GC-O-MS法分析野生刺梨汁游离态和O-糖苷键合态香气活性物质

（1.湖北民族学院生物科学与技术学院，生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北恩施 445000；2.华中农业大学食品科学技术学院，湖北武汉 430070）

摘要：采用顶空-固相微萃取法提取刺梨汁中游离态挥发性物质和酶法释放刺梨汁中O-糖苷键合态挥发性物质，结合气相色谱-嗅觉探测-质谱技术，对野生种刺梨汁中游离态和O-糖苷键合态香气活性物质进行分析。结果表明，刺梨汁中游离态和O-糖苷键合态香气活性物质分别有23 种和17 种。构成刺梨汁游离态香气活性物质主要有丁酸乙酯（青草）、正己醇（酒香）、正辛醇（甜香）、异戊酸乙酯（菠萝香）、叶醇（茶香）、苯乙烯（果香）、月桂烯（甜香脂）和芳樟醇（柠檬香）等。而构成刺梨汁O-糖苷键合态香气活性物质有3-羟基己酸乙酯（水果香）、2-庚醇（柠檬香）、3-羟基丁酸乙酯（果香）、叶醇（茶香）、正辛醇（甜香）、苯乙醇（玫瑰香）和2’-羟基-4’,5’-二甲基苯乙酮（花香、甜香）等。叶醇、正辛醇和辛酸为刺梨汁中以游离态和O-糖苷键合态共存的香气活性成分。刺梨中游离态和O-糖苷键合态香气活性物质均以果香/甜香味为主，但O-糖苷键合态香气活性物质的香气总强度较游离态的弱。

关键词：刺梨；气相色谱-嗅觉探测-质谱；香气活性物质；游离态；O-糖苷键合态

一般地，香味分析的内容包括总体香味的评价和有贡献的香味活性成分的鉴定。现在食品中香气物质主要采用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）联用仪进行分析。但GC-MS的检测限为10 -12，而人鼻对香味的检测下限可达10 -19[1]。GC-MS无法确定复杂的挥发性物质中哪些物质对食品香气品质起主要贡献作用，且有些香气物质含量很低，GC-MS无法检测出来，但这些含量很低的香气物质对食品的香气品质有可能起很大的贡献作用。气相色谱-嗅闻（GC-olfactory，GC-O）技术是分析和鉴定有贡献的关键香味成分的有效手段之一，最早是由Fuller等学者于1964年提出的 [2]。GC-O技术是利用人的鼻子嗅闻经GC柱分离后的各个馏分，以检测供试样品气味组成的方法。目前利用GC-O技术判断单一气味组分感官贡献的方法主要有3 种 [3]，即时间-强度法、检测频率法和稀释法。

刺梨（Rosa roxburghii Tratt）属蔷薇科落叶植物，别名山刺梨、野石榴（陕西）、赛哇（西藏）、蜂糖果（鄂西）等 [4-5]，富含VC [6]、β-谷甾醇 [7]、超氧化物歧化酶 [8]等生理活性物质及38 种游离态香气物质和38 种键合态香气物质 [9]。这些香气物质具有抗氧化活性 [10]和增香的作用 [11]。通过GC-MS检出的挥发性物质中仅有一小部分具有香气活性 [1]。GC-O-MS技术是将质谱的分离能力和人鼻敏感的嗅觉相结合，通过对香气活性物质的气味和强度描述，来鉴定香味活性物质的一种最有效手段 [12]。Guillot等 [13]采用GC-O-MS分析法中的时间-强度分析法分析和评价了6 种杏子的香气成分，认为GC-MS检测出的23 种化合物中，仅有柠檬烯、乙酸己酯、乙酸乙酯等10 种物质是有香气活性的。Arena等 [14]利用GC-O-MS分析法中的频率检测法分析和评价了4 种橙汁的香气活性物质，认为这4 种橙汁中的香气活性物质由果香、草香、花香、辛香和橘香这5 类香气组成。Hayata等 [15]采用GCO-MS法中的稀释分析法对香瓜的风味物质进行分析和评价，认为香瓜中含有草味或黄瓜味、青味、甜味和果香味等香气活性物质。

本实验采用顶空-固相微萃取（head-space solid phase micro-extraction，HS-SPME）法提取刺梨汁中游离态挥发性物质和酶法释放刺梨汁中O-糖苷键合态挥发性物质，结合GC-O-MS技术，对野生种刺梨汁中游离态和O-糖苷键合态香气活性物质进行分析，确定野生刺梨汁中游离态和O-糖苷键合态特征香气活性物质，旨为刺梨果的精深加工和品质控制提供参考。

1 材料与方法

刺梨，产于湖北省恩施土家族苗族自治州宣恩县珠山镇海拔600 m左右处野生种，采收时间为10月上旬。选择果实完整，生理成熟度一致的新鲜果实为供试材料。

C 8～C 22正构烷烃、β-D-葡萄糖苷酶（色谱纯）美国Sigma公司；环己酮（色谱纯）美国Fluka公司；AmberliteXAD-2树脂美国Supelco公司；磷酸氢二钠、甲醇、乙酸乙酯、正戊烷、氯化钠、柠檬酸（分析纯）国药集团化学试剂有限公司；无水Na 2SO 4（分析纯）天津科密欧化学试剂有限公司；乙醚（分析纯）上海马陆制药厂。

6890N/5975MSD GC-MS联用仪美国Agilent公司；ODP2嗅闻装置德国Gerstel公司；SPME装置（50/30 μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/ CAR/PDMS）萃取头、手动SPME进样器、20 mL顶空钳口瓶）美国Supelco公司；R-210型旋转蒸发器瑞士Büchi公司；SL280A型榨汁机苏泊尔炊具有限公司；TDL-5-A型离心机上海安亭科学仪器厂；DF-101S恒温加热磁力搅拌器长城科工贸有限公司。

新鲜刺梨果经挑选、洗净、切碎、榨汁，汁液过200 目滤布。称取3.6 g NaCl放于20 mL顶空瓶中（以促进挥发性物质的挥发），然后取10 mL刺梨汁液置于瓶中，再加入50 μL环己酮内标物，用聚四氟乙烯/硅橡胶隔垫立即密封，使用DVB/CAR/PDMS 50/30 μm复合萃取头萃取，在磁力搅拌器上40 ℃条件下平衡15 min，然后插入已活化好的SPME萃取头（270 ℃活化30 min）进行恒温顶空吸附30 min，缩回纤维头，随即插入GC进样口解吸5 min，进行GC-O-MS分析。

称取50 g Amberlite XAD-2树脂，置于索氏提取器中，用甲醇、乙酸乙酯和戊烷依次回流处理10 h后浸渍于甲醇中，以甲醇为溶剂进行湿法装柱，然后用500 mL蒸馏水以10 mL/min流速洗柱。将新鲜刺梨果原汁以3 mL/min的流速流经洗涤过的Amberlite XAD-2树脂柱（Φ 2.2 cm×50 cm），然后用300 mL的去离子水洗柱去除水溶性的酸、糖等物质。接着用300 mL乙醚-戊烷（1∶1，V/V）溶液洗柱去除游离态挥发性物质后，将吸附在树脂上的糖苷类物质用300 mL甲醇溶液洗脱，收集甲醇洗脱液，用旋转蒸发器在水浴温度32 ℃条件下浓缩至干，再用30 mL 0.06 mol/L柠檬酸-Na 2HPO 4缓冲液（pH 5.0）转溶后，用80 mL乙醚-戊烷溶液分3 次萃取除去可能残留的游离态挥发性物质，收集的水相液置于50 mL顶空瓶中，加入Almonds β-D-葡萄糖苷酶（2.18 U/mg）138 mg [9]后立即用聚四氟乙烯/硅橡胶隔垫密封，在40 ℃酶解48 h，启开后用80 mL乙醚-戊烷混合液分3 次萃取酶解液，有机相用无水硫酸钠干燥，N 2吹扫浓缩至0.5 mL，取1 μL供GC-O-MS分析。

GC条件：HP-5毛细管柱（30 m×320 μm，0.25 μm）；载气为氦气；进样口温度250 ℃；升温程序：起始温度40 ℃，保持3 min，以4 ℃/min升温至220 ℃，再以10 ℃/min升温至250 ℃，保持5 min。用微量进样器进样，进样量分流比为1∶20，溶剂延迟时间为6 min。

MS条件：接口温度280 ℃；四极杆温度150 ℃；离子源温度230 ℃；离子化方式：电子电离；电子能量70 eV；质量扫描范围45～550 u。

挥发性成分在相同的色谱条件下分离分析后，通过标准化合物的质谱，线性保留指数（retention index，RI）和气味特征来鉴定；无标准化合物时，借助质谱检索，结合文献报道的RI [14,17-19]和气味特征来鉴定。

正式嗅觉分析前，选择2 名女性和1 名男性进行单体嗅闻训练，以增强和丰富嗅闻员的嗅闻经验。色谱柱香气物质以1∶2的分流比分别进入MS检测器和ODP2嗅闻装置，ODP2装置的加热温度为180 ℃，尾吹气流量为60 mL/min。嗅闻时应打开加湿器以对尾吹气加湿，避免干燥气体对鼻黏膜的伤害。

本实验采用GC-O分析法中的时间-强度分析法，强度设置采用4 分计分法，即最强强度为4 分，中等强度为3 分，较弱强度为2 分，很弱强度为1 分。每位嗅闻员通过ODP2嗅闻装置配套的可控制手柄记录香气的强度和嗅闻时间，并描述气味。对同一样品作3 次平行测定，共9 份数据用于统计分析，每位嗅闻员的3 次数据中有2 次重复时才被记录有效。

2 结果与分析

刺梨汁采用HS-SPME法萃取游离态挥发性组分，并通过Amberlite XAD-2型树脂吸附，β-葡萄糖苷酶酶解释放O-糖苷键合态挥发性组分，结合GC-MS联用仪和GC-O技术分离分析，所检出的游离态和O-糖苷键合态香气活性成分及其气味强度见表1，检出的刺梨汁中游离态和O-糖苷键合态香气活性成分数量统计见表2。

表1 刺梨汁中游离态和O-糖苷键合态香气活性物质
Table1 Free an d O-glycosidically bound aroma active compounds in R. roxburghii juice

注：MS.通过质谱鉴定；RIL.保留指数的文献值；Odor.通过气味进行鉴定；—.未检出。

序号RI化合物名称化学式相对分子质量O-糖苷键合态组分1＜800未知MS、RIL、Odor果香2—2805丁酸乙酯 ethyl butyrateC 6H 12O 2116.16 MS、RIL、Odor青草4—3854异戊酸乙酯 ethyl isovalerateC 7H 14O 2130.18 MS、RIL、Odor菠萝3—4864叶醇 leaf alcoholC 6H 12O100.16 MS、RIL、Odor茶叶33 58733-甲基戊酸 3-methylvaleric acidC 6H 12O 2116.16 MS、RIL、Odor草药—1 6878正己醇 hexyl alcoholC 6H 14O102.17 MS、RIL、Odor酒香4—7897苯乙烯 styreneC 8H 8104.15 MS、RIL、Odor果香3—89062-庚醇 2-heptanolC 7H 16O116.20 MS、RIL、Odor柠檬—3 99383-羟基丁酸乙酯 ethyl 3-hydroxybutyrateC 6H 12O 3132.16 MS、RIL、Odor果香、葡萄—3 10986苯酚 phenolC 6H 6O94.11MS、RIL、Odor浆糊—1 11993月桂烯 β-myrceneC 10H 16136.23 MS、RIL、Odor甜香脂3—121 007正辛醛 octanalC 8H 16O128.21 MS、RIL、Odor茉莉香2—131 035（＋）-柠檬烯 (+)-dipenteneC 10H 16136.23 MS、RIL、Odor柠檬4—141 037苯甲醇 benzyl alcoholC 7H 8O108.14 MS、RIL、Odor清香—2 151 050罗勒烯 β-ocimeneC 10H 16136.23 MS、RIL、Odor果香2—161 061松油烯 γ-terpineneC 10H 16136.23 MS、RIL、Odor青草、茄香3—171 083正辛醇 capryl alcoholC 8H 18O130.23 MS、RIL、Odor甜香43 181 108芳樟醇 linaloolC 10H 18O154.25 MS、RIL、Odor柠檬3—191 114四氢-4-甲基-2-（2-甲基-1-丙烯基）-2H-吡喃tetrahydro-4-methyl-2-(2-methyl-1-propenyl)-2H-pyranC 10H 18O154.25 MS、RIL、Odor甜香2—201 122未知MS、RIL、Odor清酒—3 211 1313-羟基己酸乙酯 ethyl 3-hydroxyhexanoateC 6H 12O 3132.16 MS、RIL、Odor水果—4 221 147苯乙醇 phenethyl alcoholC 8H 10O122.16 MS、RIL、Odor玫瑰—3 231 1823,7-二甲基-1-辛醇 3,7-dimethyl-1-octanolC 10H 22O158.28 MS、RIL、Odor玫瑰3—241 189丁酸-3-己烯酯 3-hexenyl butyrateC 10H 18O 2170.25 MS、RIL、Odor果香2—251 189辛酸 octanoic acidC 8H 16O 2144.21 MS、RIL、Odor水果22 261 199辛酸乙酯 ethyl caprylateC 10H 20O 2172.26 MS、RIL、Odor白兰地酒香2—271 259橙花醇 nerolC 10H 18O154.25 MS、RIL、Odor玫瑰—2 281 317对乙烯基愈疮木酚 2-methoxy-4-vinylphenolC 9H 10O 2150.17MS、Odor熟花生—4 291 360丁香酚 eugenolC 10H 12O 2164.20 MS、RIL、Odor甜香、花香—2 301 380氨茴酸甲酯 anthranilic acid methyl esterC 8H 9NO 2151.16MS、Odor果香、甜香3—311 4013-羟基-4-甲氧基苯甲醛 isovanillinC 8H 8O 4168.15 MS、RIL、Odor甜香—2 321 414甲基丁香酚 methyl eugenolC 11H 14O 2178.23 MS、RIL、Odor茴香2—331 425石竹烯 β-caryophylleneC 15H 24204.35 MS、RIL、Odor丁香1—341 457肉桂酸 cinnamic acidC 9H 8O 2148.16 MS、RIL、Odor桂皮—2 351 470B-苯基环氧丁酸乙酯ethyl 3-methyl-3-phenylglycidateC 12H 14O 3206.24MS、Odor草莓2—鉴定方式气味描述气味强度游离态组分361 7292’-羟基-4’,5’-二甲基苯乙酮2’-hydroxy-4’,5’-dimethylacetophenoneC 10H 12O 2164.20 MS、RIL、Odor花香、甜香—3 371 787苯甲酸苄酯 benzyl benzoateC 14H 12O 2212.24 MS、RIL、Odor杏仁2—

由表1和表2可知，检测到刺梨汁中游离态香气活性物质为23 种，包括8 种酯类物质、4 种醇类物质、6 种萜烯烃类物质、1 种酚类物质等。其中，香气强度最强的香气活性物质有丁酸乙酯（青草）、正己醇（酒香）、（＋）-柠檬烯（柠檬香）和正辛醇（甜香）；其次是异戊酸乙酯（菠萝味）、叶醇（茶香）、苯乙烯（果香）、月桂烯（甜香脂）、松油烯（青草、茄香）、芳樟醇（柠檬香）、3,7-二甲基-1-辛醇（玫瑰香）等；再次是正辛醛（茉莉香）、辛酸乙酯（白兰地酒香）、甲基丁香酚（茴香）、B-苯基环氧丁酸乙酯（草莓）、苯甲酸苄酯（杏仁）、四氢-4-甲基-2-（2-甲基-1-丙烯基）-2H-吡喃（甜香）和具有果香味的罗勒烯、丁酸-3-己烯酯、辛酸和未知物（序号1）；香气强度较弱的香气活性物质有石竹烯（丁香味）。

Ulrich等 [21]研究认为蔷薇科水果成熟草莓果实中特征香气成分含有4-甲氧基-2,5-二甲基-3（2H）-呋喃酮，而刺梨汁中游离态香气活性物质组成中不含有酮类物质，导致水果中特征香气成分差异的主要原因可能与品种、成熟度及产区因素等有关 [22]。辛酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯和正己酸乙酯等酯类物质是草莓、苹果和桃类等蔷薇科水果中重要的特征香气物质 [23]，而检出的刺梨汁游离态香气活性酯类物质有辛酸乙酯、丁酸乙酯、异戊酸乙酯等，这些物质常以脂肪酸为前体，通过亚油酸、亚麻酸和β-氧化途径在生物体内合成 [24]。

检测到刺梨汁中O-糖苷键合态香气活性物质有17 种，在数量上约占刺梨汁中38 种O-糖苷键合态香气物质 [9]的一半，包括醇类5 种、酸类、羟基酯类和酚类各3 种、羟基醛、羟基酮和未知物各1 种。其中，香气强度最强的是4-乙烯基-2-甲氧基苯酚（熟花生香）和3-羟基己酸乙酯（水果香）；其次是2-庚醇（柠檬香）、3-羟基丁酸乙酯（果香）、叶醇（茶香）、正辛醇（甜香）、苯乙醇（玫瑰香）、2’-羟基-4’,5’-二甲基苯乙酮（花香、甜香）和未知物（RI=1 122）；再次是苯甲醇（清香）、辛酸（果香）、橙花醇（玫瑰香）和具有甜香的丁香酚、3-羟基-4-甲氧基苯甲醛等；香气强度较弱的香气活性物质有3-甲基戊酸（草药香）和苯酚（浆糊香）。刺梨汁游离态和O-糖苷键合态香气组分中都检测到的香气活性成分有3 种，包括叶醇、正辛醇和辛酸。

2.2 刺梨汁中游离态和O-糖苷键合态香气活性物质的气味轮廓分析

将通过GC-O技术嗅闻出的各种气味分别归属为7 类，即花香、果香/甜香、脂肪/橡胶、梨香、松油、木头/树叶和药草/青味。计算归属这7 大类的香气化合物的香气总强度，得到刺梨汁中游离态和O-糖苷键合态香气活性物质的气味轮廓图（图1）。

由图1可看出，刺梨汁中游离态和O-糖苷键合态香气活性物质有气味差异。其游离态香气活性物质以果香/甜香为主，各香型的相对强度依次为果香/甜香＞梨香＞花香味＞药草/青味＞木头/树叶＞松油味＞脂肪/橡胶味。其O-糖苷键合态香气活性物质虽然也以果香/甜香味为主，花香次之，但是其整体香气活性物质的强度较游离态的弱，这说明刺梨汁在酶解过程中所释放的O-糖苷键合态的香气活性物质能增强刺梨汁的整体香气，但它不能代表刺梨原汁的典型风味。这与孙爱东 [25]、范刚 [26]等的研究结果一致。

3 结论

通过HS-SPME萃取游离态香气物质和β-葡萄糖苷酶酶解释放O-糖苷键合态香气物质，并结合GC-O-MS检测方法分析发现，刺梨汁中游离态和O-糖苷键合态香气活性物质分别有23 种和17 种。丁酸乙酯（青草）、正己醇（酒香）、正辛醇（甜香）、异戊酸乙酯（菠萝味）、叶醇（茶香）、苯乙烯（果香）、月桂烯（甜香脂）、松油烯（青草、茄香）、芳樟醇（柠檬香）、3,7-二甲基-1-辛醇（玫瑰香）、正辛醛（茉莉香）、辛酸乙酯（白兰地酒香）、甲基丁香酚（茴香）、B-苯基环氧丁酸乙酯（草莓）、苯甲酸苄酯（杏仁）、四氢-4-甲基-2-（2-甲基-1-丙烯基）-2H-吡喃（甜香）、罗勒烯、丁酸-3-己烯酯、辛酸、石竹烯（丁香味）和未知物（序号1，果香）等23 种香气物质构成了刺梨汁游离态香气的特征香气。

构成刺梨汁O-糖苷键合态香气的特征香气物质主要有4-乙烯基-2-甲氧基苯酚（熟花生香）、3-羟基己酸乙酯（水果香）、2-庚醇（柠檬香）、3-羟基丁酸乙酯（果香）、叶醇（茶香）、正辛醇（甜香）、苯乙醇（玫瑰香）、2’-羟基-4’,5’-二甲基苯乙酮（花香、甜香）、苯甲醇（清香）、辛酸（果香）、橙花醇（玫瑰香）、丁香酚（甜香）、3-羟基-4-甲氧基苯甲醛（甜香）和未知物（RI=1 122）等17 种。

气味轮廓分析发现刺梨汁游离态和O-糖苷键合态香气均以果香/甜香味为主，酶解能增强刺梨原汁的风味，但其释放出的键合态香气物质不能代表刺梨原汁的典型风味。

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Analysis of Free and O-Glycosidically Bound Aroma Active Compounds of Wild Rosa roxburghii Juice by GC-O-MS

ZHOU Zhi 1, MA Qiong 1, ZHU Yuchang 1, CHENG Chao 1, PAN Siyi 2
(1. Key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization of Hubei Province, College of Biological Science and Technology, Hubei University for Nationalities, Enshi 445000, China; 2. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

Abstract：The free volatile compounds of wild Rosa roxburghii juice were extracted by head-space solid phase microextraction (HS-SPME) and the O-glycosidically bound volatile compounds were released by enzymatic hydrolysis for analysis by gas chromatography-olfactometry (GC-O) coupled with mass spectrometry (MS). The results showed that 23 free aroma active compounds and 17 O-glycosidically bound aroma active compounds were identified in R. roxburghii juice. The major free aroma active compounds were ethyl butyrate (grassy aroma), hexyl alcohol (winy aroma), capryl alcohol (sweet aroma), ethyl isovalerate (pineapple aroma), leaf alcohol (tea aroma), styrene (fruity aroma), β-myrcene (sweet balsam aroma), linalool (lemon aroma), etc. The major O-glycosidically bound aroma active compounds were ethyl 3-hydroxyhexanoate (fruity aroma), ethyl 3-hydroxybutyrate (fruity or grape aroma), 2-heptanol (lemon aroma), leaf alcohol (tea aroma), capryl alcohol (sweet aroma), phenylethyl alcohol (rose aroma) and 2’-hydroxy-4’,5’-dimethylacetophenone (fl ower or sweet aroma) etc. Leaf alcohol, capryl alcohol and octanoic acid were the active aroma compounds existing in both free and O-glycosidically- states in wild R. roxburghii juice. Both free volatile compounds and O-glycosidically bound volatile compounds were mainly responsible for fruity/sweet fragrance. But, the overall aroma strength of the latter was relatively weaker than that of the former.

Key words：Rosa roxburghii Tratt; gas chromatograph-olfactory-mass spectrometry (GC-O-MS); aroma active compounds; free state; O-glycosidically bound state

基金项目：国家自然科学基金地区科学基金项目（31460442）；生物资源保护与利用湖北省重点实验室开放基金项目（PKLHB1307）；湖北省教育厅自然科学重点项目（D20122902）；湖北民族学院博士基金项目（MY2012B）；湖北省林学省级重点（特色）学科项目

作者简介：周志（1974—），男，教授，博士，研究方向为天然产物化学与特产资源开发。E-mail：zhouzhi77716@163.com

GC-O-MS法分析野生刺梨汁游离态和O-糖苷键合态香气活性物质

1 材料与方法

2 结果与分析

3 结 论

3 结论