徐兰英 1，赵 辉 2，张 婷 1，吴 伦 1，龙 涛 1，*，李士明 1，*
（1.黄冈师范学院化工学院，催化材料制备及应用湖北省重点实验室，湖北 黄冈 438000；2.天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术 重点实验室，天津 300134）
摘 要：通过分离纯化及改性得到橘皮素和5-去甲氧基橘皮素，并研究其对人体肝星状细胞株LX-2的抑制作用。通过无水乙醇提取、氯仿萃取从陈皮中得到多甲基黄酮混合物，再以不同浓度的乙酸乙酯和石油醚的混合液为洗脱剂，采用硅胶柱层析分离纯化多甲基黄酮混合物，得到橘皮素纯品。将橘皮素置于盐酸乙醇溶液中回流，对所得产物进行纯化即可得5-去甲氧基橘皮素，采用质谱和核磁共振谱进行结构确证。利用人体肝星状细胞株LX-2细胞作为工具细胞，研究其生物活性。结果表明，5-去甲氧基橘皮素在12.5 μmol/L条件下对人肝星状细胞株LX- 2的抑制率即可达到50%，而橘皮素需要在近150 μmol/L条件 下才能达到50%的抑制率，即改性后的橘皮 素对人体肝细胞的抑制有效率增加了10 倍以上。
关键词：橘皮素；5-去甲氧基橘皮素；多甲氧基黄酮；肝星状细胞LX-2
我国是肝病大国，近年来的疾病谱变化表明，随着生活水平的提高，除了肝炎病毒外，酒精和非健康饮食所致的肝纤维化日趋增加，严重威胁到人们的健康 ［1］。肝纤维化是包括酒精、肝炎病毒、高脂饮食、自体免疫等多种慢性肝脏炎症性损伤的共同结局，近年来的研究证明，这些慢性炎症刺激之所以会殊途同归，导致肝纤维化，是因为它们具有共同的生物学基础：激活NF-κB信号，导致肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）活化和增殖 ［2-3］。因此，要解决肝纤维化，必须控制HSCs增殖与活化 ［4-5］。
陈皮为芸香科植物橘及其栽培变种的干燥成熟果皮，从中医 理论上来看，陈皮具有 肝升肺降功效，使机体气机条达，血气冲和而运行流畅。例如经典的“陈皮二红饮”和“丹参陈皮 膏”等都是治疗气滞血瘀型脂肪肝的良方。目前研究表明陈皮中主要活性物质有挥发油中的萜 烯类化合物 ［6-7］、多羟基黄酮化合物 ［8-11］、多甲氧基黄酮以及羟基多甲氧基黄酮 ［12-19］，其中橘皮素、川陈皮素和3，5，6，7，8，3'，4'-七甲氧基黄酮等多甲氧基黄酮是橘皮的特有成分 ［20-25］。
本实验以陈皮为原料，首先通过无水乙醇提取、氯仿萃取得到多甲基黄酮混合物，再采用硅胶柱层析法，以乙酸乙酯-石油醚为淋洗液，分离纯化得到橘皮素纯品，并对其进行改性得到5-去甲氧基橘皮素。探讨了橘皮素和5-去甲氧基橘皮素对人肝星状细胞株LX-2的抑制作用，为陈皮膳食防治肝纤维化提供实验基础和理论依据。
1.1 材料、菌株与试剂
陈皮购于黄州百联大药房。
人体肝星状细胞株LX-2由北京友谊医院白志刚教授赠送。
无水乙醇、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、浓盐酸（分析纯）、乙腈（色谱纯） 国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
CCA-20低温冷却水循环泵、SHZ-DⅢ 循环水真空泵巩义市予 华仪器有限责任公司；RE-52AA旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂；LC-20型高效液相色谱（high performance liquid chromatograpy，HPLC）仪 日本岛津公司；5975C型气相色谱-质谱（gas chromatograpymass spectrometry，GC-MS）联用仪 美国Agilent公司；Mercury 300型核磁共振波谱（nuclear magnetic resonance，NMR）仪 美国瓦里安公司。
1.3 方法
1.3.1 色谱分离条件
HPLC条件：Spelco RP-Amide液相色谱柱（150 mm×4.6 mm，3 μm）；流动相：乙腈-水，梯度：0～15 min，40%～55%乙腈；15～2 0 min，55%～70%乙腈；20～25 min，70%～80%乙腈；25～30 min，80%～40%乙腈；流速：1.0 mL/min； 柱温：35 ℃；检测波长：326 nm；进样量：20 μL。
GC-MS条件：HP-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为高纯氦气，柱流速1 mL/min，进样口温度280 ℃，分流比50∶1；起始温度60 ℃，以50 ℃/min速率升温至260 ℃，保持40 min；进样体积1 μL，质谱离子扫描范围为m/z 50～550。
1.3.2 核磁共振波谱条件
核磁共振氢谱频率为300 MHz，以四甲基硅烷为内标，采用氘代二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）作为溶剂，室温下对橘皮素和5-去甲氧基橘皮素进行检测。
1.3.3 橘皮素的提取分离
提取：取一定量无水乙醇与陈皮粉末，用乙醇提取陈皮中的物质，再将乙醇溶液过滤，将得到的溶液用旋转蒸发仪蒸为稠状物。
萃取：将稠状物用适量的蒸馏水溶解，再加入等体积萃取剂氯仿，猛烈振荡数分钟，静置24 h，取下层液，蒸干，得多甲基黄酮混合物。
装柱：取0.4 g黄酮类化合物提取物溶于少量二氯甲烷。称取一定量200～300 目的硅胶于烧杯中，加入适量石油醚，搅拌，以湿法装柱，装入4×30 层析柱中，柱高15 cm，再加入适量海沙，硅胶和海沙表面均要保持水平，待到石油醚液面到达海沙表面时，缓慢滴加黄酮粗提取物溶液。
洗脱：待该溶液完全流入石油醚后，首先用2 倍柱体积乙酸乙酯-石油醚（35∶65，V/V）溶液进行洗脱，当洗脱液面接近海砂表面时，改用乙酸乙酯-石油醚（40∶60，V/V）溶液进行洗脱，每12 mL收集，标号，依次为1、2、3、4、5……直至接完3 个柱体积洗脱液。
检测：分别将样品瓶中的溶液旋蒸，将得到的固体物质用无水甲醇定容至10 mL，用HPLC进行检测。
1.3.4 5-去甲氧基橘皮素的制备
取20 mg橘皮素于100 mL圆底烧瓶中，加入20 mL浓盐酸-乙醇（20∶80，V/V）溶液，加热回流24 h后进行旋蒸，得到金黄色固体。
将上述固体用50 mL乙酸乙酯-水（1∶1，V/V）溶液溶解，将溶液转移至分液漏斗，静置，溶液分层。取上层溶液，加入20 mL水，振荡分液漏斗，使溶液充分混合，静置，取上层溶液。
将上述溶液旋蒸得到固体物，用无水乙醇溶解并定容至100 mL。
1.3.5 橘皮素对人体肝星状细胞LX-2的抑制
人体肝星状细胞LX-2的培养条件为DMEM培养基，10%～15%的胎牛血清，青链霉素双抗和1 00 nmol/L的胰岛素。将分离得到的橘皮素及改性得到的5-去甲基橘皮素单体溶于DMEM完全培养基，浓度递增模式（对照、0.5、1、5、10、 25、50 μmol/L）作用于96 孔板和6 孔板培养的LX-2细胞。
1.3.6 噻唑蓝（3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT）法检测细胞抑制率
对于96 孔板培养的细胞，以MTT法检测LX-2细胞增殖。具体方法为：1）每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL），继续培养4 h。若药物与MTT反应，可先离心、弃去培养液，用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）小心冲洗2～3 遍后，再加入含MTT的培养液。2）去掉每孔的液体（尽量手法一致，减少结晶的损失），加入150 μL DMSO，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解；在酶标仪490 nm波长处测量各孔的光密度值，细胞抑制率计算公式如下。
2.1 硅胶柱色谱分离多甲氧基黄酮
实验发现第6、7号样品均可以得到保留时间为13.3 min的物质，并且几乎只有单一的峰，用面积归一化法计算发现含量均大于99%。图1为第7号样品的HPLC图，可以看出第7号样品溶液中几乎只有一种物质峰。取该样品进行GC-MS检测，结果见图2，其分子离子峰为372.0，和橘皮素一致，可以证实分离得到的物质为橘皮素。 1H-NMR 数据： 1H-NMR（DMSO-d 6）：δ 8.008（d，J = 9 Hz， 2H， H-2'， H-6'）、7.145（d， J = 9 Hz， 2H， H-3'，H-5'）、6.780（s， 1H， H-3）、4.025 （s， 3H， OCH 3）、3.965（s， 3H， OCH 3）、3.859（s， 3H， OCH 3）、3.840（s，3H， OCH 3）、3.780（s， 3H， OCH 3）。
图1 第7号样品HPLC图Fig.1 HPLC of sample 7
图2 第7号样品GC-MMSS图
Fig.2 GC-MS profile of sample 7
2.2 5-去甲基橘皮素的制备
图3为橘皮素回流反应24 h后的HPLC图，从图中可以看出，保留时间为13.3 min的橘皮素已基本消失，保留时间为20.5 min处出现新的色谱峰，采用面积归一化法得其纯度达99.5%。取该样品同时进行GC-MS和 1H-NMR检测，GC-MS结果如图4所示，其分子离子峰为358.1，和5-去甲基橘皮素一致，证实制备得到的物质为5-去甲基橘皮素。 1H-NMR数据： 1H-NMR（DMSO-d 6）：δ 13.028（s， 1H， 5OH）、8.350（d， J = 9 Hz， 2H， H-2'， H-6'）、7.451（d， J = 9 Hz， 2H， H3'， H5'）、7.287（s， 1H， H-3）、4.310（s， 3H， OCH 3）、4.205（s， 3H， OCH 3）、4.153（s，3H， OCH 3）、4.105（s， 3H， OCH 3）。
图3 5-去甲氧基橘皮素HPLC图
Fig.3 HPLC of 5-demethyltangeretin
图4 5-去甲氧基橘皮素GC-MMSS图
Fig.4 GC-MS profile of 5-demethyltangeretin
2.3 橘皮素及5-去甲氧基橘皮素对人体肝星状细胞LX-2的抑制
图5 橘皮素及5-去甲氧基橘皮素对人体肝星状细胞LX-2的抑制率
Fig.5 Inhibitory effect of tangeretin a nd 5-demethyltangeretin on human hepatic stellate cell LX-2
由图5可知，橘皮素和5去甲基橘皮素均可以剂量梯度递增性抑制LX-2细胞增殖，但是5-去甲基橘皮素在12.5 μmol/L条件下即可接近达到50%的抑制率，而橘皮素需要在近150 μmol/L条件下才能达到50%的抑制率。改性后的橘皮素对人体肝细胞的抑制有效率增加了10 倍以上。图6是橘皮素和5-去甲基橘皮素在25 μmol/L条件下的细胞生长情况图，显微镜下可见5-去甲基橘皮素显著抑制了LX2细胞生长。
图6 橘皮素（a）及5-去甲氧基橘皮素（b）在2255 μmmooll/L的浓度下对人体肝星状细胞LX-2生长的影响
Fig.6 Growth inhibition of tangeretin （a） and 5-demethyltangeretin （b）on human hepatic stellate cell LX-2
以药食两用中药陈皮为原料，通过无水乙醇粗提，氯仿萃取纯化得到多甲基黄酮混合物，用硅胶柱层析，分别以乙酸乙酯-石油醚（35∶65，V/V）溶液及乙酸乙酯-石油醚（40∶60，V/V）溶液进行梯度洗脱，得到纯度大于99%的橘皮素纯品。将橘皮素在浓盐酸-乙醇（20∶80，V/V）溶液中回流反应，得到纯度大于99%的5-去甲氧基橘皮素。改性得到的5-去甲基橘皮素比橘皮素对人体肝星状细胞株LX-2的抑制作用更强，12.5 μmol/L的5-去甲氧基橘皮素抑制率即可达到50%，而橘皮素却需要150 μmol/L。
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Isolation and 5-Demethylation of Tangertin from Chen-Pi and Their Inhibitory Effect on Hepatic Stellate Cell LX-2
XU Lanying
1， ZHAO Hui
2， ZHANG Ting
1， WU Lun
1， LONG Tao
1，*， LI Shiming
1，*
（1. Hubei Key Laboratory for Processing and Application of Catalytic Materials， College of Chemical Technology， Huanggang Normal University， Huanggang 438000， China； 2. Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology， College of Biotechnology and Food Science， Tianjin University of Commerce， Tianjin 300134， China）
Abstract：An efficient and large-scale isolation method for tangeretin from Chen-Pi （aged tangerine peels） has been developed successfully. The transformation of tangeretin to 5-demethyltangeretin was performed in acidified alcohol solution with high conversion efficiency. The structures of both isolated tangeretin and 5-demethyltangeretin were confirmed by MS and 1H NMR. Both compounds exhibited strong inhibitory activity against LX-2 human hepatic stellate cells， with an IC 50of 150 μmol/L for tangeretin and 12.5 μmol/L for 5-demethyltangeretin， indicating the increased potency via the conversion from tangeretin to 5-demethyltangeretin.
Key words：tanger etin； 5-demethyltangeretin； polymethoxyflavones； hepatic stellate cell LX-2
中图分类号：O6.332
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）23-0043-04
doi：10.7506/spkx1002-6630-201523009
收稿日期：2015-06-30
基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（21205046）；湖北省科技厅对外合作项目（2014BHE036）；经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室开放基金项目（2013001603）
作者简介：徐兰英（1978—），女，副教授，博士，研究方向为分离科学。E-mail：xuly@hgnu.edu.cn
*通信作者：龙涛（1979—），男，副教授，博士，研究方向为天然产物化学。E-mail：longtao@hgnu.edu.cn李士明（1963—），男，教授，博士，研究方向为天然产物化学。E-mail：Shiming3702@gmail.com