表1 正交试验因素水平表
Table1 Coded levels for factors used in orthogonal array design
水平因素A固相萃取整体捕集剂B样品量/gC萃取时间/min 1 RGC18-TD3.040 2 RCC184. 060 3 RSC185.080
高韶婷，宋 雪，陈 乐，张晶晶*，刘 源
（上海海洋大学食品学院，上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306）
摘 要：采用固相萃取整体捕集剂提取，热脱附结合气相色谱-质谱分析金华火腿样品中的挥发性化合物，并对其分析条件进行优化。通过设计正交试验，比较分析不同因素水平条件下的结果，最终确定适宜分析条件为，选择固相萃取整体捕集剂（MonoTrap TMRCC18）、萃取样品量5 g、萃取温度60 ℃、萃取时间60 min。对金华火腿的风味物质分析得到31 种成分，分别为烷烃、醛类、酮类、醇类、酸类、酯类和含硫含氮等化合物。
关键词：金华火腿；挥发性风味物质；固相萃取整体捕集剂；气相色谱-质谱联用
我国是干腌火腿生产大国，年产量逾400万 只 [1]。金华火腿属名、特、优干腌火腿，是我国干腌火腿的代表，其色香味形俱全且营养丰富，消费潜力巨大。香味是评价肉制品食用品质的重要因素之一，也是评价金华火腿品质及等级的重要指标。火腿行业中现行的香味评价方法主要依赖专业感官人员的“三签法”，主观性较强、耗时且重复性较差。因此，迫切需要开发一种快速、有效的通过风味快速鉴别火腿品质及等级的方法。国内一些专家学者对不同品种火腿及加工过程中的挥发性成分进行了报道，但其前处理方法多集中在同时蒸馏萃取（simultaneous dist illation extraction，SDE）、固相微萃取（solid phase m icroextraction，SPME）法和吹扫捕集等 [1-5]传统方法上。SDE法由于提取温度较高，提取时间长，容易造成某些易挥发性风味成分的流失；而SPME法由于受涂层材料的限制而造成挥发物的吸附效果有限。基于上述原因，本研究采用了一种新型的吸附介质——MonoTrap对金华火腿的挥发性成分进行研究。
根据吸附性质的不同可将吸附剂分为无机吸附剂和有机多孔聚合物吸附剂2 大类 [6]。前者包括活性炭、石墨化碳黑以及碳分子筛等，而后者有Tenax、PoraPak、Chromosorb以及Amberlite等。固相萃取整体捕集剂是集硅胶、活性炭和十八烷基等材料为一体的高交联性新型吸附剂，可用于极性和非极性以及高沸点和低沸点化合物的提取，可将这种吸附模式称之为整体材料式吸附萃取（monolithic material sorptive extraction，MMSE） [7]，其对气体样品的吸附效率较高。日本GL科学实验室已经将MMSE法应用到植物、咖啡、芝麻油、乳制品的香气成分的提取 [8]。本实验创新性地利用固相萃取整体捕集剂作为挥发性物质的吸附材料，并结合二级热脱附和气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）法对金华火腿挥发性成分进行研究分析，以期能为今后进一步探讨干腌火腿挥发性风味形成机理提供一定理论支持。
1.1 材料与仪器
3 a陈低盐系列金华火腿 浙江金华金字火腿有限公司；C 5～C 30正构烷烃、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛 美国Sigma公司。
固相萃取整体吸附剂（配MT HOLDER） 日本岛津-GL Sciences公司；7890-5975 GC-MS仪 美国Agilent公司；多功能自动进样器（multipupose sampler，MPS）、热脱附系统（thermal desorption seystem，TDS）、PTV冷却型进样口（cooled injection system，CIS） 德国Gerstel公司；超低温冰箱 艾本德（上海）国际贸易有限公司；DFS101集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司；JY-5002型电子天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；20 mL透明顶空萃取瓶 上海安谱科学仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 样品前处理
取金华火腿股二头肌部位，剔除腿骨及肥膘，将处理好的样品真空包装，置于-80 ℃冰箱贮藏，待分析时取出。
分析前将样品从-80 ℃冰箱中取出，放入4 ℃冰箱隔夜解冻，使火腿能够解冻完全。样品在剔除表层肌肉后，置放在洁净的操作台上切成1 cm 3小块，混合均匀。准确称量后，置于20 mL透明螺旋口顶空瓶中，旋紧瓶盖，放4 ℃冰箱备用。
1.2.2 萃取条件的正交试验设计
MMSE是一种较为新型的样品前处理方法，目前国内对其使用尚且较少。为了确定最佳的萃取和分析条件，参照顾赛麒等 [9]萃取中华绒螯蟹挥发性风味成分的单因素试验方法以及李鑫等 [10]分析金华火腿风味物质的条件优化试验方法并稍作修改，在前期预实验的基础上利用正交试验设计的方法，参照L 9（3 4）正交试验水平表，综合考虑固相萃取整体捕集剂种类A、萃取样品量B、萃取时间C对萃取条件的影响，设计完成正交试验的因素水平表，具体参数如表1所示。
表1 正交试验因素水平表
Table1 Coded levels for factors used in orthogonal array design
水平因素A固相萃取整体捕集剂B样品量/gC萃取时间/min 1 RGC18-TD3.040 2 RCC184. 060 3 RSC185.080
固相萃取整体捕集剂使用前需在TDS中充分老化。老化温度280 ℃，载气体积流量1.2 mL/min，老化时间3 h。
1.2.3 萃取方法
将老化好的吸附捕集剂如MonoTrap TMRCC18（下文以RCC18表示）用固定装置相连后，放入顶空瓶中，使RCC18始终位于样品上方。将顶空瓶置于60 ℃水浴中，使RCC18对火腿中挥发性成分萃取完全。待萃取完毕后，将全部RCC18与固定装置分离，迅速装入热脱附管，由前处理平台将全部RCC18转移至热脱附器中进行热脱附。
1.2.4 GC-MS条件
GC条件：DB-5MS弹性毛细管柱（60 m×0.32 mm， 1 μm），不分流模式。升温程序：起始温度40 ℃，以4 ℃/min升至90 ℃，保留3 min；再以2 ℃/min升至160 ℃，保留3 min；然后以5 ℃/min升至240 ℃；载气为99.999%高纯氦气；流量1.2 mL/min；汽化室温度250 ℃。
MS条件：电子电离源；电子能量70 eV；灯丝发射电流200 μA；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；检测器温度250 ℃；GC-MS接口温度280 ℃；检测器电压1.2 kV；质量扫描范围33～550 u。
TDS条件：不分流模式，起始温度50 ℃，以180 ℃/min升至240 ℃，保留时间6 min。传输线温度280 ℃。
CIS条件：液氮制冷，起始温度-50 ℃，平衡30 s，以12 ℃/s升至270 ℃，保留时间15 min。
1.2.5 定性与定量
定性：将测得各挥发物的谱图与NIST 2008和Wiley 9谱库中标准物质的谱图进行比对，仅报道正反匹配度均大于800（最大值为1 000）的结果；同时计算各挥发物的保留指数（retention index，RI）并与文献中的RI进行比对，RI的计算公式如下式：
式中：Rt （x）、Rt （n）及Rt （n＋1）分别为待测挥发性成分、含n个碳原子正构烷烃及n＋1个碳原子正构烷烃的保留时间/min。
定量：由面积归一化法求得各挥发性成分的相对含量 [11]。
1.3 数据处理
采用Microsoft Excel 2010以峰面积归一化法，计算各挥发性化合物的相对含量，结果输出形式以±s计。
2.1 正交试验结果
表2 正交试验方案与结果
Table2 Orthogonal array experimental design and results
试验号A固相萃取整体捕集剂B样品量/g空列C萃取时间/min风味物质总数特征性物质峰面积总峰面积11（RGC18-TD）1（3）11（40）232.94×10 74.45×10 72 12（4）22（60）203.71×10 74.85×10 73 13（5）33（80）253.62×10 75.98×10 742（RCC18）123281.13×10 81.62×10 85 2 231241.24×10 81.66×10 86 2 312311.36×10 81.78×10 873（RSC18）132279.81×10 71.41×10 88 213311.29×10 81.74×10 89 3 321301.04×10 81.35×10 83 K 168787877 K 283757878 K 388868384极差201157
通过比较表2中不同试验条件结果可知，固相萃取整体捕集剂种类、样品量、萃取时间均对物质的鉴定结果有影响。比较极差后发现，试验条件选取对结果的影响从大到小依次是：固相萃取整体捕集剂（A）＞样品量（B）＞萃取时间（C）。综合考虑鉴定得到的挥发性化合物的数目和物质的出峰面积，可以得到最优的因素水平组合为：固相萃取整体捕集剂RCC18、样品量5.0 g， 60 ℃条件下恒温萃取60 min。
2.2 金华火腿风味物质成分及来源分析
运用最优的MMSE-GC-MS条件对60 ℃条件下萃取的金华火腿样挥发性成分进行检测，所得结果见表3。本次实验共鉴定得到31 种化合物：其中烷烃4 种、醛类8 种、酮类6 种、醇类2 种、酸类6 种，酯类1 种、芳香类化合物3 种，其他化合物1 种。
田怀香等 [12]通过GC-嗅闻法鉴定得到的22 种具有感官特性的风味物质中，有14 种在本实验中检出，其中甲基硫醇、丙酮、己醛等对金华火腿整体气味贡献较大的化合物，在本实验中均被检出。唐静等 [13]参考传统金华火腿制备方法制备火腿样品，通过气味活度法鉴定得到11 种主体挥发性成分，其中3-甲基丁醛、辛醛、壬醛、庚醛、己醛等也均在本实验中检出。
醇类物质大多数来源于脂质氧化分解，因为原料肉中醇类物质含量不高 [14]，而腌制后的含量显著增加。醇类物质中，乙醇的相对含量为最高，这可能与金华火腿加工过程微生物作用有关，另一方面，腌制时减少腌制用盐量， 也会促进醇类化合物的形成 [15]。饱和醇的阈值一般较高，通常对干腌火腿的主体风味贡献很小。
醛类物质相对含量高且阈值低，相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）大，对火腿风味贡献较大 [16]，是火腿风味成分中最重要的一类化合物 [17]。其中，辛醛、壬醛和庚醛是油酸的氧化产物 [18]，能够带来高度愉快的甜味或果香风味特征。己醛是亚油酸的氧化产物 [19]，其气味特征与含量有关，在含量较低时，呈现清香的青草气味，含量高时，产生强烈的脂肪酸败味 [20]。3-甲基-丁醛在新工艺火腿中的ROAV最高，可被认为是异亮氨酸发生Strecker降解时形成的产物，对风味有着重要贡献。它的挥发性较强，含量低于10 mg/kg时呈桃子香味，高度稀释时有似苹果香气、甜润巧克力、可可样香，是鲜肉所没有的成分 [21-23]。
表3 金华火腿风味物质成分（n==33）
Table3 Flavor compounds identifi ed in Jinhua ham (n == 33))
注：鉴别方式中A为使用标准品，B为与文献[1]、[4]、[5]一致，C为与NIST Library和Wiley Library（2008）标准质谱谱库比对一致。
编号RI化合物名称气味描述鉴别方式相对含量/% 1＜500methanethiol 甲硫醇熟卷心菜 [3]C、B0.02±0.01 2＜500ethanol 乙醇甜的 [4]C0.24±0.04 3＜500acetone 丙酮酸臭 [5]C0.06±0.01 45562-methyl-propanal 2-甲基-丙醛烤面包味、水果味、刺激味 [3]C、B0.01±0.01 5581acetic acid 乙酸醋、酸的 [6]C0.07±0.02 65952-butanone 2-丁酮似乙醚气味 [7]C0.01±0.01 7 600hexane 己烷辛辣、烷样 [4]A0.02±0.00 86533-methyl- butanal 3-甲基丁醛烤肉味、清香 [8]C、B0.10±0.00 96632-methyl- butanal 2-甲基丁醛焦糖 [3]C、B0.03±0.02 10665benzene 苯C0.09±0.03 117312-methyl-propanoic acid 2-甲基丙酸酸的 [6]C0.02±0.01 12774toluene 甲苯甜香 [9]C0.00±0.00 13802hexanal 己醛青草 [8]A、B0.05±0.03 148213-methyl-butanoic acid 3-甲基丁酸酸臭 [11]C0.06±0.03 158302-methyl-butanoic acid 2-甲基丁酸焦香、奶酪 [3]C、B0.03±0.01 168882-heptanone 2-庚酮药片 [3]C、B0.01±0.01 17903heptanal 庚醛不愉快的油脂味道 [3]A、B0.01±0.01 18 915γ-butyrol actone γ-丁内酯C0.01±0.00 199162,6-dimethyl- pyrazine 2,6-二甲基吡嗪烤坚果、烤肉香 [3]C、B0.01±0.00 20 955dihydro-5-methyl-2(3H)-furanone 5-甲基-二氢-2（3H）-呋喃酮C0.01±0.00 21958hexanoic acid 己酸酸的 [6]C0.02±0.01 22973benzaldehyde 苯甲醛苦杏仁味 [3]B0.02±0.00 239932-pentyl-furan 2-戊基呋喃腌肉味 [3]B0.03±0.03 249962,2,4,6,6-pentamethyl- heptane 2,2,4,6,6-五甲基庚烷C0.01±0.01 251 000decane 癸烷A0.00±0.00 261 005octanal 辛醛焦香 [3]A、B0.00±0.00 27 1 0585-ethyldihydro-2(3H)-furanone 5-乙基-二氢-2（3H）-呋喃酮C0.01±0.00 281 107nonanal 壬醛烤焦香、油炸香、焦香、金属味 [3,8]A、B0.02±0.00 291 200dodecane 十二烷A0.01±0.01 301 357n-decano ic acid 癸酸难闻的气味C0.01±0.01 31 1 374dihydro-5-pentyl-2(3H)-furanone 5-戊基-二氢-2（3H）-呋喃酮焦糖味 [3]C、B0.01±0.00
实验中鉴定得到6 种烃，以脂肪烃居多。由于烃类物质的阈值较大，一般认为对腌腊制品的风味贡献不大 [23-24]。
一般认为酮类物质具有青香气味或奶油味、果香味，其中不饱和酮是动物特征味和植物油脂味的来源 [25]，是干腌火腿风味的重要组成部分。酮类物质是醛类进一步氧化的结果，是脂肪酸氧化的最终产物，甲基酮是本次实验鉴定得到的酮类化合物的主要形式。不饱和脂肪酸在加工过程中发生的氧化反应是甲基酮的主要来源。酮类物质作为一种羰基化合物，它的相对含量比醛类少，阈值也比同分异构体的醛类物质高 [23-24]，因此对干腌火腿风味的贡献小于醛类，但有增强风味的作用。
酯类由游离脂肪酸和肌肉组织内脂类氧化产生的醇反应生成，代表成熟肉制品的风味，对火腿风味特征有较大贡献。本实验只鉴定出γ-丁内酯一种酯类，可能是存放时间较长，部分脂质氧化生成醛、酮等物质有关。赵冰等 [26]采用热脱附-GC-MS联用检测不同等级、不同部位金华火腿挥发性风味物质，在金华特级样品中鉴定出γ-丁内酯，在特级火腿中的相对含量达到6.94%，与本实验鉴定类似。内酯类物质对火腿的风味具有非常重要的作用。
含硫化合物、呋喃酮及吡嗪类化合物等可被认为是发生美拉德反应后形成的产物。这些化合物的前体物质主要包括含硫氨基酸、还原糖及二羰基化合物等。2-戊基呋喃是亚油酸的氧化产物，具有泥土及蔬菜样香气，对整体风味有一定的影响。
本实验利用MMSE这种新颖的前处理方法，运用正交试验设计，对固相萃取整体捕集剂的材料、萃取时间和样品量3 个因素进行考察，为将该法用于其他肉类食品风味物质的研究提供参考。最终确定金华火腿风味物质检测条件为样品量5.0 g、萃取温度60 ℃、萃取时间60 min、捕集剂材料RCC18。该检测条件下分析得到31 种风味成分，其中烷烃4 种、醛类8 种、酮类6 种、醇类2 种、酸类6 种、酯类1 种、芳香类化合物3 种、其他化合物1 种。实验检测结果与前人研究存在差异还可能与所用样品和仪器不同有关，但主要风味成均能较好的检测出。
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Analysis of the Volatile Compounds of Jinhua Ham by Monolithic Material Sorptive Extraction Coupled with Gas Chromatography-Mass Spectrometry
GAO Shaoting, SONG Xue, CHEN Le, ZHANG Jingjing*, LIU Yuan
(Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing & Preservation, College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)
Abstract：A monolithic material sorptive extraction coupled with gas-chromatography-mass spectrometry method has been established and applied to evaluate the volatile compounds of Jinhua ham. Orthogonal experimental design was used to examine the effects of parameters including types of MonoTrap TM, sample amount, temperature and extraction time. The optimal extraction parameters were determined as follows: 5.0 g of sample were subjected to extraction at 60 ℃ for 60 min using MonoTrap TMRCC18. A total of thirty-one compounds, including hydrocarbons, aldehydes, ketones, alcohols, acids, esters, sulfur compounds, nitrogen compounds and oth ers, were identifi ed in Jinhua ham using the proposed method.
Key words：Jinhua ham; volatile compounds; MonoTrap; gas chromato graphy-mass spectrometry (GC-MS)
中图分类号：TS251.5
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）22-0113-04
doi：10.7506/spkx1002-6630-201522020
收稿日期：2015-03-11
基金项目：“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD28B01）；国家肉品质量安全控制工程技术研究中心开放课题（M2012K01）；上海市科委工程中心建设项目（11DZ2280300）；上海市教委重点学科建设项目（J50704）；上海高校知识服务平台上海海洋大学水产动物遗传育种中心项目（ZF1206）
作者简介：高韶婷（1990—），女，硕士研究生，研究方向为干腌火腿风味与品质评价。E-mail：1262609300@qq.com
*通信作者：张晶晶（1985—），女，实验师，硕士，研究方向为食品风味与品质。E-mail：zhangjj@shou.edu.cn