·生成速率及质膜过氧化水平如丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量、细胞膜透性的变化以及对生菜贮藏效果（质量损失率、叶绿素含量）的影响。探讨冰温贮藏对生菜抗氧化能力及保鲜效果的影响，以期为生菜的采后贮藏保鲜及加工技术提供参考。
唐 坚，马 丽，王凯晨，王梦晗，乔勇进*
（上海市农业科学院农产品保鲜加工研究中心，上海 201403）
摘 要：探讨冰温技术对生菜的贮藏效果以及对其抗氧化能力的影响，以采后生菜为试材，4 ℃预冷8 h后装入微孔聚乙烯保鲜袋中，置于温度为（-0.5±0.2）℃的冷库贮藏。贮藏过程中，每3 d测定生菜的抗氧化酶活性、抗氧化物质含量、H 2O 2含量、O 2 -·生成速率、丙二醛含量、细胞膜透性、呼吸速率、质量损失率以及叶绿素含量。结果表明：与传统冷藏相比，冰温贮藏显著抑制了生菜呼吸速率；降低了质量损失率；延缓了叶绿素含量的下降速度，并诱导H 2O 2含量增加，提高了抗氧化酶过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）的活性，减缓了抗氧化物质抗坏血酸含量的下降速率；降低了O 2 -·生成速率；减缓了细胞膜脂质过氧化损害过程，延缓了丙二醛的积累速度。冰温贮藏可能通过抑制生菜自身代谢提高了生菜抗氧化能力，改善了生菜贮藏保鲜效果。
关键词：冰温；生菜；抗氧化能力；保鲜效果。
生菜俗称叶用莴苣，是一种世界性蔬菜，世界各地均有种植消费 [1]。生菜采后自身代谢活跃，有较高的呼吸强度，如果不使用有效的贮藏保鲜方法，会迅速损失质量，黄化，导致其失去商品性。因此，研究生菜的贮藏保鲜技术有着重要意义 [2-3]。冰温贮藏是指将果蔬贮藏在0 ℃以下、果蔬冰点以上的温度区间 [4]。冰温贮藏作为一种物理保鲜方法，有延长贮藏期、安全、维持风味、无化学残留等优点，并且能够极大限度地抑制果蔬自身代谢，以及腐败微生物的滋生，是果蔬保鲜领域最先进的技术之一 [5-6]。该技术在国内外均有研究报道，林本芳等 [7]在-0.6 ℃对西兰花经行贮藏，其研究发现冰温贮藏延缓了西兰花的品质下降，提高了抗氧化酶活性，增强了贮藏品质。于继男等 [8]用低温驯化在冰温贮藏的方式抑制了蓝莓VC和花色苷含量的减少，提高了蓝莓保鲜效果。刘玲等 [9]使用1-甲基环丙烯结合冰温贮藏对富士康苹果保鲜，发现贮藏显著降低果实呼吸强度、乙烯生成速率，延长了苹果货架期。Kim等 [10]用冰温贮藏方式对富士康苹果贮藏，结果表明延缓了果实褐变的时间，提高了贮藏效果。但是，在冰温条件下对生菜抗氧化能力的研究报道不多。
本实验以采后生菜为试材，在冰温环境下对生菜经行贮藏，研究了冰温贮藏对生菜抗氧化酶如过氧化氢酶（catalase，CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性，抗氧化物质如抗坏血酸（ascorbic acid，ASA）含量，活性氧水平如H
2O
2含量、
·生成速率及质膜过氧化水平如丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量、细胞膜透性的变化以及对生菜贮藏效果（质量损失率、叶绿素含量）的影响。探讨冰温贮藏对生菜抗氧化能力及保鲜效果的影响，以期为生菜的采后贮藏保鲜及加工技术提供参考。
1.1 材料
供试散叶生菜取自上海孙桥现代农业园区绿色蔬菜生产基地。
1.2 仪器与设备
恒温智能保鲜库 西安冰欣冷气工程有限公司；BP301S型电子天平 德国赛多利斯公司；D37520osterode型高速冷冻离心机 德国BioFuge公司；Ultrospee3300Pro型紫外分光光度计 美国安玛西亚公司；PE-30型电导仪梅特勒-托利多仪器有限公司；GXH-305型便携式红外线CO 2气体分析仪 北京分析仪器五厂。
1.3 方法
1.3.1 实验处理与分组
散叶生菜当天采摘，挑选外表干净，无明显机械伤，无病害的完整个体，3 h内运回实验室。清洗后随机挑选分为2 组，每组50 颗放入4 ℃预冷8 h后，按照普通冷藏（4 ℃）、冰温（-0.5 ℃）进行贮藏，每隔3 d取样进行相关指标测定，每个测定3 个平行。实验分组为：1）低温组：将预冷后的生菜装入厚0.03 mm的聚乙烯保鲜袋（微孔）中，置于温度（4±0.5）℃冷库直接贮藏；2）冰温组：将预冷后的生菜装入厚0.03 mm的聚乙烯保鲜袋（微孔）中，置于温度（-0.5±0.2）℃保鲜库贮藏。
1.3.2 生菜冰点的测定
将供试生菜切碎，打浆均质后置于烧杯中，置于-20℃冰箱中，在烧杯中心位置固定温度计，每隔1 min记录温度读数，精确到0.1 ℃ [11]。
1.3.3 生菜理化指标测定
细胞膜透性的测定：采用相对电导率法；质量损失率的测定：采用称重法；叶绿素含量测定：参照曹建康等 [12]的方法；CAT、APX的提取参照Zhu Zhujun等 [13]的方法，CAT活性采用Cakmak等 [14]的方法测定。APX的活性采用曹建康等 [12]的方法测定；ASA含量测定：采用郑京平 [15]的方法；H 2O 2和O 2 -·含量的测定：参照曹建康等 [12]的方法；MDA含量的测定：参考Cakmak等 [14]的方法。
1.4 数据分析
运用SPSS 19.0软件分析处理数据，用邓肯多重比较法检验差异显著性，5%为显著水平，1%为极显著水平。
2.1 生菜的冰点
图1 生菜浆的冻结曲线
Fig.1 Freezing curve of lettuce pulp
蔬菜种类繁多，组织结构不尽相同，这造成不同种类蔬菜冰点不同，大部分研究指出蔬菜的冰点大致在-2～-0.5 ℃之间 [16]。从图1发现，放入低温环境后生菜浆温度持续降低至-0.8 ℃后出现拐点，温度小幅上升后在-0.8 ℃附近持续5 min左右，之后继续下降。由于在相变的时候会释放热量 [17]，据此推断供试生菜冰点在-0.8 ℃。考虑到均质后的果蔬冰点比完整个体稍低以及冰箱存在温度波动等原因，将生菜的冰温贮藏温度设定在-0.5 ℃。
2.2 冰温贮藏对生菜呼吸速率的影响
图2 冰温贮藏对生菜呼吸速率的影响
Fig.2 Effect of freezing-point storage on the respiration intensity of lettuce
采后生菜依然是活的有机体，自身代谢活动仍在有序进行，呼吸作用会消耗机体内营养物质，加速衰老进程，影响贮藏品质。从图2可以看出，贮藏期间生菜呼吸速率呈缓慢上升趋势，冰温组呼吸速率始终低于低温组，差异达显著水平（P＜0.05），在第9、15天低温组呼吸速率比比冰温组高44.9%、25.4%，说明了冰温贮藏降低了生菜的呼吸速率，抑制了生菜自身代谢。
2.3 冰温贮藏对生菜质量损失率、总叶绿素含量的影响
图3 冰温贮藏对生菜质量损失率（A）和总叶绿素含量（B）的影响
Fig.3 Effect of freezing-point storage on the weight losses rate and chlorophyll content of lettuce
由图3可以看出，生菜在冰温贮藏中质量损失率和总叶绿素含量指标均优于低温贮藏。低温贮藏在15 d时质量损失率为2.7%，总叶绿素含量为0.69 mg/g，同期冰温组两指标分别为2.2%、0.81 mg/g。这说明冰温贮藏有效提高了生菜贮藏品质。
2.4 冰温贮藏对生菜APX和CAT活性影响
图4 冰温贮藏对生菜APX（A）和CAT（B）活性影响
Fig.4 Effect of freezing-point storage on the activities of APX (A) and CAT (B) of lettuce
APX通过催化抗坏血酸氧化为单脱氢抗坏血酸，同时将H 2O 2还原成H 2O，达到清除H 2O 2自由基的目的。如图4A所示，低温与冰温组的总体变化趋势相似，其活性在贮藏过程中先升高在下降，在3～12 d时维持在一个较高水平，12 d后内开始下降，同时H 2O 2开始累积。冰温贮藏提高了APX的活性，在3 d和6 d时比低温对照组的APX活性高出了51.7%和93.7%，在9 d以后APX活性平均高出30%左右（P＜0.05）。
CAT通过催化植物体内积累的H 2O 2分解为O 2 -·和H 2O，从而减少H 2O 2对组织可能造成伤害的氧化伤害。从图4B可以看出，CAT活性变化趋势为先上升后下降，贮藏前6 d冰温和低温组的CAT活性并没有显著差异，9 d以后活性变化开始分化，低温组活性迅速下降，冰温组下降速度较慢，15 d时2 组相差达75.7%，达到差异显著水平（P＜0.05）。
2.5 冰温贮藏对生菜ASA含量的影响
图5 冰温贮藏对生菜ASA含量影响
Fig.5 Effect of freezing-point storage on the content of ASA of lettuce
从图5可以发现，生菜体内ASA含量在前3 d迅速下降，在3～9 d下降速度较缓，冰温贮藏组还有所回升。在9 d以后又迅速下降，15 d时低温组只有初始值的19.3%，冰温组为初始值的62.4%。ASA含量可以反映机体清除活性氧的能力，实验表明，与低温组相比冰温处理可以减缓ASA含量降低速率，差异达显著水平（P＜0.05）。
2.6 冰温贮藏对生菜
·生成速率和H
2O
2含量的影响
图6 冰温贮藏对生菜
·生成速率（AA）和HH
2O
2含量（BB）的影响
Fig.6 Effect of freezing-point storage on the formation rate of superoxide anion radical and H
2O
2content of lettuce
·是通过植物自身代谢产生的一类自由基，其能衍生成为H
2O
2、OH·（羟自由基）、
1O
2（单线态氧）等。如若这些自由基不能及时清除，会发生对植物伤害性的氧化反应
[18]。从图6A可以看出，
·生成速率呈现先上升后下降再上升的趋势，贮藏前3 d，2 组生菜的
·生成速率并无显著差异，第6天开始，
·生成速率出现分化，冰温组的生成速率迅速降低，在第9天时其O
2
-·生成速率只有低温组的68.8%，12 d和15 d时分别只有低温组的54.5%和73.6%，两组之间达显著差异（P＜0.05），这说明在冰温贮藏的条件下，生菜生理代谢活动受到了更大的抑制，其呼吸作用进一步降低，
·生成速率降低，减轻机体清除自由基的负担，延缓机体衰老。
从图6B可以发现，2 种处理的H 2O 2含量都有先升高后降低在升高的变化趋势，在贮藏前9 d两组处理的H 2O 2含量并无显著差别，9 d以后低温组H 2O 2的上升速度高于冰温组在15 d时相差达45.2%。贮藏初期生菜H 2O 2含量上升可能是由于机体处于环境逆境中，体内的抗逆性保护机制被H 2O 2诱导启动，随着机体抗氧化系统的激活，抗氧化酶活力上升，H 2O 2含量下降，在贮藏后期，生菜开始衰败，抗氧化酶活力下降，机体内累积的H 2O 2无法得到有效清理，导致细胞膜脂质迅发生过氧化损坏进而加速生菜衰亡。从实验结果可以发现冰温可以延缓这一过程的发生。
2.7 冰温贮藏对生菜MDA含量和细胞膜渗透性影响
图7 冰温贮藏对生菜MDA含量（A）和细胞膜渗透性（B）的影响
Fig.7 Effect of freezing-point storage on the conte nt of MDA (A) and membrane permeab ility (B) of lettuce
从图7A可以发现，2 种贮藏方式的生菜MDA含量都在贮藏初期小幅上升，在3～6 d有所回落，之后其含量持续上升，说明在6 d以前细胞膜脂处于一个较为完好状态，而之后其过氧化程度不断 提高。而冰温贮藏可以降低MDA积累的速度，在贮藏第9、12、15天其MDA含量分别比低温 组低35%、52%和41%，差异达到显著水平（P＜0.05）。其原因可能是冰温贮藏更有效地抑制了生菜自身的代谢作用，延缓了生菜的衰老进程，使生菜发生膜脂过氧化的进程变缓。这对于提高生菜的贮藏效果有积极作用。
细胞膜通透性反映了果蔬贮藏过程中的状态，自身衰老及逆境胁迫状态易造成细胞内部电解质外渗，造成透性增加。如图7B所示，生菜在贮藏期间的相对电导率缓慢上升，贮藏前6 d冰温和低温贮藏对相对电导率没有显著影响。随着贮藏时间延长，相对电导率开始上升，低温组在15 d时相对电导率达14.3%，比冰温组高出42.9%。冰温处理在贮藏中后期显著抑制了相对电导率的上升（P＜0.05），延缓了果蔬衰老，维持细胞膜完整性。
本实验研究表明：冰温贮藏15 d后，生菜的整体贮藏品质高于传统低温贮藏，贮藏期间冰温贮藏环境对降低生菜呼吸速率、质量损失率，延缓叶绿素下降速度方面的有着显著效果，进一步研究发现生菜在贮藏初期H 2O 2含量升高，从而激活抗氧化酶APX、CAT活性，并且贮藏后期活性下降速率较低，同时冰温贮藏方式减缓了抗氧化物质ASA下降速率；降低O 2 -·生成速率；延缓MDA积累速度，减轻细胞膜脂质过氧化损害。达到抑制生菜自身代谢，提高生菜抗氧化活性，改善生菜贮藏保鲜的效果。
果蔬体内有着完整的活性氧清除机制，主要包括抗氧化酶（APX、CAT等）和抗氧化物质（ASA等）。在受到环境影响，如低温、干旱、创伤等条件胁迫时，体内活性氧便 会大量产生 [19-20]。本实验研究发现冰温贮藏诱导激发了初期生菜H 2O 2含量上升，H 2O 2作为一种信号分子 [21]可以诱导植物防御系统相关酶基因表达，如APX、CAT [22-23]等，从而提高机体抗氧化能力，减少过氧化损害。这与欧阳丽喆等 [24]冷激处理番 茄果实后，H 2O 2含量先上升后下降，王慧等 [25]利用热激处理青椒果实，H 2O 2含量短暂升高的研究结果一致。在APX和CAT活性增加，ASA含量下降的共同作用下，机体内活性 氧含量得到控制，贮藏初期MDA含量和细胞膜透性无明显变化，贮藏品质较好；随着 贮藏时间延长，ASA含量持续下降，APX和CAT活性波动后下降，机体内抗氧化能力降低，活性氧无法及时清除从而逐渐累积，导致发生过氧化伤害，MDA含量上升，细胞膜透性增加，生菜贮藏品质下降。
研究表明，冰温贮藏在前期效果并不明显，在中后期效果好于低温贮藏。贮藏前6 d除APX活性比低温组高之外其他指标差异并不大。至贮藏中后期，差异开始显现，冰温组APX、CAT活性，ASA含量下降速率低于低温组，生菜内H 2O 2含量、O 2 -·生成速率均低于低温组。从生菜质量损失率及叶绿素含量等品质指标也可以发现，冰温贮藏在短期贮藏时并不具有 明显优势，中长期贮藏效果好于低温。
值得注意的是，低温贮藏在初期也提高了H 2O 2含量，且其含量还高于冰温组，但与之对应的APX活性虽然同时提高，但效果比冰温组差，CAT活性提高基本相同。这说明当H 2O 2作为信号分子时，需合适浓度才能达理想效果，其最佳浓度确定以及是否可以人工干预需进一步研究。
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Effect of Freezing-Point Storage on Antioxidation Capacity and Preservation of Postharvest Lettuce
TANG Jian, MA Li, WANG Kaichen, WANG Menghan, QIAO Yongjin*
(Agricultural Products Storage and Processing Research Center, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201403, China)
Abstract：This study aimed to investigate the effect of freezing-point storage on antioxidation capacity and preservation of postharvested lettuce. Lettuce were packaged into microporous PE bags and stored at (−0.5 ± 0.2) ℃ for 15 days after pre-cooling at 4 ℃ for 8 h. The changes in ascorbate peroxidase (APX) and catalase (CAT) activities, ascorbic acid (AsA) and H 2O 2contents, superoxide anion radical formation rate, malondialdehyde (MDA) content, membrane permeability, respiration intensity, weight losses rate and chlorophyll content were measured. The results indicated that compared with the traditional storage, freezing-point storage induced an increase in endogenous H 2O 2content at the beginning of storage, enhanced the activities of APX and CAT, postponed the decrease of ASA content, and inhibited the accumulation of superoxide anion radical, MDA content, respiration intensity, weight losses rate and chlorophyll content. These results suggest that freezing-point storage may inhibit the metabolic rate and enhance the antioxidant capacity of lettuce, thus improving its storage quality.
Key words：freezing-point; lettuce; antioxidant capacity; preservation
中图分类号：TS255.3
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）22-0255-05
doi：10.7506/spkx1002-6630-201522048
收稿日期：2015-02-17
基金项目：上海市科技兴农推广项目（沪农科推字（2015）第5-1号）；上海市科学技术委员会研发平台专项（14DZ2293900）
作者简介：唐坚（1989—），男，硕士研究生，研究方向为农产品保鲜与加工。E-mail：TJ_lance@foxmail.com
*通信作者：乔勇进（1967—），男，研究员，博士，研究方向为农产品保险与加工。E-mail：yjqiao2002@126.com