冻藏条件下魔芋葡甘聚糖降解产物对肌原纤维蛋白结构的影响

汪 兰 1,吴文锦 1,乔 宇 1,丁安子 1,廖 李 1,王 俊 1,付晓燕 2,熊光权 1,*

(1.湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所,湖北省农业科技创新中心农产品加工研究分中心,湖北 武汉 430064;2.武汉设计工程学院食品与生物科技学院,湖北 武汉 430205)

摘 要:为了研究魔芋降解产物对肌原纤维蛋白冷冻保护的作用机制,以草鱼肌原纤维为研究对象,采用紫外光谱、傅里叶红外光谱和扫描电镜研究不同的魔芋葡甘聚糖(konjac glucomannan,KGM)降解产物对冷冻贮藏草鱼肌原纤维蛋白结构的影响。结果表明:随着贮藏时间的延长,肌原纤维蛋白的最大吸收波长呈红移,主要由酪氨酸产生,不同的冷冻保护剂均不能保护酪氨酸的暴露。α-螺旋和β-折叠为草鱼肌原纤维蛋白主要的二级结构,随着贮藏时间的延长,α-螺旋结构所占比例上升,β-折叠结构所占比例下降,β-转角和无规卷曲的含量变化不大。辐照降解KGM和酶解KGM均对草鱼肌原纤维蛋白的二级结构有保护作用,稳定α-螺旋和β-折叠所占比例;而蔗糖-山梨糖醇促进草鱼肌原纤维蛋白中α-螺旋结构形成,不利于β-转角结构。显微观察的结果显示,辐照KGM样品和酶解的KGM样品可以延缓蛋白分子的聚集,延缓蛋白出现多孔状结构,而蔗糖-山梨糖醇样品冻藏过程保持片层结构。

关键词:肌原纤维蛋白;冷冻贮藏;二级结构;显微结构

我国是世界水产大国,淡水鱼产量连续多年居世界第一位 [1]。淡水鱼加工产品繁多,其中大宗的加工制品为冷冻鱼糜制品,可用于加工仿真食品。冷冻鱼糜是一种浓缩的高肌原纤维蛋白,经过采肉、漂洗、脱水、加入抗冻剂制成的糜状鱼肉。冷冻低温贮藏是鱼糜广泛采用的长期冷藏方法,但鱼糜蛋白在冻藏过程中容易发生冷冻变性,导致鱼糜品质劣化和鱼糜蛋白功能性降低,如持水性和水合能力下降、蛋白可溶性和凝胶能力下降等 [2]。在冷冻鱼糜的加工过程和冷藏中,水分子的运动状态改变、冰晶的形成、溶质的浓缩会促进鱼肉蛋白质聚集,超分子作用增强。肌原纤维蛋白是冷冻鱼糜的主要成分,其聚集变性会影响冷冻鱼糜的品质进而影响其后续加工性能。在鱼糜制作过程中,常添加蔗糖和山梨糖醇作为冷冻保护剂,致使甜味较重和热量高,影响了产品的口味和再加工性能,并限制部分消费群体(如糖尿病、肥胖等群体) [3]。许多学者已经开展了替代小分子冷冻保护剂的研究,其中多糖是有效替代品之一,而目前多糖对蛋白冷冻保护机理尚未明确,本实验室研究发现魔芋葡甘聚糖(konjac glucomannan,KGM)会极显著延缓冷冻鱼肉蛋白质的变性,但KGM对蛋白质冷冻保护的机理尚未明确。KGM是一种非离子型水溶性高分子多糖。它是由D-葡萄糖和D-甘露糖按1∶1.6的分子比例,以β-(1-4)糖苷键聚合而成 [3]。KGM分子质量较大,与水分子的亲和性极强,在水溶液中容易聚集,难以均匀分散,需对其分子进行降解后用于鱼糜制品。常用的降解方法有酶解法、酸碱降解、辐照降解等 [4-8]

目前有两种理论解释低分子质量的碳水化合物或者多元醇例如蔗糖、山梨糖醇和乳糖醇对蛋白质的冷冻保护机制。Arakawa等 [9]认为在蛋白溶液中添加糖(乳糖/葡萄糖)会产生的自由能改变使溶质从表面排除稳定溶质,蛋白质被优先水合。另一方面,Mastsumoto [10]假设冷冻保护剂分子可以与蛋白质中的功能基团通过离子键或氢键缔合,从而代替蛋白质极性基团周围的水分子,这样可保护氢键的连接位置不直接暴露在周围环境中,稳定蛋白质的高级结构。与低分子质量溶质相对的是高分子质量的碳水化合物作为冷冻稳定剂。MacDonald等 [11]认为高分子质量的聚合物作为冷冻稳定剂是将蛋白质置于玻璃态中,延缓变性过程。Carvajal等 [12]在研究不同分子质量的麦芽糊精对鱼肉蛋白的低温保护机制后,认为高分子质量的多糖超低温保护作用与低分子质量糖类的溶液排除机理不同,高分子质量的多糖可以固定水分子或形成玻璃态结构使蛋白质更加稳定。Zhou Aimei等 [13]研究了在冷冻鱼糜添加8%的海藻糖可获得与商业抗冻剂(蔗糖与山梨糖醇质量比为1∶1.8)更好的冷冻保护效果,是良好的抗冻剂替代品。Chou Yite等 [14]在盐溶性蛋白中添加低聚木糖,低温条件下蛋白质的稳定性和溶解性高于添加其他糖类或组合,推测低聚木糖可能会降低蛋白质疏水基团的暴露。

本课题组在前期研究中制备了低分子质量的KGM,并对低分子质量KGM、商业抗冻剂(4%蔗糖+4%山梨醇)对草鱼肌原纤维蛋白的冷冻保护作用进行了对比。为了进一步阐明KGM的冷冻保护作用机理,本研究采用紫外光谱、傅里叶变换红外光谱和扫描电镜研究冻藏条件下草鱼肌原纤维蛋白的结构,探讨KGM降解产物对对草鱼肌原纤维蛋白结构的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜草鱼购自武汉武商量贩超市。

KGM 湖北强森魔芋科技有限公司;β-葡聚糖酶(200 000 U/g) 美国BioSharp公司;其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

60γ射线辐照装置、pH-5A酸度计 梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司;3802紫外-可见分光光度计尤尼克(上海)仪器有限公司;GL-21M高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;VERTEX70傅里叶变换红外光谱仪 德国Bruker Optice公司;JSM-6390LV扫描电镜 日本NTC公司。

1.3 方法

1.3.1 草鱼肌原纤维蛋白的提取

取160 g草鱼肉,加入10 倍体积经过预冷过的20 mmol Tris-马来酸缓冲液(50 mmol KC1-20 mmol Tris-马来酸,经0.5 mol/L的NaOH溶液中和),用搅拌机匀浆,低温离心(9 000 r/min,10 min,4 ℃),取出后弃去上清液,按此方法重复洗涤2次。沉淀与20 mmol Tris-马来酸缓冲液(0.6 mol KCl-20 mmol Tris-马来酸,经0.5 mol/L的NaOH溶液中和)用搅拌机匀浆,放入冰箱于4 ℃提取60 min,取出后4 ℃、9 000 r/min离心30 min,所得上清液为实验用肌原纤维蛋白溶液 [15]

1.3.2 低分子质量KGM的制备

辐照KGM样品的制备:称取5 g魔芋精粉,以1∶60(g/mL)的固液比将魔芋精粉溶解在蒸馏水中,静态常温以10、20、25 kGy的梯度降解,降解后的样品进行冷冻干燥,干燥后的样品研磨后备用。β-葡聚糖酶酶解KGM样品的制备:称取5 g魔芋粉,以固液比1∶60(g/mL)加入pH 5.5的稀盐酸溶液,于50 ℃的水浴锅中加热,加入β-葡聚糖酶,缓慢搅拌使其均匀地分散在溶液中,酶解时间100 min,降解结束后用1 mol/L的NaOH溶液进行中和,干燥后粉碎备用 [16-17]

1.3.3 样品制备

分别在草鱼肌原纤维蛋白中添加KGM降解产物,辐照KGM和β-葡聚糖酶酶解KGM的添加量为0.5%,而商用抗冻剂(4%蔗糖+4%山梨糖醇)的添加量为8%,置于-18 ℃冻藏,分别在0、5、10、15、20、25、30 d后取出后进行分析。

1.3.4 紫外光谱的测定

以0.6 mol /L KCl缓冲液为空白,在230~350 nm 建立基线,将肌原纤维蛋白溶液用0.6 mol/L KCl溶液稀释至蛋白质水平为0.6~0.8 g/100 g,采用UV-3802紫外-可见分光光度计在230~350 nm波长范围将添加了不同抗冻剂的4 种样品(空白、添加辐照KGM样品、添加酶解KGM样品和添加蔗糖-山梨糖醇样)分别进行光谱扫描。

1.3.5 傅里叶红外变换光谱的测定

将添加不同抗冻剂的草鱼肌原纤维蛋白的样品冷冻干燥后,取适量样品置于检测器上,扫描范围4 000~400 cm -1,分辨率4 cm -1,扫描频率10 kHz。

1.3.6 显微观察

将样品冷冻干燥后用导电胶固定在样品台上,样品表面真空喷金后,采用扫描电镜观察,扫描过程用20 kV的加速电压。

1.4 数据处理分析

蛋白在谱带范围内(酰胺Ⅲ带1 220~1 330 cm -1)进行两点基线校正,采用5 点Savitsk-Golay函数平滑后,作二阶导数和傅里叶去卷积,采用Peakfit软件对谱图进行拟合,多次拟合使残差最小,重叠在一起的不同谱带可完全分辨开,当确定了各子峰与不同二级结构的对应关系后,根据其积分面积计算各种二级结构的相对百分含量 [18]

2 结果与分析

图1 冷冻贮藏过程中肌原纤维蛋白的紫外光谱图
Fig.1 Ultraviolet spectra of myofi brillar protein during frozen storage

2.1 冷冻贮藏过程中草鱼肌原纤维蛋白的紫外光谱分析

如图1所示,随着贮藏时间的延长,空白样品的紫外最大吸收波长在270~274 nm之间,最大吸收波长变化呈先红移后平稳趋势;辐照KGM样品的最大吸收波长在\259~274 nm之间,最大吸收波长变化呈先蓝移后红移的趋势;酶解KGM样品的最大吸收波长在269~274 nm之间,最大吸收波长在0~20 d变化不大,20 d后呈红移趋势;蔗糖-山梨糖醇样品的最大吸收波长270~274 nm之间,最大吸收波长呈波动式红移。色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的R基团含有苯环共轭双键,分别在280、275 nm和257 nm有吸收峰 [19],肌原纤维蛋白的最大吸收波长在275 nm附近,可能是肌原纤维蛋白中酪氨酸未包埋在蛋白质内部,呈现紫外吸收。随着贮藏时间的延长,所有样品的最大吸收波长均出现红移,但贮藏过程中最大吸收波长的波动可能是冷冻贮藏过程中的酪氨酸微环境的差异造成的。

2.2 冷冻贮藏过程中草鱼肌原纤维蛋白的红外光谱分析

图2 酰胺Ⅲ区的曲线拟合结果
Fig.2 Curve-fi tting results of amide Ⅲ region for myofi brillar protein

图3 冷冻贮藏过程中肌原纤维蛋白的二级结构分布
Fig.3 Secondary structure composition of myofi brillar protein during frozen storage

蛋白质的肽键有几个特征振动模式,包括酰胺Ⅰ(1 600~1 700 cm -1)、酰胺Ⅱ(1 500~1 600 cm -1)和酰胺Ⅲ区(1 260~1 300 cm -1),其中酰胺Ⅰ和酰胺Ⅲ区的谱带对于探讨蛋白质的二级结构十分有用,可定量分析获得各种二级结构的相对含量。但溶剂水的谱带与酰胺Ⅰ具有一定程度的重叠,分析时常用重水代替水排除水的干扰 [20]。酰胺Ⅲ区的谱带来源于肽键的C—N伸缩振动和N—H面内振动,可用于指示蛋白质的二级结构,α-螺旋含量高的蛋白质在1 260~1 300 cm -1区域内有弱吸收,β-折叠通常在1 238~1 245 cm -1附近有较强的吸收,而无规卷曲结构的吸收出现在1 243~1 250 cm -1附近 [21-22]。草鱼肌原纤维蛋白在酰胺Ⅲ区的曲线拟合结果如图2所示,根据拟合结果计算不同样品在贮藏过程中二级结构的含量。冷冻贮藏过程中添加不同冷冻保护剂草鱼肌原纤维蛋白的二级结构的分布如图3所示。随着冷冻时间的延长,空白样品中的α-螺旋的含量从52.91%上升至57.18%,在贮藏过程中呈波动上升,贮藏第10天时α-螺旋的含量最低,β-折叠的含量从19.63%下降至15.56%,β-转角含量和无规卷曲的含量波动较小;辐照降解KGM的样品中α-螺旋的含量从51.14%上升至53.09%,呈先下降后上升的趋势,贮藏第10天时α-螺旋的含量最低,β-折叠的含量从21.41%下降至19.90%,呈先上升后下降的趋势,贮藏第10天时β-折叠的含量最高,β-转角的含量在贮藏前后变化不大,无规卷曲的含量贮藏前后变化不大。酶解KGM的样品α-螺旋、β-折叠和β-转角含量在贮藏前后均变化不大,无规卷曲略有上升,从10.30%上升至11.27%;蔗糖-山梨糖醇样品中α-螺旋的含量从63.39%上升至70.73%,呈先下降后上升的趋势,β-折叠的含量在贮藏前后差别不大,呈先上升后下降的趋势,β-转角的含量从8.22%下降至2.23%,呈下降趋势,无规卷曲的含量从8.02%下降至6.06%,在15 d内先上升后下降。草鱼肌原纤维蛋白在贮藏过程中处于动态的变化过程,所有的样品在第10天时不同的二级结构所占的比例均发生剧烈变化,这可能是由于肌原纤维蛋白在冻结的过程中蛋白质的聚集和水分子结晶造成。

α-螺旋和β-折叠为肌原纤维蛋白主要的二级结构,除蔗糖-山梨糖醇样品外,其他样品中α-螺旋和β-折叠结构所占比例之和在贮藏过程中在70%~73%之间波动,而蔗糖-山梨糖醇样品中α-螺旋和β-折叠结构所占比例之和在80%~92%之间波动。不同的冷冻保护剂对草鱼肌原纤维蛋白的二级结构的作用不同,除了酶解KGM的样品外,其他样品的α-螺旋的含量均有所上升,这与刘燕辉等 [23]的观点一致,低温有助于α-螺旋的结构的形成。对比不同的冷冻保护剂,蔗糖-山梨糖醇对二级结构中α-螺旋结构的形成有更好的促进作用,贮藏初始空白样品中α-螺旋结构所占的比例为52.91%,而蔗糖-山梨糖醇样品中α-螺旋结构所占的比例为63.39%,β-转角所占比例最小,推测小分子的糖类有助于α-螺旋结构的形成,而不利于β-转角结构。与空白相比,辐照降解KGM样品和酶解KGM样品在冷冻贮藏过程中对草鱼肌原纤维二级结构均有一定的保护作用,α-螺旋和β-折叠所占的比例在贮藏前后差异不大。

2.3 冷冻贮藏过程中草鱼肌原纤维蛋白的显微观察

图4 冷冻贮藏过程中肌原纤维蛋白的微观结构
Fig.4 Microstructure of myofi brillar protein during frozen storage

如图4所示,未添加冷冻保护剂的草鱼肌原纤维蛋白样品在0 d时呈多孔疏松结构(图4a 1)。这一点与Trespalacious等 [24]观察的鸡肉凝胶结构类似。而随着冻藏时间的延长,30 d后蛋白的多孔结构孔壁变厚,说明肌原纤维蛋白在贮藏的过程中在聚集。而其他添加冷冻保护剂的样品,肌原纤维蛋白呈连续片层状(图4b~d),0 d时未出现明显孔状结构。随着冻藏时间的延长,30 d后,添加酶解KGM的样品呈多孔状结构,添加辐照KGM的样品出现网状结构,而蔗糖-山梨糖醇样品仍呈片层结构。对比空白和添加不同冷冻保护剂的肌原纤维蛋白结构,可以发现小分子的糖类有助于肌原纤维蛋白形成片层结构,保持蛋白的分散。随着冻藏时间的延长,水分子形成的冰晶结构不断增大,促进了肌原纤维蛋白分子间的聚集,形成网状结构,辐照KGM样品和酶解的KGM样品可以延缓蛋白分子的聚集,但30 d后仍能观察到蛋白聚集,而蔗糖-山梨糖醇样品由于小分子糖添加量较大,仍保持片层结构,推测可能是糖分子与蛋白质分子均匀分散,冻干后样品以糖分子为主体。

3 结 论

研究表明,冷冻贮藏过程中,空白和添加冷冻保护剂的肌原纤维蛋白的酪氨酸都逐渐暴露,冷冻保护剂不能保护肌原纤维蛋白中的酪氨酸在冻藏过程中暴露。但不同的冷冻保护剂对草鱼肌原纤维蛋白二级结构的保护作用有差异,辐照降解KGM和酶解KGM均对草鱼肌原纤维蛋白的二级结构有保护作用,可以稳定冻藏后α-螺旋和β-折叠结构所占比例;而蔗糖-山梨糖醇的添加量较高,而且分子质量较小,显著促进草鱼肌原纤维蛋白中α-螺旋结构形成,破坏β-转角结构。辐照KGM样品和酶解的KGM样品可以延缓肌原纤维蛋白分子的聚集,而蔗糖-山梨糖醇与蛋白均匀分散。因此,有可能辐照降解的KGM和酶解KGM对肌原纤维蛋白的冷冻保护是通过稳定蛋白中α-螺旋和β-折叠结构,从而延缓蛋白分子的聚集。而小分子的蔗糖-山梨糖醇的冷冻保护作用是促进蛋白α-螺旋结构的形成,与小分子均匀分散。

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Effect of Degraded Products of Konjac Glucomannan on the Structure of Myofi brillar Protein from Glass Carp Meat during Frozen Storage

WANG Lan 1, WU Wenjin 1, QIAO Yu 1, DING Anzi 1, LIAO Li 1, WANG Jun 1, FU Xiaoyan 2, XIONG Guangquan 1,*
(1. Farm Products Processing Research Sub-Center of Hubei Innovation Center of Agriculture Science and Technology, Institute for Farm Products Processing and Nuclear-Agricultural Technology, Hubei Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430064, China; 2. College of Food and Biology Science Technology, Wuhan Institute of Design and Sciences, Wuhan 430205, China)

Abstract:The present study investigated the effect of different degraded products of konjac glucomannan (KGM) on the structure of myofi brillar protein from glass carp meat during frozen storage by ultraviolet spectroscopy, infrared spectroscopy (IR) and scanning electronic microscope (SEM), in order to elucidate the cryoprotective mechanism of degraded products of konjac glucomannan on myofibrillar protein. The results showed that α-helix and β-sheet were the major secondary structures of myofi brillar protein from grass carp meat. The content of α-helix structure increased with prolonged frozen storage, while the content of β-sheet structure decreased. And there were little changes in the contents of β-turn structure and random coil. The degraded KGM by irradiation or β-glucanase could protect α-helix and β-sheet of myofi brillar protein from grass carp meat and stabilize the proportions of the two secondary structures. Sucrose-sorbitol mixture could promote the formation of α-helix structure but hinder the formation of β-turn. The microstructure of myofi brillar protein exhibited that the degraded products of KGM from both treatments could retard the aggregation of myofi birillar protein, while the addition of sucrose and sorbitol could result in formation of lamellar structure.

Key words:myofi brillar protein; frozen storage; secondary structure; microstructure

中图分类号:TS254.1

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2015)22-0244-06

doi:10.7506/spkx1002-6630-201522046

收稿日期:2015-03-26

基金项目:武汉市青年科技晨光计划项目(2015070404010197);湖北省重大科技创新计划项目(2015ABA038);

湖北省科技支撑计划项目(2014BBA158);湖北省农业科学院青年科学基金项目(2013NKYJJ16)

作者简介:汪兰(1981—),女,副研究员,博士,研究方向为农产品加工和天然产物化学。E-mail:2005lily@gmail.com

*通信作者:熊光权(1965—),男,研究员,学士,研究方向为水产品加工及副产物综合利用。E-mail:xiongguangquan@163.com