬酸、双乙酸钠和Nisin对低盐湘西腊肉中的微生物有较强抑制作用；双乙酸钠和Nisin、柠檬酸和Nisin复配对抑菌均存在协同增效效应，且前者增效强于后者，但柠檬酸和双乙酸钠间无增效作用；复配防腐剂最优配方为柠檬酸用量1.20 g/kg、双乙酸钠用量0.97 g/kg、Nisin用量0.16 g/kg，以此配方处理低盐湘西腊肉抑菌率达95.98%，腊肉贮藏期限达160 d。
关键词：Nisin；双乙酸钠；柠檬酸；复配防腐剂；低盐湘西腊肉
湖南湘西是以土家族和苗族为主的少数民族聚居区，当地腊肉因使用独特的腌制香辛料和长时间的柴火熏制而独具特色。传统湘西腊肉含盐量约为6.0%～8.0% [1]，属于典型的高盐肉制品。为了适应市场的需求，湘西地区相关企业已经开展含盐量为3.5%～4.0%的低盐腊肉制品的研究和生产。降低腊肉含盐量，带来的最直接问题就是产品贮藏性的降低 [2-3]，使用防腐剂是解决这一问题的有效方法 [4]。由于各自抗菌谱及作用条件的限制，使用单一防腐剂防腐效果有限，多种防腐剂的复配可以起到扩充抗菌谱甚至协同增效的作用 [5-8]。目前有关腌腊肉制品防腐剂的研究主要集中在Nisin（乳酸链球菌素）、脱氢醋酸钠、双乙酸钠、乳酸钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、ε-聚赖氨酸等复配使用 [9-13]，而Nisin、双乙酸钠和柠檬酸的复配鲜见报道。引起低盐腊肉腐败的微生物主要是细菌及霉菌 [2]。Nisin能够抑制大部分G ＋菌及其芽孢的生长和繁殖，但对酵母菌和霉菌无效 [14-15]；双乙酸钠是霉菌和细菌的高效抑制剂，与Nisin复合可扩大抗菌谱，且两者之间具有协同增效效应 [16-18]；柠檬酸可以降低pH值，对腐败菌起到抑制作用，也可提高Nisin的作用效果 [19]；三者复配用于低盐湘西腊肉的贮藏具有良好的效果和实用性。
1.1 材料与试剂
低盐湘西腊肉为刚加工完成的猪后腿腊肉成品，平均含盐量为3.91%，菌落总数为4.43×10 4CFU/g，含水量为18.4%（喷涂防腐剂后），由湘西自治州榜爷食品有限品公司提供；Nisin 浙江银象生物工程有限公司；双乙酸钠 郑州新亚食品添加剂有限公司；柠檬酸 郑州永华化工公司；平板计数琼脂培养基 自制；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
LRH-150-B生化培养箱 广东省医疗器械厂；SJCJ-1FDQ超净工作台 苏州苏洁净化设备有限公司；YX-280B手提式灭菌锅 深圳鑫瑞达公司；DZ-600/4S真空包装机 诸城市德兴机械有限公司；AEL-200电子分析天平 湘仪天平仪器设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 肉样处理
取每块质量约1.0 kg的低盐腊肉成品，称质量。以肉块质量计，按照实验设计方案称取各防腐剂，加80 mL蒸馏水溶解为实验用复合防腐剂溶液。复合防腐剂溶液用已消毒的小型喷壶盛装，分4 次均匀喷涂于肉块表面，即每次喷完待肉块完全干燥后再喷第2次，确保防腐液不流失。完成后，肉块进行真空包装，以蒸馏水处理的肉块为对照。肉块常温（18～20 ℃）存放20 d，取肉样测菌落总数，重复3 次，结果取平均值，按下式计算抑菌率 [19]：
1.3.2 菌落总数测定
按照GB 4789.2—2010《食品微生物学检验：菌落总数测定》所述方法进行测定。
1.3.3 复合防腐剂配方优选响应面试验设计
以柠檬酸、Nisin和双乙酸钠进行复合防腐剂的配制。我国规定腌腊肉制品中Nisin和双乙酸钠最大使用量分别为0.5 g/kg和3.0 g/kg，柠檬酸不限量 [20]；同一功能食品添加剂混合使用时，各自用量占其最大使用量的比例之和不超过1.0 [20]。依据上述原则，设定Nisin和双乙酸钠用量的高水平分别为0.25 g/kg和1.5 g/kg，依据预实验结果设定柠檬酸高水平为2.0 g/kg，进行Box-Behnken试验设计，按1.3.1节所述方法进行处理，以抑菌率为响应值，优选复合防腐剂配方。试验因素与水平见表1。
表1 响应面试验因素水平表
Table1 Factors and levels used in response surface design g/kg
因素水平-101 A柠檬酸用量0.01.02.0 B双乙酸钠用量0.00.751.5 C Nisin用量0.00.1250.25
1.3.4 复合防腐剂贮藏效果测定
取刚加工完成的低盐腊肉成品，每块肉质量约1.0 kg。以每块肉质量计，按照优选出的复合防腐剂配方称取柠檬酸、双乙酸钠和Nisin，加蒸馏水80 mL溶解，分4 次均匀喷涂于肉块表面，完全干燥后真空包装，以未经防腐剂处理的肉块为对照。肉块常温（18～20 ℃）放置，每20 d取样测定菌落总数，评价复合防腐剂的实际贮藏效果。
2.1 响应面优化试验结果
2.1.1 Box-Behnken试验设计及结果
用Design-Expert 8.05软件进行试验设计和数据处理。按照试验方案处理肉样，测定菌落总数，计算抑菌率。对照组菌落总数为7.83×10 4CFU/g，处理组菌落总数及抑菌率响应面试验设计与结果见表2。
表2 响应面试验设计及结果
Table2 Response surface design arrangement and experimental results
试验号A柠檬酸用量B双乙酸钠用量C Nisin用量菌落总数/（CFU/g）抑菌率/% 1-1-102.06×10 473.61 2-10-11.96×10 474.95 3-1101.34×10 482.84 4-1019.82×10 387.46 5 1-101.60×10 479.57 6 1 1 07.60×10 390.29 7 1 0-11.13×10 485.53 11.03×10 486.87 9 0-111.04×10 486.72 1001-11.04×10 486.72 110118.99×10 388.51 120-1-12.54×10 467.58 130003.98×10 394.91 140005.33×10 393.13 150003.75×10 395.21 160004.45×10 394.32 170003.87×10 395.06 8 1 0
2.1.2 模型的建立及显著性检验
对表2中的试验数据进行多元回归拟合，得到以抑菌率（Y）为响应值的回归方程：Y=94.53＋2.92A＋5.11B＋4.35C＋0.37AB-2.79AC-4.34BC-5.81A 2-7.13B 2-5.01C 2。对回归方程进行方差分析，结果见表3。
由表3可见，所得二次方程模型极显著，失拟项不显著，表明回归方程具有显著意义。方程相关系数R
2=0.989 9，说明模型相关性良好；调整相关系数
=0.976 9，说明方程能解释97.69%的响应值变化，拟合程度良好；变异系数为1.44%，表明模型可信度较高；精密度值大于4.0视为合理，本试验精密度为27.304，表明其为一个适宜的信号
[21]；因此，可以用该方程推测试验结果。由方差分析结果可知，3个因素一次项A、B、C对响应值影响极显著；二次项A
2、B
2、C
2对响应值曲线效应影响极显著；交互项AC、BC对响应值曲面效应影响极显著，交互项AB对响应值曲面效应影响不显著，表明柠檬酸和Nisin、双乙酸钠和Nisin之间均存在明显的协同增效作用，而柠檬酸和双乙酸钠之间则无协同增效效应；由F值大小可推断3个因素对抑菌率影响的主次顺序为：B＞C＞A，即双乙酸钠用量＞Nisin用量＞柠檬酸用量；双乙酸钠用量和Nisin用量（BC）的的交互效应强于柠檬酸用量和Nisin用量（AC）。
表3 回归方程的方差分析
Table3 Anlysis of variance (ANOVA) for regression equation
注：*.差异显著（P＜0.05），**.差异极显著（P＜0.01）。
方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模型1 050.619116.7376.09＜0.000 1** A柠檬酸用量68.44168.4444.610.000 3** B双乙酸钠用量208.901208.90136.16＜0.000 1** C Nisin用量151.21151.2198.55＜0.000 1** AB0.5610.560.360.566 5 AC31.19131.1920.330.002 8** BC75.26175.2649.050.000 2** A 2142.341142.3492.78＜0.000 1** B 2214.311214.31139.68＜0.000 1** C 2105.651105.6568.86＜0.000 1**残差10.7471.53失拟项7.8532.623.630.123 0纯误差2.8940.72总离差1 061.3516 R 2=0.989 9，R 2 Adj=0.976 9，CV=1.44%，精密度=27.304
2.1.3 单因素效应分析
采用降维分析法进行单因素效应分析，即将回归方程中的两个因素固定在零水平，分别得到3 个因素的单因素模型如下：
Y A=94.53＋2.92A-5.81A 2
Y B=94.53＋5.11B-7.13B 2
Y C=94.53＋4.35C-5.01C 2
根据以上方程得到各因素的单因素轨迹见图1。
图1 单因素轨迹图
Fig.1 Perturbation of single factors
单因素轨迹图曲线表示各个因素改变对响应值的影响趋势，曲线弯曲程度越大表明该因素对响应值的影响越强烈，反之影响越弱 [22]。由图1可看出，随柠檬酸、双乙酸钠和Nisin用量的增加，抑菌率均呈先明显增大，随之增大平缓，最后缓慢降低的变化趋势，各因素在0～1水平间对抑菌率的影响均存在极大值。曲线的弯曲程度为B＞C＞A，表明双乙酸钠用量对抑菌率影响最大，Nisin影响次之，柠檬酸影响最小，与方差分析结果一致。
2.1.4 因素交互效应分析
由表3的方差分析结果知交互项AC和BC对抑菌率存在极显著影响，为考察其交互效应，采用降维分析得回归方程如下：
Y AC=94.53＋2.92A＋4.35C-2.79AC-5.81A 2-5.01C 2Y BC=94.53＋5.11B＋4.35C-4.34BC-7.13B 2-5.01C 2依据回归方程作交互因素的响应面和等高线图见图2。
图2 各因素交互作用的响应面和等高线图
Fig.2 Contour and response surface plots showing the interactive effects of three factors on bacteriostatic rate
响应面图坡度大表明因素对响应值影响大，等高线密集呈椭圆形表示两因素交互影响较大，而坡度平缓、等高线呈圆形则与之相反 [23]。图2a中，Nisin和柠檬酸交互效应等高线趋近椭圆，表明两者存在明显交互作用；当Nisin用量0.18 g/kg左右和柠檬酸用量1.2 g/kg左右时，抑菌率达最大值；在Nisin用量小于0.18 g/kg、柠檬酸用量小于1.2 g/kg的水平范围内，抑菌率随两者用量增加而增大，这是两种防腐剂协同作用所致；当Nisin用量大于0.18 g/kg、柠檬酸用量大于1.2 g/kg时，抑菌率随两者用量增加而逐步降低，其原因可能与柠檬酸用量增加导致酸度增大而降低了Nisin的抑菌效率有关，但具体机理尚待进一步研究。图2b中，Nisin与双乙酸钠交互效应等高线呈椭圆，表明两者交互作用明显；当Nisin用量0.16 g/kg左右和双乙酸钠用量1.0 g/kg左右时，抑菌率达最大值；在Nisin用量小于0.16 g/kg、双乙酸钠用量小于1.0 g/kg的水平范围内，抑菌率随两者用量增加而增大，这是两种防腐剂协同作用所致；当Nisin用量大于0.16 g/kg、柠檬酸用量大于1.0 g/kg时，抑菌率随两者用量增加而有所降低，其原因尚待进一步研究。
2.1.5 复合防腐剂配方优化及验证实验结果
利用模型优化的复合防腐剂最佳配方为柠檬酸用量1.20 g/kg、双乙酸钠用量0.97 g/kg、Nisin用量0.16 g/kg，预测抑菌率为96.10%。以此配方进行抑菌率测定验证实验，重复3 次，结果取平均值，得实际抑菌率为95.98%，与预测值接近，表明优化所得复合防腐剂配方可靠。
2.2 复合防腐剂贮藏效果
以优选的复合防腐剂配方配置防腐剂，按1.3.4节方法处理肉样进行贮藏实验，贮藏期间每20 d取样测定菌落总数，并以菌落总数常用对数值为纵坐标、贮藏时间为横坐标作图如图3所示。
图3 低盐湘西腊肉贮藏期间菌落总数变化
Fig.3 Changes in aerobic plate count of low-salt Xiangxi bacon during storage
由图3可见，经防腐剂剂处理的处理组肉样在贮藏20 d内菌落总数呈现明显下降趋势，之后缓慢增殖，100 d后增殖速率加快。与之相比，未经防腐剂处理的对照组肉样的菌落总数明显高于处理组，且对照组肉样微生物增殖速率也明显比处理组快。一般肉类菌落总数大于10 8CFU/g为腐败肉 [24-25]，以此为判断标准，对照组贮藏至第60天时菌落总数为2.08×10 6CFU/g，未腐败；至第80天时为1.21×10 8CFU/g，已腐败；因此，对照组肉样贮藏期限约为70 d。经复合防腐剂处理的肉样贮藏至第160天时菌落总数为7.31×10 7CFU/g，未腐败；至第180天时菌落总数为9.89×10 8CFU/g，已腐败；因此，处理组肉样贮藏期限可达160 d左右。
采用Box-Behnken设计，以抑菌率为响应值，优化柠檬酸、双乙酸钠和Nisin复合防腐剂贮藏低盐湘西腊肉的最优配方，方差分析显示所建模型回归效果极显著，拟合度良好，可用于最优防腐剂配方的预测；单因素效应及方差分析显示，双乙酸钠、Nisin和柠檬酸用量对抑菌率均存在极显著影响，各因素在所选用量水平范围内的抑菌率存在极大值，且3个因素的影响顺序为：双乙酸钠用量＞Nisin用量＞柠檬酸用量；双乙酸钠和Nisin、柠檬酸和Nisin之间对抑菌均存在协同增效效应，且前者增效效应强于后者，但柠檬酸和双乙酸钠间无协同增效作用；通过回归优化及验证实验所得复合防腐剂最优配方为柠檬酸用量1.20 g/kg、双乙酸钠用量0.97 g/kg、Nisin用量0.16 g/kg，以此配方处理低盐腊肉抑菌率为95.98%，结合真空包装产品常温条件下贮藏期限可达160 d，能满足实际生产的需要。
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Optimization of Mixed Preservative for Low-Salt Xiangxi Bacon by Response Surface Methodology
GU Renyong, YANG Wangen
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Jishou University, Jishou 416000, China)
Abstract：A mixed preservative consisting of citric acid, sodium diacetate and nisin was explored to prolong the storage time of low-salt Xiangxi bacon. Effects of the three preservatives individually and in combination on bacterial inhibition in Xiangxi bacon were investigated. Response surface methodology was used to optimize their combined concentrations using bacteriostatic rate as the response variable. The results showed that citric acid, sodium diacetate and nisin displayed strong inhibition effects on the growth of bacteria in low-salt Xiangxi bacon. Synergic effects existed between diacetate and nisin and between citric acid and nisin, and nisin had a stronger synergistic effect with diacetate than with citric acid, whereas no synergic effect was found between citric acid and sodium diacetate. The optimal combination of preservatives found was 1.20 g/kg citric acid, 0.97 g/kg sodium diacetate, and 0.16 g/kg nisin. The percentage inhibition of bacterial growth in Xiangxi bacon with the mixed preservative was 95.98% and the storage time was 160 days.
Key words：nisin; sodium diacetate; citric acid; mixed preservative; low-salt Xiangxi bacon
中图分类号：TS202.3；TS205.2
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）22-0046-05
doi：10.7506/spkx1002-6630-201522008
收稿日期：2015-03-20
基金项目：湖南省科技厅2015年重点研发计划项目（2015NK3020）
作者简介：顾仁勇（1972—），男，教授，硕士，研究方向为食品加工与保藏。E-mail：gry8565398@163.com